張柏林 劉 寧 郝美林 謝宇瀟

(遵義師范學院生物與農(nóng)業(yè)科技學院，赤水河流域特色動物資源保護與利用重點實驗室，遵義523006)

白肌肉(PSE肉)最早源于豬肉，具有顏色灰白(pale)、質(zhì)地松軟(soft)及表面滲水嚴重(exudative)等特征，俗稱水豬肉或蒼白肉[1]。禽類的部分胸肌中也具有高亮度(L*)值、質(zhì)地松軟及保水性低的特征，因而被稱為類PSE肉。我國肉雞類PSE肉的發(fā)生率超過20%(冬季約為21%，夏季約為24%)[2-3]，并且類PSE肉一直被公認為是產(chǎn)生低質(zhì)禽肉的原因之一，給現(xiàn)代養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[4-5]。研究表明，快速和過度的糖酵解、乳酸的快速積聚和死后早期肌肉中的高溫是導致類PSE樣綜合征的誘因[6]。運輸應激被認為是導致肉雞類PSE肉發(fā)生的重要因素之一[7]。

運輸應激加速了肉雞肌肉的能量消耗，使肌肉組織中糖酵解增加，乳酸積累增加，從而引起類PSE肉的發(fā)生[8]。有研究表明，宰前長時間運輸(>3 h)、長距離運輸(≥160 km)及運輸小氣候等因素能給肉雞造成嚴重的應激，導致肉雞死亡率及類PSE肉發(fā)生率增加[9-11]。并且，運輸應激能夠引起肉雞血漿中葡萄糖含量顯著降低，血漿皮質(zhì)酮含量急劇升高[12-13]。此外，Xing等[14]研究證實，運輸應激會導致宰后早期肌肉中能量水平較低，而隨后肌肉中乳酸含量迅速升高，導致肉品質(zhì)變差。因此，運輸應激是與肉品質(zhì)相關(guān)的重要因素之一，應被作為一個關(guān)鍵控制點予以關(guān)注[15-16]?；诖?，本文從運輸應激對肉雞血液生化指標、肉品質(zhì)、能量代謝及其機制等方面進行了綜述，以期為家禽運輸應激研究及能量調(diào)控提供參考。

1 運輸應激對肉雞血液生化指標和機體免疫功能的影響

隨著集約化養(yǎng)殖的不斷推行，肉雞從養(yǎng)殖場運往屠宰場的過程面臨著一個多因素的綜合壓力過程。如宰前禁飼、抓捕、裝箱及運輸?shù)纫蛩囟紩o肉雞帶來嚴重的應激[15,17]，從而激活下丘腦-垂體-腎上腺軸，引起血漿皮質(zhì)酮和腎上腺素含量增加，造成機體生理代謝紊亂，進而影響肉品質(zhì)[18]；甚至造成肉雞死亡率的增加，給養(yǎng)禽業(yè)和肉禽加工業(yè)帶來了重大的經(jīng)濟損失[19]。因此，運輸應激成為養(yǎng)禽業(yè)關(guān)注的焦點，也受到國內(nèi)外越來越多研究者的關(guān)注。

運輸應激是宰前應激中最主要的應激之一[15,20]。血漿皮質(zhì)酮和葡萄糖含量可作為肉雞運輸應激及肌肉損傷的指示物[21-22]。研究表明，與0.5 h運輸應激相比，3.0 h運輸應激顯著降低了肉雞血液葡萄糖含量[23]。Yue等[24]在慢速生長黃羽肉雞上的研究同樣表明，3.0 h的長途運輸應激顯著降低了肉雞血漿葡萄糖含量。這表明運輸應激加劇了機體對葡萄糖的消耗。此外，運輸應激條件下，家禽血漿皮質(zhì)酮含量增加，從而參與機體的物質(zhì)代謝、免疫應答等[25]，而肉雞血漿皮質(zhì)酮含量增加往往伴隨類PSE肉的產(chǎn)生[26]。Zhang等[12]以快速生長的愛拔益加(AA)肉雞為研究對象，研究發(fā)現(xiàn)，與短途運輸應激(0.75 h)相比，長途運輸應激(3.00 h)可降低肉雞血漿葡萄糖含量，提高血漿皮質(zhì)酮含量，表明長途運輸應激組肉雞受到的應激強度大；并且，長途運輸應激顯著降低了肉雞體重，這與Nijdam等[27]的研究結(jié)果相似。Ondrasovicova等[28]報道，與30 km運輸距離相比，120 km運輸距離顯著提高了肉雞血漿皮質(zhì)酮含量。以上結(jié)果提示，隨著運輸時間的延長和運輸距離的增加，肉雞受到的應激強度增大。并且，運輸應激還影響血液中相關(guān)酶活性，當機體受到外界持續(xù)刺激時，肌細胞受損而導致細胞內(nèi)的酶[如肌酸激酶(creatine kinase，CK)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)]滲透至外界，從而引起血液中這2種酶活性的增加。邢通[29]研究表明，高溫運輸應激顯著增加了肉雞血液中CK和LDH活性，這意味著運輸應激在一定程度上破壞了肌細胞膜，引起肌細胞損傷和細胞膜破裂。

運輸應激除影響血液相關(guān)指標外，對機體免疫功能也有一定的影響。運輸應激影響機體血液中白細胞數(shù)量、中性粒細胞功能和細胞免疫功能[30]。并且，通過將3H-胸腺嘧啶摻入不同有絲分裂原誘導的淋巴細胞中對細胞免疫功能進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，運輸應激抑制了機體細胞免疫功能[30]。Mitchell等[31]研究發(fā)現(xiàn)，在3 h的運輸應激過程中，隨著車內(nèi)溫度、相對濕度及二氧化碳濃度的增加，肉雞血液中異嗜細胞與淋巴細胞的比率顯著增加。張林[25]在肉雞上的研究同樣表明，隨著運輸時間的增加，肉雞血液中異嗜細胞與淋巴細胞的比率有增加的趨勢。由此可見，運輸應激影響了機體的細胞免疫功能，從而降低了機體的免疫功能。

2 運輸應激對肉雞肉品質(zhì)的影響

在運輸應激條件下，動物機體能量代謝加強，如葡萄糖、糖原等通過糖酵解作用補充能量，導致宰后肌肉中糖原和乳酸含量變化，從而影響肉品質(zhì)[25]。隨著宰前運輸時間的延長，肌肉劇烈收縮，無氧酵解反應增加，使產(chǎn)生的乳酸在肌肉中不斷積累，導致肌肉最終(宰后24 h)pH降低[32]。此外，應激會使磷脂酶A2活性增加，激發(fā)鈣離子(Ca2+)釋放，造成線粒體和肌漿中Ca2+濃度增加。Ca2+可激活肌原纖維ATP酶和磷酸化酶使得糖原酵解加劇，提高細胞內(nèi)乳酸濃度[33]，降低肌肉pH。Castellini等[34]研究表明，長途運輸應激顯著影響了肌肉pH和系水力，使宰后肌肉品質(zhì)降低。Wang等[4]研究結(jié)果顯示，與0.5 h運輸應激相比，3 h運輸應激降低了宰后24 h胸肌pH，增加了胸肌滴水損失；然而，比較有趣的是，與無運輸應激相比，3 h運輸應激對腿肌的pH和滴水損失沒有顯著影響。分析其可能原因包括以下幾點：1)動物宰殺后，機體氧供應被切斷，而肌糖原繼續(xù)進行無氧酵解，使得肌肉中乳酸大量積累，因而造成pH顯著降低；2)由于宰前捕捉、掙扎等應激行為引起體內(nèi)代謝紊亂，導致肌肉溫度較高，死后肌肉冷卻時間延長，導致無氧酵解過程增加；3)肌肉肌纖維類型的不同也會影響肌肉的最終pH。研究表明，胸肌(由Ⅱb型肌纖維構(gòu)成)中乳酸含量高于腿肌(由Ⅰ型、Ⅱa和Ⅱb型肌纖維構(gòu)成)，并且運輸應激能夠顯著降低胸肌最終pH。這可能是由于Ⅱb型肌纖維有著較強的糖酵解代謝能力。因而，糖原含量高的胸肌更易受運輸應激的影響而產(chǎn)生類PSE肉[35]。

運輸應激不僅影響肌肉的最終pH和系水力，對肌肉的色澤，如L*、黃度(a*)及紅度(b*)值等也有不同程度的影響，其中對L*值的影響最大。肌肉pH是衡量肉品質(zhì)的重要指標，較低的pH會引起肌肉中肌動蛋白和肌球蛋白凝結(jié)收縮成顆粒狀，空間結(jié)構(gòu)破環(huán)，結(jié)合水與蛋白質(zhì)分離形成游離水，游離水的增多導致肌肉系水性下降，而過低的pH和較多的游離水則會對肌肉顏色產(chǎn)生直接影響[23,36]。此外，在應激條件下，自由基不斷產(chǎn)生，活性氧增多，脂質(zhì)氧化生成大量丙二醛。丙二醛是極活潑的交聯(lián)劑，會使細胞發(fā)生交聯(lián)從而失去活力，進而使肌肉對水的吸附能力下降。同時，蛋白質(zhì)變性和脂質(zhì)氧化會使細胞膜的正常結(jié)構(gòu)和功能受到破壞，細胞內(nèi)液釋出。大量滲出液使肌肉表面潮濕，反射自然光能力增加，導致L*值增加[23]。Zhang等[37]對AA肉雞進行3.0 h的運輸應激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組(0.5 h運輸應激)相比，3.0 h運輸應激顯著增加了宰后24 h胸肌L*值，但對a*和b*值沒有顯著影響，這與Wang等[4]的研究結(jié)果一致。但Zhang等[17]及Yue等[24]分別以Ross肉雞和黃羽肉雞為研究對象進行研究，結(jié)果表明，3.0 h運輸應激對宰后24 h胸肌L*、a*和b*值均沒有顯著影響。造成結(jié)果出現(xiàn)差異的原因可能是由于肉雞品種的不同。除此之外，有研究表明，運輸應激使得肉雞糞便中彎曲桿菌(一種能夠引起腹瀉的病原菌)的數(shù)量增加，從而導致肉雞胴體感染病原菌的風險加大[38]。以上研究表明，運輸應激會引起肉雞產(chǎn)生強烈的應激反應，導致宰后肉品質(zhì)下降。

3 運輸應激對肉雞肌肉能量代謝的影響

3.1 運輸應激對ATP及磷酸肌酸利用的影響

ATP含量及一磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)/ATP是典型的評價細胞、組織、器官及整個機體能量狀態(tài)的指標[4]。在宰后肌肉靜息狀態(tài)下，ATP在肌球蛋白ATP酶和肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶的作用下持續(xù)分解為二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)和無機磷酸鹽，為機體代謝提供能量[39]。研究表明，在經(jīng)歷熱應激或運輸應激的火雞和肉雞中，其胸肌肌肉中ATP含量較低，AMP/ATP較高[13,40]。Xing等[14]選用120羽42日齡AA肉雞進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與無運輸組相比，30 min運輸應激顯著降低了肌肉ATP含量，顯著增加了肌肉次黃嘌呤核苷酸(inosine monophosphate，IMP)含量，增加了(AMP+IMP)/ATP。Savenije等[40]研究同樣表明，1.5 h運輸應激顯著降低了宰后1.0 h肌肉ATP含量，這意味著運輸應激加速了肌肉能量代謝，增加了肌肉中ATP的分解。

此外，肌酸(creatine，Cr)及其磷酸化形式的磷酸肌酸(phosphocreatine，PCr)是脊椎動物所有活細胞能量傳遞的關(guān)鍵物質(zhì)[41]。Cr/PCr系統(tǒng)作為ATP/ADP系統(tǒng)的后備，以便在短時間內(nèi)存儲和調(diào)動細胞特別是肌肉細胞中的能量。在細胞中，Cr在肌酸激酶的催化下與ATP結(jié)合生成PCr和ADP。并且，當細胞能量水平不足時，PCr可以重新形成Cr，并釋放出ATP，為細胞提供所需要的能量[42](圖1)。研究表明，運輸應激顯著降低了宰后胸肌中Cr含量[13]。Zhang等[37]研究發(fā)現(xiàn)，3.0 h運輸應激顯著降低了胸肌中Cr含量，但對PCr含量及PCr/Cr比值沒有顯著影響。這表明運輸應激激活了肌肉中Cr/PCr系統(tǒng)，PCr在能夠通過內(nèi)源性磷酸肌酸循環(huán)來產(chǎn)生部分ATP，為肌肉收縮提供能量。

圖1 磷酸肌酸“穿梭”系統(tǒng)

3.2 運輸應激對肌肉糖酵解的影響

肉雞屠宰后，機體氧供應被切斷，細胞的呼吸方式也由有氧呼吸變?yōu)闊o氧呼吸，肌糖原進行無氧酵解。一般認為，肌糖原的降解是糖酵解代謝的第1步。糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase，GP)是參與糖原分解的關(guān)鍵酶，是催化糖原分解的限速步驟。GP通過斷裂1，4-糖苷鍵連接，將葡萄糖分子從糖原鏈中移除[44]。同時，肌糖酵解代謝途徑也受到一些限速酶的高度調(diào)控。己糖激酶(hexokinase，HK)是糖酵解途徑中的第1個酶，可將葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸。丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)和LDH作為糖酵解途徑的關(guān)鍵末端酶，在厭氧條件下分別將磷酸烯醇丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸和將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸[45]。

宰后糖酵解作用在肌肉變化過程中起著至關(guān)重要的作用[46]。糖酵解過程中的糖原含量、糖酵解潛力及糖酵解酶活性均影響著宰后肌肉變化。Zanetti等[20]對肉雞分別進行90或220 min的運輸應激，并利用蛋白組學方法進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10個蛋白表達的位點出現(xiàn)差異。其中，PK和3-磷酸甘油醛脫氫酶等的表達隨運輸時間的增加而增加。Xing等[47]在肉雞上的研究發(fā)現(xiàn)，運輸應激增加了宰后肌肉中乳酸含量，降低了肌肉pH，增加了糖酵解過程中的2，6-二磷酸果糖酶活性，加速了肌肉的糖酵解。Wang等[4]和Zhang等[13]研究均發(fā)現(xiàn)，3.0 h運輸應激顯著降低了肉雞胸肌中糖原含量，增加了胸肌乳酸含量及糖酵解潛力{糖酵解潛力(μmol/g)=2[(糖原含量(μmol/g)+葡萄糖含量(μmol/g)+6-磷酸葡萄糖含量(μmol/g)+乳酸含量(μmol/g)]}。同時，3.0 h運輸應激也顯著增加了胸肌HK、PK及LDH活性。由此可見，運輸應激增加了糖酵解酶活性，影響了宰后肌肉糖酵解過程。

4 運輸應激對肌肉能量代謝的影響機理

4.1 腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號通路介導運輸應激條件下肌肉能量代謝

AMPK是蛋白激酶信號級聯(lián)通路的下游組成元件，是由1個催化亞基(AMPK-α)和2個調(diào)節(jié)亞基(AMPK-β和AMPK-γ)組成的異源三聚體酶，在感應細胞內(nèi)能量平衡和調(diào)控肌肉糖酵解方面發(fā)揮著重要的作用[48]。AMPK是體內(nèi)重要的能量感應器，被稱為真核細胞的“能量調(diào)節(jié)器”。當骨骼肌缺少氧氣供應或發(fā)生劇烈的肌肉收縮時，ATP被消耗，AMP/ATP升高，AMPK信號通路被激活，從而加速肌肉糖酵解進程[49-50]。然而，當AMPK基因被敲除后，宰后肌肉的糖酵解程度降低[51]。研究表明，α亞基對于AMPK的活化是必需的，α亞基含有激酶結(jié)構(gòu)域，活性高度依賴于α-蘇氨酸(Thr)172的可逆磷酸化，而AMPK信號通路的激活主要是通過磷酸化α-Thr172位點來實現(xiàn)的[52]。Xing等[47]利用AA肉雞為研究對象進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組(無運輸應激)相比，運輸應激增加了宰后0.5～4.0 h肌肉AMPKα的磷酸化水平，而對宰后24 h肌肉AMPKα磷酸化水平?jīng)]有影響。這表明AMPK信號介導了運輸應激條件下肌肉的能量代謝。并且，宰后0.5～24.0 h肌肉AMPKα磷酸化水平逐步降低，表明運輸應激可能只是影響了宰后肌肉較早階段的無氧酵解。

AMPKα由α1和α2 2個亞基構(gòu)成。其中，AMPKα1廣泛分布于肝臟、腎臟、骨骼肌等組織中，參與對肌肉生長的調(diào)控；而AMPKα2則主要分布在心肌和骨骼肌等，參與機體代謝[53]。Liang等[54]利用基因小鼠作為模型動物進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與AMPKα1基因敲除小鼠相比，AMPKα2基因敲除顯著降低了小鼠肌肉的糖酵解潛力，降低了宰后肌肉中乳酸堆積，抑制了AMPK活性。Zhang等[13]研究表明，與0.5 h宰前運輸應激相比，3.0 h宰前運輸應激顯著增加了宰后胸肌AMPKα2 mRNA表達水平，但對AMPKα1 mRNA表達水平?jīng)]有顯著影響，這與Wang等[55]的研究結(jié)果一致。以上研究結(jié)果提示，AMPKα2而不是AMPKα1介導了宰后肌肉的糖酵解過程，參與了運輸應激條件所引起的肌肉能量代謝過程。

4.2 蛋白質(zhì)乙?；绊懺缀蠹∪饽芰看x過程

盡管已有研究表明，AMPK參與了宰后肌肉的糖酵解過程，在宰后肌肉糖酵解方面發(fā)揮著重要作用[56]，但AMPK對宰后肌肉糖酵解的調(diào)控機制仍不清楚。Shen等[51]研究表明，經(jīng)腹腔注入20 mg/kg的AMPK抑制劑顯著降低了宰后24 h肌肉中乳酸含量，增加了肌肉pH，降低了AMPKα Thr172的磷酸化表達水平，有效抑制了宰后肌肉糖酵解。AMPK活化后可提高糖酵解過程關(guān)鍵酶HK、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase，PFK)和HK等的活性[57-58]；然而敲除AMPK基因后，肌肉HK活性明顯降低[59]。注入5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸(AICAR，一種AMPK激活劑)后，能夠顯著提高HK活性[60]。以上研究結(jié)果表明，AMPK可能通過調(diào)節(jié)糖酵解過程中關(guān)鍵酶的活性影響肌肉糖酵解過程。

利用蛋白質(zhì)乙?；牡鞍踪|(zhì)組學分析發(fā)現(xiàn)，在細胞質(zhì)和線粒體中含有大量乙酰化蛋白質(zhì)，包括參與中間代謝的大多數(shù)酶。研究表明，幾乎所有參與糖酵解及糖原代謝的酶都被乙?；痆61](圖2)，蛋白質(zhì)乙?；懊撘阴；{(diào)控著機體的糖酵解進程[62-63]。乙?；ㄟ^多種機制調(diào)節(jié)代謝酶活性，包括激活或抑制酶活性以及影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[64]。經(jīng)腹腔注入AICAR能夠顯著增加肌肉中AMPK活性，并伴隨肌肉總乙?；降纳?。而注入組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑Ⅱ(HATⅡ，一種蛋白質(zhì)乙?；种苿?則能抑制AMPK活性、肌肉總乙?；鞍妆磉_水平和肌肉糖酵解速率[65]，這意味著AMPK可能通過乙?；{(diào)控肌肉的糖酵解。Li等[6]利用小鼠為模型，宰前強迫游泳2 min模擬宰前應激，結(jié)果顯示，宰前應激降低了肌肉pH，增加了肌肉乳酸含量及總乙酰蛋白的表達水平。這意味著在運輸應激條件下，AMPK可能是通過組蛋白脫乙?；竵碚{(diào)節(jié)機體的能量代謝。

底物及產(chǎn)物為黑色字體。若代謝酶的乙酰化已確認，其標記為紅色；若還未確定，則標記為藍色。

5 小 結(jié)

宰前運輸引起了肉雞應激反應，造成肉雞代謝紊亂，加速了肉雞能量消耗，使宰后肉雞肌肉糖酵解活動增強，肌肉pH和系水力降低，從而影響了肉品質(zhì)。同時，運輸應激影響了肌肉無氧酵解過程中關(guān)鍵酶的活性，而參與糖酵解過程的大多數(shù)酶是被乙?；?。因此，今后也可以從糖酵解酶的蛋白乙酰化角度出發(fā)，深入研究運輸應激對宰后肌肉能量代謝的影響機制。此外，還可以圍繞宰前運輸管理和宰前營養(yǎng)調(diào)控等措施開展研究，降低肉雞類PSE肉的發(fā)生率。