余詩強(qiáng) 蔣林樹* 熊本海

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營(yíng)養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193)

黃芩素(baicalein，BAI)也稱為黃芩黃素、黃芩苷元，主要來源于唇形科植物黃芩(Scutellariabaicalensis)，是一種以黃酮類化合物為主效因子的植物提取物，具有抗菌、抗炎、抗氧化應(yīng)激等作用[1-3]。BAI在黃芩中含量豐富，一般黃芩藥材中BAI的含量在0.1%～1.5%，優(yōu)質(zhì)黃芩中BAI的含量可達(dá)到3.89%[4]。隨著我國(guó)飼料端禁用抗生素以及對(duì)綠色健康養(yǎng)殖技術(shù)研究的不斷深入，對(duì)天然植物中生物活性物質(zhì)的研究和應(yīng)用成為健康營(yíng)養(yǎng)技術(shù)策略的核心環(huán)節(jié)[5]。近年來，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和分析技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了天然植物中生物活性物質(zhì)作用途徑與機(jī)制的研究[6]。本文通過解析BAI結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能的關(guān)系，深入分析BAI的抗菌與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)途徑與機(jī)制，以期為BAI在動(dòng)物生產(chǎn)中的研究與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 BAI的理化性質(zhì)與代謝

BAI是從黃芩的干燥根中提取出的主要有效成分，化學(xué)名稱為5，6，7-三羥基黃酮，其性狀為黃色針狀結(jié)晶，分子式為C15H10O5，相對(duì)分子質(zhì)量為270.24，易溶于丙酮、醇溶液、醋酸乙酯等，微溶于氯仿[7]，結(jié)構(gòu)式如圖1所示。常見BAI提取方法包括酸水解法、浸漬法、超聲波提取法和酶解法等[8]。研究表明，利用酶解法，以水為提取溶劑，借助于提取原料中不同物質(zhì)的粒度和溶解度之差，提取總物質(zhì)中BAI含量可達(dá)到63%以上[9]。張濤等[10]探究發(fā)現(xiàn)，在料液比1∶22、酶料比2∶1的條件下，酶提6 h、50 ℃超聲處理20 min，BAI的提取率可達(dá)到23.122 mg/g。

圖1 黃芩素的結(jié)構(gòu)式

BAI呈弱酸性，進(jìn)入體內(nèi)后非離子狀態(tài)不會(huì)被破壞，同時(shí)對(duì)胃黏膜具有良好的親和力，大部分可以被其吸收[11]。BAI主要經(jīng)肝臟代謝，少部分經(jīng)腸道代謝[12]。在體外肝勻漿孵育液中進(jìn)行的代謝試驗(yàn)證明，BAI的代謝途徑為脫水、羥基化、脫羥基化、糖基化、葡萄糖醛酸化和甲基化[13]，其產(chǎn)生的已知8種代謝產(chǎn)物見圖2[14]。由于BAI分子具有較大的疏水性，故其以被動(dòng)擴(kuò)散的方式進(jìn)入小腸壁上皮細(xì)胞[15]。進(jìn)入腸道后，由腸壁上皮細(xì)胞中存在的甲基化酶、葡萄糖醛化酶和硫酸化酶等多種代謝酶作用下進(jìn)行代謝，同時(shí)BAI進(jìn)入小腸壁上皮細(xì)胞后，可經(jīng)尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT)作用轉(zhuǎn)化為黃芩苷，黃芩苷經(jīng)多藥耐藥相關(guān)蛋白3(MRP3)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入血液，經(jīng)腸系膜靜脈進(jìn)入肝臟被進(jìn)一步代謝，其代謝物經(jīng)血液運(yùn)輸全身[16]。GO功能富集分析結(jié)果顯示，BAI在體內(nèi)的作用靶點(diǎn)主要分布在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等部位，其與金屬離子、陽離子結(jié)合可以發(fā)揮催化氧化還原酶活性功能，同時(shí)參與細(xì)胞脂質(zhì)、羧酸、有機(jī)酸代謝和脂肪酸合成等過程[17]。研究顯示BAI進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后有35%轉(zhuǎn)化為黃芩苷，BAI與黃芩苷具有協(xié)同作用，兩者可以在體內(nèi)共同發(fā)揮抗炎、抗氧化等生物學(xué)功能，由于BAI在體內(nèi)親脂性高，故其在體內(nèi)廣泛分布并發(fā)揮作用[18]。

2 BAI結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能的關(guān)系

2.1 抗菌作用

細(xì)菌β-葡萄糖醛酸苷酶(EcGUS)在多種內(nèi)源性和藥物性葡萄糖醛酸苷的解偶聯(lián)中起關(guān)鍵作用，進(jìn)而調(diào)控細(xì)菌的生長(zhǎng)[19]，BAI結(jié)構(gòu)中的羥基可與EcGUS活性位點(diǎn)結(jié)合形成氫鍵發(fā)揮抑菌作用，同時(shí)分子中的羥基可抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子產(chǎn)生，達(dá)到抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的目的[20]。研究證明，BAI可通過提高細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性、破壞細(xì)胞壁完整性、降低菌體酶活性、抑制細(xì)菌體內(nèi)能量生成和核苷酸合成，達(dá)到降低金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、白色念球菌(Candidaalbicans)等細(xì)菌的致病能力[21-23]。Chen等[24]研究發(fā)現(xiàn)，BAI可以阻止細(xì)菌生物膜的形成并破壞生物膜，減少葡萄球菌腸毒素A和α-溶血素的產(chǎn)生，達(dá)到抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)繁殖，并抑制群體感應(yīng)系統(tǒng)。BAI是控制食源性病原體的潛在抗菌劑，其可以抑制腸出血性大腸桿菌產(chǎn)生志賀毒素Stx1和Stx2，減少細(xì)胞毒性，保護(hù)機(jī)體健康[1]。同樣，80 mg/L BAI可以顯著抑制大腸桿菌生物膜的形成，通過在大腸桿菌生物膜合成前干擾多糖細(xì)胞間黏附素(PIA)的合成起到抑菌作用[25]。

BAI對(duì)引起動(dòng)物乳房炎的病原菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有明顯的抑制作用[26]，特別是金黃色葡萄球菌，其可以抑制金黃色葡萄球菌生物膜的生成，阻礙其生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)可以抑制菌株合成PIA，減少其胞外DNA(eDNA)的釋放，0.04 mg/mL BAI作用于金黃色葡萄球菌時(shí)eDNA的釋放量減少97%，相關(guān)基因icaA表達(dá)量減少62%，cidA表達(dá)量減少41%，顯著抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成，達(dá)到抑菌目的[27]。薛芳翰等[28]探究了BAI對(duì)鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)的抑制作用，結(jié)果表明，BAI能夠極顯著抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，且對(duì)細(xì)菌的最小抑制濃度(MIC)為0.04 mmol/L，當(dāng)濃度達(dá)到0.08 mmol/L時(shí)具有殺菌效果。采用指紋圖譜結(jié)合灰度分析對(duì)黃芩中活性成分對(duì)白色念球菌的抑制效果作進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)黃芩中有17種活性成分對(duì)白色念球菌具有抑制作用，其中BAI抑制活性更明顯，關(guān)聯(lián)度達(dá)0.798 6，是發(fā)揮作用的標(biāo)志物[29]。16 μg/mL的BAI與環(huán)丙沙星協(xié)同作用時(shí)，可降低BAI和環(huán)丙沙星的MIC并提高對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抑制作用[30]。同時(shí)，BAI可以平衡腸道菌群結(jié)構(gòu)，給小鼠前腹腔注射100 mg/kg的BAI可以治療電離輻射引起的腸道菌群失衡疾病[31]。另外，張濤等[10]研究發(fā)現(xiàn)，加入10 mg/mL的BAI溶液時(shí)，金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)被抑制，加入濃度超過20 mg/mL的BAI溶液時(shí)，大腸桿菌的生長(zhǎng)被抑制。此外，黃芩素對(duì)金黃色葡萄球菌感染引起的皮膚炎癥小鼠具有顯著的治療作用，血液可通過吸收黃芩素，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的宿主防御功能，通過免疫調(diào)節(jié)來提高細(xì)菌清除率，從而減輕金黃色葡萄球菌引起的炎癥，其作用效果與抗生素有類似之處[32]。

2.2 抗炎作用

BAI可以抑制炎性介質(zhì)的釋放并調(diào)節(jié)信號(hào)通路，從而達(dá)到抗炎作用，其可以與核因子-κB(NF-κB)抑制蛋白激酶(IKK)的亞基IKKβ(NF-κB信號(hào)通路經(jīng)中的上游靶點(diǎn)之一)相結(jié)合抑制NF-κB信號(hào)通路[33]。研究證明，濃度為100 μmol/L的黃芩素能顯著抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞(RAW 264.7)釋放炎癥介質(zhì)[前列腺素E2(PGE2)、一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)]，發(fā)揮抗炎作用[34-35]。Duan等[36]證明100～200 mg/kg的BAI能顯著抑制血清中NO、IL-6、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和TNF-α的釋放，從而抑制炎癥發(fā)生。同時(shí)，BAI在S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的存在下，經(jīng)兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)轉(zhuǎn)化為中間代謝產(chǎn)物木蝴蝶素A(oroxylin A)，木蝴蝶素A有顯著的抗炎作用[半抑制濃度(IC50)=28 μmol/L][37]。Zhou等[38]證明木蝴蝶素A可以抑制體內(nèi)IL-1β、IL-6、TNF-α的產(chǎn)生及NOD樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體的活化，從而達(dá)到抗炎的目的。由于黃芩素在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為黃芩苷，黃芩苷結(jié)構(gòu)中Δ2平面的雙鍵結(jié)構(gòu)在抗炎反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，其可以作用于環(huán)氧化酶起到抗炎效果，同時(shí)其結(jié)構(gòu)中的自由酚羥基和羰基也具有一定的抗炎作用[39]。研究證明，黃芩苷可以通過抑制炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、白細(xì)胞介素-17(IL-17)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9) 的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路等方式發(fā)揮抗炎作用[40]。

M1(BGG)：黃芩素6,7-二-O-葡萄糖醛酸苷 baicalein6,7-di-O-glucuronide；M2(BGGlu)：6-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖醛酸苷 baicalein6-O-glucoside-7-O-glucuronide；M3(7BG)：黃芩素7-O-葡萄糖醛酸苷 baicalein7-O-glucuronide；M4(6BG)：黃芩素6-O-葡萄糖醛酸苷 baicalein6-O-glucuronide；M5(7BS)：黃芩素7-O-硫酸酯苷 6-O-glucoside-baicalein-7-O-sulfate；M6(6BS)：黃芩素6-O-硫酸酯苷 7-O-glucoside-baicalein-6-O-sulfate；M7(6-MEBG)：黃芩素6-OCH3-7-O葡萄糖醛酸 6-methoxybaicalein7-O-glucuronide；M8(7-MEBG)：黃芩素7-OCH3-6-O葡萄糖醛酸7-methoxybaicalein6-O-glucuronide。

研究發(fā)現(xiàn)，以2 mL/kg的劑量給大鼠靜脈注射濃度為10 g/L的BAI時(shí)，結(jié)果顯示BAI能減弱重癥急性胰腺炎(SAP)大鼠的炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)制與調(diào)控細(xì)胞炎癥的p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路有關(guān)，通過上調(diào)抗凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)和下調(diào)促凋亡蛋白Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)的表達(dá)達(dá)到抑制細(xì)胞炎癥的目的[41]。此外，BAI也可以作用于不同的酶達(dá)到抗炎目的，其中環(huán)氧化酶是重要的炎性介質(zhì)，0.5%的BAI可以作用于環(huán)氧化酶并抑制炎癥信號(hào)通路中樞的NF-κB途徑，減少炎癥因子的產(chǎn)生和釋放，表現(xiàn)出顯著的抗炎效果[42]；通過大鼠體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，150 mg/kg的BAI可抑制白細(xì)胞介素-8(IL-8)的釋放及環(huán)氧化酶-2的合成，同時(shí)增加熱休克蛋白70的產(chǎn)生，提高機(jī)體的抗炎能力，進(jìn)而阻斷炎性因子引發(fā)炎癥損傷[43]。BAI也可以減緩細(xì)胞凋亡，恢復(fù)線粒體活力，抑制細(xì)胞炎癥，促進(jìn)機(jī)體健康[44]。在研究LPS誘導(dǎo)小鼠乳房炎的模型中發(fā)現(xiàn)，BAI能明顯減輕LPS對(duì)乳腺的損傷，抑制髓過氧化物酶(MPO)活性和TNF-α、IL-1β水平，同時(shí)阻斷Toll樣受體4(TLR4)的表達(dá)，抑制NF-κB p65和NF-κB抑制蛋白α(IκBα)的磷酸化，以及阻止MAPK信號(hào)通路中p38、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)和c-Jun NH2末端激酶(JNK)的磷酸化，最終達(dá)到治療乳房炎的目的[45]。

2.3 抗氧化應(yīng)激作用

BAI分子結(jié)構(gòu)中含有3個(gè)羥基，其在體內(nèi)能夠通過脫羧的方式清除自由基，達(dá)到調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的作用，其對(duì)烷過氧自由基、超氧陰離子以及1,1-二苯基-2-苦肼基等自由基有很強(qiáng)的清除作用[46]。在清除自由基的過程中，BAI存在的3個(gè)相鄰的羥基可形成半醌式結(jié)構(gòu)達(dá)到抗氧化的作用，過程如圖3所示[47]。其存在的羥基可以通過氧化還原依賴機(jī)制減輕線粒體的損傷，在保護(hù)線粒體氧化應(yīng)激的過程中起關(guān)鍵作用[48]。BAI結(jié)構(gòu)中的C2-C3雙鍵具有提供電子的能力，同樣發(fā)揮抗氧化作用[49]。另外，部分BAI在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成黃芩苷，黃芩苷結(jié)構(gòu)中的6-酚羥基易斷裂發(fā)生抽氫反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮抗氧化作用[50]。研究表明，黃芩苷可以逆轉(zhuǎn)應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷，其通過下調(diào)丙二醛(MDA)和4-羥基醛(4-HNE)水平，抑制內(nèi)源性活性氧(ROS)的產(chǎn)生，提高線粒體乙醛脫氫酶2(ALDH2)mRNA和蛋白表達(dá)水平及ALDH2活性，發(fā)揮顯著的抗氧化作用[51]。

圖3 黃芩素清除自由基的過程

Ha等[52]研究發(fā)現(xiàn)，100 mmol/L的BAI可以顯著降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的2個(gè)關(guān)鍵途徑基因免疫球蛋白結(jié)合蛋白(BiP)、C/EBP同源蛋白(CHOP)的表達(dá)水平，同時(shí)降低ROS水平，證明BAI具有減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用。研究發(fā)現(xiàn)98%的BAI可以有效抑制過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激和ROS的生成，同時(shí)通過調(diào)節(jié)核因子-E2相關(guān)因子2(Nrf2)信號(hào)通路保護(hù)C6神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和凋亡[53]。采用不同溶劑制備BAI，發(fā)現(xiàn)BAI在大鼠肺線粒體中表現(xiàn)出顯著的抑制H2O2誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化(LPO)的作用，有效地保護(hù)細(xì)胞損傷，減少大鼠肺線粒體的氧化應(yīng)激[54]。另外，在家禽飼糧中添加100～200 mg/kg的BAI可顯著提高肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)活性，從而提高抗氧化能力[55]。在豬冷凍稀釋精液中單獨(dú)添加0.04或0.06 g/L的BAI，可以提高解凍后精子中GSH-Px、CAT和SOD等抗氧化酶的活性，同時(shí)降低MDA水平，提高精子抗氧化能力和成活率[56]。此外，BAI可以呈劑量依賴的方式降低MDA水平，抑制炎性因子產(chǎn)生，調(diào)節(jié)蛋白激酶B(AKT)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途徑，保護(hù)肝臟免受氧化應(yīng)激的損傷[57]。綜上所述，BAI可以通過清除自由基、降低ROS水平、調(diào)節(jié)信號(hào)通路和代謝途徑來減少氧化應(yīng)激的發(fā)生，其自身化學(xué)結(jié)構(gòu)是發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用的主要原因。

2.4 其他作用

大量試驗(yàn)證明BAI具有抗腫瘤、抗過敏、降血糖和保護(hù)免疫器官的作用。BAI通過調(diào)節(jié)不同的代謝信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞的發(fā)展，同時(shí)降低腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移速度，顯著降低腫瘤組織中CD31(內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物)和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA，壁細(xì)胞標(biāo)記物)的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，是治療腫瘤疾病的優(yōu)選藥物[58]。BAI的毒副作用較化療藥物小，其具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和清除氧化自由基的能力，同時(shí)減弱MAPK、AKT或mTOR的活性，通過激活半胱天冬酶-9(Caspase-9)/半胱天冬酶-3(Caspase-3)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及減少基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)/MMP-9的表達(dá)，抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的能力，在臨床上其廣泛用于治療口腔癌、乳腺癌、膀胱癌等疾病[59-61]。BAI也具有降低血糖的作用，250 mg/kg的BAI可以降低血糖和MDA水平，抑制活化型半胱天冬酶-3(cleaved Caspase-3)表達(dá)，促進(jìn)胰島細(xì)胞分泌胰島素(INS)，提高INS水平和SOD活性，從而顯著降低大鼠血糖水平，其作用機(jī)制與BAI抑制胰島細(xì)胞的凋亡有關(guān)[62]。另有研究證明，BAI在抗過敏方面也有顯著的治療效果，但具體作用機(jī)制尚不明確[63]。

3 小 結(jié)

現(xiàn)代生物和分析技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了對(duì)BAI的結(jié)構(gòu)及其與抗菌、抗炎、抗氧化等生物學(xué)功能關(guān)系的研究。據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194號(hào)公告，自2020年7月1日我國(guó)在飼料端全面禁止添加抗生素，植物提取物作為生物活性物質(zhì)被認(rèn)為是后抗生素時(shí)代解決健康養(yǎng)殖的核心策略[64]。BAI作為植物提取物中的優(yōu)質(zhì)黃酮類化合物，其對(duì)動(dòng)物氧化應(yīng)激-炎癥反應(yīng)-免疫三方聯(lián)動(dòng)效應(yīng)的穩(wěn)定具有促進(jìn)作用，對(duì)動(dòng)物疾病的預(yù)防、治療具有一定潛力[65]。但目前BAI及其代謝產(chǎn)物在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮作用的途徑、機(jī)理以及不同動(dòng)物上的適宜使用劑量有待進(jìn)一步研究。