饒澤斌 曾 艷 劉宇波 胡 萍 胡 紅 唐志如*

(1.西南大學動物科學技術學院，動物營養(yǎng)與生物飼料實驗室，重慶400715； 2.湖南省微生物研究院，長沙410000)

仔豬斷奶后，其腸道和免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟以及飼糧性質突然變化，這引起仔豬斷奶綜合征[1]，仔豬的生長性能和免疫機能下降通常與斷奶應激密切相關。通過在飼糧中添加抗生素可緩解仔豬斷奶綜合征，但是隨著飼料中抗生素添加劑的禁用，乳酸菌成為一種飼用抗生素替代品。乳酸菌是一類被廣泛應用于生產生活中的益生菌，其安全性已得到充分的檢驗[2]。干酪乳桿菌作為乳酸菌的一種，其對機體的防御機制具有耐受能力，口服后能在消化道中大量存活，能夠提高宿主的生長性能[3]。Yulianto等[4]在肉雞飼糧中添加0.5%的干酪乳桿菌WB 315(活菌數(shù)1.2×109CFU/mL)，發(fā)現(xiàn)其能顯著提高肉雞的平均日采食量和飼料效率，同時顯著降低料重比。這是因為干酪乳桿菌的降膽固醇生理特性，改善了機體的飼料轉化率，增加了飼糧采食量[5]。另外，研究發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌可以增強機體的抗氧化功能。劉宏宇等[6]在體外研究中發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌的菌體和無菌體的提取物對體外的自由基具有清理功能，并且其能耐受消化道中的胃酸和膽鹽。陳燕等[7]研究發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌通過下調促炎因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)和白細胞介素-6(IL-6)的表達，上調炎癥抑制因子白細胞介素-10(IL-10)的表達，同時上調腸道緊密連接蛋白-1(ZO-1)、閉合蛋白3(claudin 3)以及黏蛋白2(MUC2)等相關基因的表達，增強腸道屏障功能，改善小鼠的結腸炎。上述研究證實了在抗生素禁用后，飼糧中添加干酪乳桿菌能夠促進動物生長性能的提高。在參考Li等[8]的試驗結果以及考慮到乳桿菌對消化液的耐受程度[9]，本試驗通過研究飼糧添加干酪乳桿菌代田株(Lactobacilluscaseistrain Shirota)對斷奶仔豬生長性能、抗氧化功能和結腸生物胺的影響，為干酪乳桿菌代田株替代抗生素成為新型飼料添加劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

采用單因素完全隨機設計，將30頭平均體重為(9.21±0.57) kg的28日齡“杜×長×大”斷奶仔豬(公母各占1/2)，平均分為3個組，每組10個重復，每個重復1頭豬。對照組飼喂基礎飼糧，抗生素組飼喂基礎飼糧+100 mg/kg硫酸黏桿菌素(購自某動物藥業(yè)有限公司，純度99%)，干酪乳桿菌組飼喂基礎飼糧+每天口服用瓊脂塊包埋的5×109CFU干酪乳桿菌代田株(購買于安徽某科技生物有限公司，純度99%)。試驗在西南大學養(yǎng)殖場進行，預試期4 d，正試期28 d。在正試期的第1天08：00對仔豬進行空腹稱重并記錄初重和分組，正試期第28天08：00空腹稱重記錄末重。

1.2 試驗飼糧和飼養(yǎng)管理

試驗飼糧參照NRC(2012)標準進行配制，基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗動物單頭單圈飼養(yǎng)，豬舍的溫度維持在(25±2) ℃。每日將干酪乳桿菌代田株與粉狀基礎飼糧混合，分別在08：00、12：00和18：00固定投喂3次，自由采食與飲水。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)

1.3 樣品采集和處理

試驗第28天，每個組隨機選擇4頭體重與平均值相近的仔豬進行空腹采血，采集10 mL血液置于含有肝素鈉的抗凝采血管，在4 ℃、4 000 r/min條件下離心20 min分離得到血漿，立即保存于-20 ℃冰箱中，用于檢測血漿生化和抗氧化指標。采用頸動脈放血法處死采完血的豬只，然后打開胸腔、腹腔，取出內臟。采集肝臟樣品檢測其生化和抗氧化指標；對胸腺、胰腺和脾臟等內臟器官進行稱重并記錄它們的重量；對豬的空腸、回腸和結腸的中段進行結扎，用生理鹽水洗去內容物然后采集3 cm左右的腸段，保存于組織固定液中，用于后續(xù)腸道黏膜組織形態(tài)的測定；用10 mL的無菌離心管收集結腸內容物，經液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)檢測仔豬結腸生物胺含量；使用便攜式pH計測量每段腸管中部和胃內容物的pH。

1.4 指標檢測

1.4.1 生長性能和免疫器官指數(shù)

生長性能的指標為平均日增重、平均日采食量和料重比，計算公式如下：

平均日增重(g/d)=正試期增重(g)/ 正試期天數(shù)(d)； 平均日采食量(g/d)=正試期采食量(g)/ 正試期天數(shù)(d)； 料重比=正試期飼糧總消耗量/正試期總增重。

免疫器官指數(shù)包括脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和胰腺指數(shù)，其計算公式如下：

某免疫器官指數(shù)(g/kg)=該免疫器官鮮重(g)/ 豬活體重(kg)。

1.4.2 血漿和肝臟生化和抗氧化指標

血漿和肝臟生化和抗氧化指標包括總抗氧化能力(T-AOC)以及總超氧化物歧化酶(T-SOD)、一氧化氮合酶(NOS)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽還原酶(GR)、谷丙轉氨酶(GPT)和谷草轉氨酶(GOT)活性。上述指標按照南京建成生物工程研究所試劑盒中的說明書進行測定。

1.4.3 腸道黏膜組織形態(tài)

形態(tài)學測定方法參照Wang等[10]進行，操作如下：將組織固定液中的腸道取出，經純水清洗后，使用乙醇對其脫水，然后使用二甲苯透明組織，最后使用石蠟對其進行包埋，將包埋后的腸道組織切成5 μm厚的切片，通過蘇木精-伊紅(HE)法染色后，使用顯微鏡觀察并拍照。腸道的絨毛高度和隱窩深度等指標使用OPT Pro圖像處理軟件進行測定，讀片采用雙盲法，在每個切片中讀取5個視野。測量從絨毛頂端至隱窩開口處的垂直長度記錄為絨毛高度，測量從隱窩開口到隱窩基部的垂直長度記錄為隱窩深度，并計算絨毛高度/隱窩深度(V/C)值。

1.4.4 結腸內容物生物胺含量

采用高效液相色譜法結合紫外檢測器法測定仔豬結腸內容物中生物胺的含量[11]。方法如下：用0.4 mol/L高氯酸溶液在-20 ℃下處理仔豬結腸內容物過夜。離心收集上清液，然后使用丹磺酰氯(DNS-Cl)對其進行衍生。分析柱采用Zorbax SB-C18柱，流動相為乙腈和0.02 mol/L醋酸銨水溶液，流速為1.0 mL/min，梯度洗脫。采用保留時間和紫外光譜進行定性分析，定量檢測波長為254 nm。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)首先采用Excel 2013進行初步處理，然后用SPSS 26.0軟件包進行單因素方差分析和Duncan氏多重比較，P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著，結果以平均值和均值標準誤(SEM)表示。

2 結果與分析

2.1 飼糧添加干酪乳桿菌代田株對斷奶仔豬生長性能的影響

由表2可知，3個組斷奶仔豬初重差異不顯著(P>0.05)；干酪乳桿菌組斷奶仔豬末重顯著高于對照組(P<0.05)，較對照組提高了14.14%，但與抗生素組差異不顯著(P>0.05)。干酪乳桿菌組斷奶仔豬平均日增重和平均日采食量較對照組極顯著提高(P<0.01)，但與抗生素組差異不顯著(P>0.05)。干酪乳桿菌組斷奶仔豬料重比較對照組降低了2.37%，但差異不顯著(P>0.05)。

表2 飼糧添加干酪乳桿菌代田株對斷奶仔豬生長性能的影響

2.2 飼糧添加干酪乳桿菌代田株對斷奶仔豬免疫器官指數(shù)的影響

由表3可知，各組斷奶仔豬脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和胰腺指數(shù)之間均無顯著差異(P>0.05)。

表3 飼糧添加干酪乳桿菌代田株對斷奶仔豬免疫器官指數(shù)的影響

2.3 飼糧添加干酪乳桿菌代田株對斷奶仔豬血漿和肝臟生化指標的影響

由表4可知，與對照組相比，干酪乳桿菌組斷奶仔豬血漿GOT和GPT活性極顯著降低(P<0.01)，肝臟GOT活性顯著提高(P<0.05)。與抗生素組相比，干酪乳桿菌組斷奶仔豬血漿GOT活性極顯著降低(P<0.01)，血漿GPT活性無顯著差異(P>0.05)；另外，干酪乳桿菌組斷奶仔豬肝臟GOT活性顯著提高(P<0.05)，肝臟GPT活性有所升高，但差異不顯著(P>0.05)。

表4 飼糧添加干酪乳桿菌代田株對斷奶仔豬血漿和肝臟生化指標的影響

2.4 飼糧添加干酪乳桿菌代田株對斷奶仔豬血漿和肝臟抗氧化指標的影響

由表5可知，與對照組相比，干酪乳桿菌組斷奶仔豬血漿T-AOC以及T-SOD、NOS和GSH-Px活性極顯著提高(P<0.01)，血漿CAT和GR活性無顯著差異(P>0.05)；與抗生素組相比，干酪乳桿菌組斷奶仔豬血漿CAT和NOS活性極顯著提高(P<0.01)，血漿T-AOC及T-SOD和GR活性差異不顯著(P>0.05)，血漿GSH-Px活性極顯著降低(P<0.01)。

表5 飼糧添加干酪乳桿菌代田株對斷奶仔豬血漿和肝臟抗氧化指標的影響

各組斷奶仔豬肝臟T-AOC及T-SOD活性之間無顯著差異(P>0.05)，干酪乳桿菌組肝臟CAT和NOS活性極顯著高于抗生素組(P<0.01)，但對照組肝臟GR活性顯著高于抗生素組和干酪乳桿菌組(P<0.05)，抗生素組和干酪乳桿菌組間肝臟GR活性無顯著差異(P>0.05)。

2.5 飼糧添加干酪乳桿菌代田株對斷奶仔豬腸道黏膜組織形態(tài)的影響

由圖1可知，飼糧添加干酪乳桿菌代田株對斷奶仔豬空腸、回腸和結腸的黏膜組織形態(tài)存在一定的影響，與對照組相比，干酪乳桿菌組斷奶仔豬空腸、回腸和結腸中的絨毛排列整齊無斷裂，絨毛頂端輪廓清晰。

圖1 飼糧添加干酪乳桿菌代田株對斷奶仔豬腸道黏膜組織形態(tài)的影響

由表6可知，各組斷奶仔豬空腸絨毛高度、隱窩深度、V/C值和淋巴細胞數(shù)量之間差異均不顯著(P>0.05)，干酪乳桿菌組空腸杯狀細胞數(shù)量顯著高于對照組和抗生素組(P<0.05)；各組斷奶仔豬回腸絨毛高度、隱窩深度、V/C值、杯狀細胞數(shù)量和淋巴細胞數(shù)量之間差異均不顯著(P>0.05)；同樣，各組斷奶仔豬結腸絨毛高度、隱窩深度、V/C值、杯狀細胞數(shù)量和淋巴細胞數(shù)量之間差異均不顯著(P>0.05)。

表6 飼糧添加干酪乳桿菌代田株對斷奶仔豬腸道黏膜組織形態(tài)的影響

2.6 飼糧添加干酪乳桿菌代田株對斷奶仔豬胃腸道內容物pH的影響

由表7可知，各組斷奶仔豬胃、空腸、回腸和盲腸內容物pH無顯著差異(P>0.05)，表明飼糧添加抗生素或干酪乳桿菌代田株對斷奶仔豬胃腸道內容物pH均無顯著影響。

表7 飼糧添加干酪乳桿菌代田株對斷奶仔豬胃腸道內容物pH的影響

2.7 飼糧添加干酪乳桿菌代田株對斷奶仔豬結腸內容物生物胺含量的影響

由表8可知，與對照組相比，飼糧添加抗生素或干酪乳桿菌代田株均能極顯著降低斷奶仔豬結腸內容物色胺、甲胺、組胺、尸胺及腐胺含量(P<0.01)；與抗生素組相比，干酪乳桿菌組斷奶仔豬結腸內容物組胺含量極顯著降低(P<0.01)，但是色胺和腐胺含量極顯著提高(P<0.01)。

表8 飼糧添加干酪乳桿菌代田株對斷奶仔豬結腸內容物生物胺含量的影響

3 討 論

3.1 飼糧添加干酪乳桿菌代田株對斷奶仔豬生長性能和免疫器官指數(shù)的影響

斷奶對于仔豬是一種應激，會導致生長速度降低、腹瀉、腸道菌群失調以及健康狀況受損等不利于生長的情況[12]。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加熱滅活的植物乳桿菌能顯著提高吉富羅非魚腸道中淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等消化酶的活性[13]；飼糧添加復合微生態(tài)制劑(含乳酸菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌和雙歧桿菌等)能顯著提高斷奶仔豬對粗蛋白質、粗纖維和粗脂肪的表觀消化率[14]；Liu等[15]在斷奶仔豬飼糧中添加干酪乳桿菌發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬平均日增重提高了18%～27%。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，干酪乳桿菌組斷奶仔豬末重、平均日增重和平均日采食量顯著提高，而料重比無顯著差異，這可能是因為干酪乳桿菌代田株提高了斷奶仔豬腸道中消化酶的活性，使得飼糧中營養(yǎng)物質的利用率提高，從而改善了仔豬的生長性能。同時，本試驗發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌代田株能提高斷奶仔豬機體的抗氧化功能，這可能是導致生長性能提高的另一個因素。

免疫器官指數(shù)是評價機體免疫力的一項重要指標，本研究中干酪乳桿菌代田株對斷奶仔豬的免疫器官指數(shù)的影響不顯著。脾臟和胸腺是機體重要的淋巴器官，參與機體的體液免疫和細胞免疫。Xu等[16]研究指出，干酪乳桿菌ATCC 393能通過Toll樣受體信號通路阻止由產腸毒素大腸桿菌K88引起的腸屏障功能障礙，從而增強腸道的屏障功能。Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌Zhang能夠增強早期斷奶仔豬腸道緊密連接蛋白-1和閉鎖蛋白的表達，從而維持腸黏膜屏障的完整性。因此，在本研究中，干酪乳桿菌代田株可能增強了斷奶仔豬的腸道屏障功能，從而減少了炎癥的發(fā)生；也有可能是由于本試驗持續(xù)時間過長，乳酸菌作用效果逐漸減弱，所以對免疫器官指數(shù)的影響不顯著。

3.2 飼糧添加干酪乳桿菌代田株對斷奶仔豬血漿和肝臟生化和抗氧化指標的影響

GOT與GPT是一類胞內酶，在肝臟細胞中大量分布，一般在血漿中活性極低，但是在細胞受到損傷時血漿中GOT和GPT的活性會升高，因此是檢驗肝臟功能的重要指標[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌組斷奶仔豬血漿GOT和GPT活性極顯著低于對照組，楊慧等[19]研究發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬飼糧添加0.1%的乳酸菌顯著降低了仔豬血漿中GOT和GPT的活性，這與本研究結果一致，說明飼糧添加乳酸菌能夠預防肝臟損傷。此外，GOT和GPT是參與氨基酸代謝轉化的酶，本試驗發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌組斷奶仔豬肝臟中GOT活性較對照組和抗生素組顯著升高，GPT活性有升高的趨勢，結合血漿中GPT和GOT的活性顯著低于對照組，說明肝臟并沒有發(fā)生損傷，這表明肝臟對于氨基酸的利用增加，肝功能得到改善，從而促進了仔豬的生長。

正常情況下，機體內存在少量的自由基，起著重要的生理作用，如信號轉導和基因表達[20]。仔豬斷奶后體內的活性氧會增加導致氧化應激[21]，體內活性氧累積過多不能被機體內的抗氧化酶分解，進而引起疾病。動物機體的抗氧化功能主要通過抗氧化酶系統(tǒng)(NOS、GSH-Px、T-SOD、CAT和GR等)得到體現(xiàn)[22]。Wang等[23]在研究敵草快引起的仔豬氧化應激時發(fā)現(xiàn)，氧化應激會導致仔豬平均日增重和平均日采食量顯著下降，降低仔豬生長性能。本試驗中，干酪乳桿菌組斷奶仔豬血漿GOT和GPT活性顯著低于對照組，可以證實干酪乳桿菌代田株能夠增強肝臟的抗氧化能力。Li等[8]研究發(fā)現(xiàn)，仔豬在哺乳期口服德氏乳桿菌能增加其抗氧化功能并且效果能一直延續(xù)至斷奶4周后。Lin等[24]在研究氧化油誘導的小鼠肝損傷模型中發(fā)現(xiàn)，乳酸菌能減少脂質的過氧化，恢復抗氧化酶的活性，減少肝臟的損傷。Finamore等[25]發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌代田株能促進腸上皮細胞核因子E2相關因子2(Nrf2)的表達以及抑制Nrf2和p65的磷酸化，降低細胞內活性氧的水平，激活細胞內的Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1(Keap1)-Nrf2/抗氧化反應元件(ARE)信號通路，同時抑制核因子-κB(NF-κB)信號通路的激活，從而提高抗氧化功能以及緩解氧化損傷。Kobatake等[26]研究發(fā)現(xiàn)，熱滅活的加氏乳桿菌能通過誘導Nrf2核易位進入細胞核激活Nrf2-ARE信號通路。Nrf2進入細胞核后能與ARE序列結合，從而啟動抗氧化劑和細胞保護性基因的轉錄[27]。多項研究表明，植物乳桿菌能通過激活Nrf2信號上調下游的抗氧化酶，如CAT、SOD和GSH-Px的表達[28-29]。Chen等[30]在研究德氏乳桿菌對斷奶仔豬抗氧化功能的研究中發(fā)現(xiàn)，德氏乳桿菌能顯著提高血漿GSH-Px活性和T-AOC。Chang等[31]研究發(fā)現(xiàn)，CAT能觸發(fā)Nrf2的核易位，然后激活Nrf2信號通路促進下游抗氧化基因的表達。在本研究中，干酪乳桿菌代田株或抗生素顯著提高了斷奶仔豬血漿T-AOC及T-SOD、NOS、GR和GSH-Px活性，顯著提高了肝臟NOS和GR活性，其機理在于干酪乳桿菌代田株通過激活Nrf2信號通路，促進下游的抗氧化酶，如GSH-Px、NOS和GR的表達，從而減少仔豬氧化應激，進而提高生長性能。

3.3 飼糧添加干酪乳桿菌代田株對斷奶仔豬腸道黏膜組織形態(tài)的影響

斷奶應激會導致仔豬小腸結構和功能出現(xiàn)變化，導致腸道杯狀細胞數(shù)量減少[32]。杯狀細胞能合成并分泌黏蛋白，從而增強腸道屏障功能，保護腸道；杯狀細胞的減少會減少黏蛋白的分泌，導致腸道結構損傷。研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌RC007發(fā)酵乳清可以增加小鼠腸道杯狀細胞的數(shù)量[33]。本試驗中，與對照組相比，飼糧添加抗生素或干酪乳桿菌代田株對斷奶仔豬腸道黏膜組織形態(tài)的影響不顯著，干酪乳桿菌組空腸杯狀細胞數(shù)量顯著增加。杯狀細胞在維持胃腸道屏障完整性發(fā)揮巨大作用，其分泌的黏蛋白組成了腸道先天免疫屏障[34]。王譽穎等[35]研究發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌能增加腹瀉大鼠回腸杯狀細胞數(shù)量，促進黏蛋白2的合成，維持腹瀉大鼠的腸道健康。本試驗中，飼糧添加干酪乳酸菌代田株對斷奶仔豬空腸、回腸和結腸的絨毛高度、隱窩深度和V/C值均無顯著影響；同時，飼糧添加干酪乳酸菌代田株對胃、空腸、回腸和盲腸內容物pH也均不顯著影響，且各腸段內容物pH在數(shù)值上都處于偏酸性，這有利于腸道中消化酶發(fā)揮正?；钚?，促進機體對營養(yǎng)物質的吸收利用。

3.4 飼糧添加干酪乳桿菌代田株對斷奶仔豬結腸內容物生物胺含量的影響

生物胺是一些游離氨基酸通過微生物的脫羧作用或醛和酮的胺化和轉氨作用而形成的低分子量有機堿性化合物，包括一元胺、二胺和多胺[36]。精氨酸在宿主體內被腸道微生物利用轉化為腐胺、亞精胺等多胺[37]，其能影響腸黏膜和各種免疫功能。多胺對于細胞基因表達和細胞增殖有調控作用，因此需要嚴格控制細胞中多胺的含量[38]。在結腸癌中，多胺是腫瘤生長的標志物，也是結腸癌化學預防的靶標[39]。精胺和組胺能抑制炎性小體NOD樣受體家族含pyrin結構域蛋白6(NLRP6)的活化，并減少白細胞介素-18(IL-18)的分泌，破壞腸道黏膜屏障功能[39]。Guarcello等[35]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌在體外能夠合成多銅氧化酶分解生物胺。Herrero-Fresno等[41]研究發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌EML 1116編碼生物胺降解酶的基因在質粒上。Linsalata等[41]研究發(fā)現(xiàn)，口服短乳桿菌能降低幽門螺桿菌陽性消化不良患者胃中幽門螺桿菌的數(shù)量，并且降低胃鳥氨酸脫羧酶活性以及降低胃中的多胺含量。本試驗中，與對照組相比，飼糧添加干酪乳桿菌代田株極顯著降低了斷奶仔豬結腸內容物色胺、甲胺、組胺、尸胺和腐胺含量，這說明干酪乳桿菌代田株對結腸中的生物胺起到了降解作用，從而維持了腸道黏膜屏障功能的完整性，促進機體的健康。

4 結 論

飼糧添加干酪乳桿菌代田株能夠提高斷奶仔豬生長性能和抗氧化功能，降低結腸內容物生物胺含量，具有替代抗生素的功效。