鄭昌炳 宋 博 鄭 界 仲銀召 張仕宇 段葉輝* 印遇龍**

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，廣州510642；2.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)生理與 代謝過(guò)程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，長(zhǎng)沙410125)

巴馬香豬是原產(chǎn)于廣西巴馬瑤族自治縣的脂肪型豬種，有肉質(zhì)鮮美、性成熟早、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，但生長(zhǎng)速度緩慢、瘦肉率低，加之傳統(tǒng)放養(yǎng)模式，養(yǎng)殖效率低[1]。通過(guò)營(yíng)養(yǎng)調(diào)控提高巴馬香豬的養(yǎng)殖效率，對(duì)生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)豬肉、提高經(jīng)濟(jì)效益有重要意義。β-羥基-β-甲基丁酸(beta-hydroxy-beta-methylbutyrate，HMB)是必需氨基酸亮氨酸的代謝產(chǎn)物，有促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)、減少脂肪沉積的作用，但在體內(nèi)代謝產(chǎn)生的量較少，需通過(guò)飼糧補(bǔ)充才能發(fā)揮作用[2-4]。研究表明，飼糧添加0.62% HMB可顯著降低長(zhǎng)大二元雜交生長(zhǎng)豬的總脂肪重，改善其脂肪代謝，其作用可能由腺苷酸活化蛋白激酶α(adenosine monophosphate activated protein kinase α，AMPKα)-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin,mTOR)信號(hào)通路所介導(dǎo)[5]。然而，HMB在巴馬香豬上的應(yīng)用效果目前鮮見(jiàn)報(bào)道，我們推測(cè)飼糧中添加適量HMB可調(diào)節(jié)巴馬香豬生長(zhǎng)性能和脂肪代謝。本試驗(yàn)通過(guò)在巴馬香豬飼糧中添加不同水平的HMB，研究其對(duì)巴馬香豬生長(zhǎng)性能和肝臟脂肪代謝的影響，并篩選出HMB的最適添加量，為HMB在巴馬香豬上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選擇32頭健康、體重[(8.58±0.21) kg]相近的純種巴馬香豬[閹公豬，(60±2)日齡]，隨機(jī)分為4組(每組8頭豬，分別飼喂添加0(對(duì)照組)、0.13%、0.64%、1.28% HMB[實(shí)際添加物為β-羥基-β-甲基丁酸鈣(beta-hydroxy-beta-methylbutyrate calcium,HMB-Ca]的飼糧。所有飼糧均參照我國(guó)《豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 65—2004)配制而成，飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。飼養(yǎng)試驗(yàn)于2019年9月8日至2019年11月7日在中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所動(dòng)物試驗(yàn)基地開(kāi)展。試驗(yàn)期間，試驗(yàn)豬在漏糞地板式豬床上單欄飼養(yǎng)，自由采食，自由飲水，每日飼喂次(08：00、12:00、18:00)。消毒及免疫程序按照常規(guī)程序進(jìn)行。試驗(yàn)期60 d。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將所有巴馬香豬禁食12 h，自由飲水，然后前腔靜脈采血后屠宰取樣，血液樣品靜置1 h后于4 ℃、3 000 r/min條件下離心10 min分離血清，將血清收集于1.5 mL EP管后-20 ℃保存以供后續(xù)檢測(cè)。采集肝臟樣品，用于肝臟脂肪酸組成和脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)的測(cè)定。

1.3 指標(biāo)測(cè)定及其方法

1.3.1 生長(zhǎng)性能

試驗(yàn)豬分別于試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束當(dāng)天08:00—09:00空腹稱(chēng)重，試驗(yàn)期間記錄采食量，用于計(jì)算平均日增重(average daily gain，ADG)、平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)和料重比(feed/gain，F(xiàn)/G)。

1.3.2 血清脂肪代謝相關(guān)生化指標(biāo)

使用全自動(dòng)血清生化儀(Beckman CX4)檢測(cè)血清中甘油三酯(triglyceride，TG)、膽固醇(cholesterol，CHOL)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)和低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)的含量。

1.3.3 肝臟脂肪酸組成

稱(chēng)取肝臟凍干樣品0.3 g左右，經(jīng)過(guò)苯-石油醚(1∶1，體積比)提取后，經(jīng)氫氧化鉀-甲醇溶液甲酯化30 min，加水分層，取500 mL上層液通過(guò)外標(biāo)-氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)肝臟組織中長(zhǎng)鏈脂肪酸含量，具體操作參照Hu等[6]所述方法進(jìn)行。各類(lèi)脂肪酸含量表示為占總脂肪酸的百分比；基于脂肪酸組成計(jì)算：多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFA)/飽和脂肪酸(saturated fatty acids，SFA)比值、n-6/n-3 PUFA比值。

1.3.4 肝臟脂肪代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)量

采用Trizol試劑盒(Invitrogen公司，美國(guó))從肝臟組織中提取總RNA，經(jīng)紫外可見(jiàn)光光度計(jì)(NanoDrop ND-1000,Thermo Fisher,美國(guó))檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度。取1 000 ng總RNA按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，RR047A)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa，RR820A)檢測(cè)肝臟中脂肪代謝相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量，以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因，檢測(cè)乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)、激素敏感脂酶(hormone-sensitive triglyceride lipase，HSL)、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(fatty acid transport protein-1，F(xiàn)ATP-1)、脂肪酸移位酶(fatty acid translocase，F(xiàn)AT/CD36)、過(guò)氧化物酶增殖體激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα)、肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶-1B(carnitine palmitoyl transferase-1B，CPT-1B)、增強(qiáng)子連接蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein α，C/EBPα)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)的mRNA表達(dá)量，引物序列見(jiàn)表2。具體測(cè)定參照Duan等[3]的方法進(jìn)行。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010進(jìn)行初步處理，用SAS 8.2軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，以P<0.01作為差異極顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 飼糧中添加HMB對(duì)巴馬香豬生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加0.13%HMB顯著增加了巴馬香豬的末重和ADG(P<0.05)；但飼糧中添加HMB對(duì)巴馬香豬的ADFI和F/G無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表3 飼糧中添加HMB對(duì)巴馬香豬生長(zhǎng)性能的影響

2.2 飼糧中添加HMB對(duì)巴馬香豬血清脂肪代謝相關(guān)生化指標(biāo)的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加0.13%HMB顯著增加了血清中HDL含量(P<0.05)；飼糧中添加1.28%HMB顯著增加了血清中CHOL含量(P<0.05)，顯著減少了血清中HDL含量(P<0.05)。此外，血清中LDL含量有隨HMB添加量增加而提高的趨勢(shì)(P=0.08)，但飼糧中添加HMB對(duì)血清中TG含量無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表4 飼糧中添加HMB對(duì)巴馬香豬血清脂肪代謝相關(guān)生化指標(biāo)的影響

2.3 飼糧中添加HMB對(duì)巴馬香豬肝臟脂肪酸組成的影響

由表5可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加0.13%HMB顯著增加了肝臟中n-3 PUFA(33.33%)、二十二烷酸(C22∶0，42.31%)、二十二碳六烯酸(C22∶6n-3，33.33%)含量(P<0.05)，顯著降低了n-6/n-3 PUFA比值(28.31%)和二十碳烯酸(C20∶1，20.00%)、花生四烯酸(C20∶4n-6，12.99%)含量(P<0.05)；飼糧中添加0.64%HMB顯著增加了肝臟中二十碳烯酸(C20∶1，22.85%)、二十二烷酸(C22∶0，26.92%)、二十碳三烯酸(C20∶3n-6，50%)含量(P<0.05)，顯著降低了花生四烯酸(C20∶4n-6，14.76%)含量(P<0.05)；飼糧中添加1.28%HMB顯著增加了二十二烷酸(C22∶0，38.46%)和二十碳三烯酸(C20∶3n-6，67.64%)含量(P<0.05)，顯著降低了十七烷酸(C17∶0，31.88%)和花生四烯酸(C20∶4n-6，12.99%)含量(P<0.05)。

表5 飼糧中添加HMB對(duì)巴馬香豬肝臟脂肪酸組成的影響(占總脂肪酸的百分比)

2.4 飼糧中添加HMB對(duì)巴馬香豬肝臟脂肪代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響

如圖1所示，與對(duì)照組相比，飼糧中添加0.13%HMB顯著提高了肝臟中FAT/CD36和PPARα的mRNA表達(dá)量(P<0.05)；飼糧中添加0.64%HMB顯著降低了肝臟中HSL的mRNA表達(dá)量(P<0.05)；飼糧中添加1.28%HMB顯著降低了肝臟中HSL和FATP1的mRNA表達(dá)量(P<0.05)。

3 討 論

3.1 飼糧中添加HMB對(duì)巴馬香豬生長(zhǎng)性能的影響

添加劑應(yīng)用的前提條件是確保其安全性，大量研究表明HMB的使用是安全的，并且具有改善機(jī)體健康狀況的潛力。據(jù)報(bào)道，動(dòng)物連續(xù)16周攝入8～5 000 mg/(kg·d) HMB未見(jiàn)不良影響[7-8]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，給巴馬香豬分別飼喂含有0.13%、0.64%和1.28% HMB的飼糧60 d，對(duì)生長(zhǎng)性能無(wú)任何負(fù)面影響，且適宜添加量的HMB(0.13%)還可改善生長(zhǎng)性能，與上述試驗(yàn)結(jié)果一致。

3.2 飼糧中添加HMB對(duì)巴馬香豬血清脂肪代謝相關(guān)生化指標(biāo)的影響

血清TG、CHOL、HDL和LDL含量是反映機(jī)體血脂肪代謝的常用指標(biāo)。HDL和LDL是CHOL的運(yùn)輸載體，HDL可將CHOL運(yùn)輸至肝臟使其代謝生成其他物質(zhì)，具有清除血漿多余CHOL的作用，LDL則負(fù)責(zé)將肝臟中CHOL運(yùn)輸至肝外組織，被認(rèn)為是心血管疾病的制動(dòng)劑，兩者共同維持機(jī)體CHOL的穩(wěn)態(tài)[9-10]。血清中高含量的TG和CHOL是心血管疾病的重要風(fēng)險(xiǎn)因素[11-12]。前期研究表明，HMB(1%，質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))可改善高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠的血脂代謝，降低血清中TG和CHOL含量[13]。在長(zhǎng)大二元雜豬上的研究顯示，飼糧中添加0.62%HMB顯著降低了二元雜豬血清LDL含量[14]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在飼糧中添加0.13%HMB顯著提高了巴馬香豬血清中HDL含量，表明飼糧中添加適量HMB后改善了巴馬香豬的血脂代謝。此外，本試驗(yàn)結(jié)果還顯示飼糧中添加1.28%HMB降低了巴馬香豬血清中HDL含量，升高了CHOL含量，推測(cè)飼糧中添加高水平的HMB可通過(guò)在體內(nèi)代謝生成羥甲基戊二酸單酰輔酶A(合成CHOL的前體物質(zhì))而增加血清中CHOL含量[15-16]。這與我們前期的試驗(yàn)結(jié)果[13]一致，前期試驗(yàn)結(jié)果顯示高水平HMB處理對(duì)高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠脂肪代謝并無(wú)改善效果。綜上可知，飼糧中添加HMB可改善巴馬香豬的血脂代謝，其適宜添加量為0.13%，添加高水平HMB并未取得疊加的改善效果；此外，可能存在低于0.13%HMB的更適宜添加量，還需進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。

數(shù)據(jù)柱無(wú)字母或標(biāo)注相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

3.3 飼糧中添加HMB對(duì)巴馬香豬肝臟脂肪酸組成的影響

脂肪酸可分為SFA、單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acids，MUFA)和PUFA，根據(jù)首個(gè)雙鍵距離分子末端甲基位置的不同又可將PUFA分為n-3和n-6 PUFA[17]。n-3 PUFA具有調(diào)節(jié)機(jī)體血脂、抗炎等生理功能，而n-6 PUFA的生理功能則與之相反，具有促炎作用。n-6/n-3 PUFA比值低的膳食被認(rèn)為可預(yù)防心血管疾病、癌癥等疾病[18]。因此，通過(guò)飼糧途徑增加豬肉產(chǎn)品中n-3 PUFA含量并降低n-6 PUFA含量被認(rèn)為是改善豬肉品質(zhì)的一種有效有段[19]。值得注意的是，機(jī)體n-3 PUFA含量并非越高越好，過(guò)量的n-3 PUFA會(huì)導(dǎo)致豬肉過(guò)氧化、生物膜受到損傷等問(wèn)題。因此，提高豬肉產(chǎn)品中n-3 PUFA含量的同時(shí)平衡其n-6/n-3 PUFA比值，對(duì)生產(chǎn)出符合人類(lèi)健康需求的肉制品就顯得非常重要[18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加0.13%HMB顯著提高了肝臟中C22∶6n-3含量，并降低了花生四烯酸含量和n-6/n-3 PUFA比值，這可能是由于飼糧中添加0.13% HMB促進(jìn)了巴馬香豬對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收并促進(jìn)了肝臟從血液中攝取n-3 PUFA。C22∶6n-3是一種n-3 PUFA，可提高血清中HDL含量，降低LDL、TG和CHOL含量，從而降低血液黏度，改善血液循環(huán)，發(fā)揮降脂、抗炎和預(yù)防心血管疾病等作用[19-20]。我們推測(cè)，飼糧中添加HMB可通過(guò)提高巴馬香豬肝臟中C22∶3n-3的含量來(lái)增加血清中HDL的含量，從而減少機(jī)體CHOL的含量，進(jìn)而改善機(jī)體脂肪代謝。此外，在禁食情況下，機(jī)體會(huì)動(dòng)員肌肉和脂肪組織中的TG，運(yùn)輸至肝臟分解為脂肪酸為機(jī)體供能[21]，因此，肝臟中脂肪酸的組成情況可在一定程度上反映豬肉中脂肪酸的組成情況。綜上可知，飼糧中添加HMB可通過(guò)提高n-3 PUFA含量和降低n-6/n-3 PUFA比值來(lái)改善豬肉品質(zhì)，且其添加量為0.13%時(shí)效果最佳。此外，可能存在低于0.13%HMB的更適宜添加量，還需進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。

3.4 飼糧中添加HMB對(duì)巴馬香豬肝臟脂肪代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響

肝臟是豬脂肪代謝的主要場(chǎng)所之一，ACC、HSL、FAT/CD36、FATP1、PPARα等是參與脂肪代謝的關(guān)鍵酶。其中，ACC和HSL分別是脂肪酸合成與分解的關(guān)鍵限速酶[22-23]；FAT/CD36是將脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)載體[24]，其表達(dá)量升高暗示肝臟從血液中攝取的脂肪酸增多；FATP1是一種對(duì)胰島素敏感的長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體[25]，其表達(dá)量降低說(shuō)明轉(zhuǎn)運(yùn)入肝臟中的脂肪酸減少；轉(zhuǎn)錄因子PPARα是肝臟脂質(zhì)代謝的主要調(diào)節(jié)因子，其激活可促進(jìn)肝臟脂肪酸的攝取、利用和分解代謝[26]，亦可促進(jìn)HDL和C22∶6n-3的生成[27-28]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼糧中添加0.13%HMB可增加巴馬香豬肝臟中FAT/CD36和PPARα的mRNA表達(dá)量，而添加1.28%HMB則能降低肝臟中HSL和FATP1的mRNA表達(dá)量。因此，本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加0.13%HMB可促進(jìn)肝臟從血液中攝取脂肪酸，通過(guò)PPARα促進(jìn)C22∶6n-3的生成，進(jìn)而提高血液中HDL含量，改善機(jī)體脂肪代謝，而添加1.28%HMB則促進(jìn)了肝臟脂肪酸合成并抑制了脂肪酸分解。

4 結(jié) 論

① 在巴馬香豬飼糧中添加HMB可改善其生長(zhǎng)性能，并可提高肝臟中C22∶6n-3含量，改善肝臟脂肪代謝，其適宜添加量為0.13%。

② HMB改善巴馬香豬肝臟脂肪代謝的機(jī)制可能與PPARα信號(hào)通路相關(guān)。