王建萍 張克英

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，動物抗病營養(yǎng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動物抗病營養(yǎng)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 動物抗病營養(yǎng)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都611130)

我國是世界上最大的蛋雞飼養(yǎng)國，商品蛋雞雖然產(chǎn)蛋性能在高峰期已經(jīng)達(dá)到最大，但是其使用年限短，全期產(chǎn)蛋率并不高，仍然具有巨大的繁殖和生產(chǎn)潛力。而如何提高商品蛋雞產(chǎn)蛋率，延長生產(chǎn)周期，從而緩解環(huán)境壓力，這些都是生產(chǎn)上亟待解決的問題。正常情況下，家禽的卵巢中僅有1‰的卵泡能最終發(fā)育成熟并排卵，大多數(shù)卵泡發(fā)生閉鎖。與哺乳動物不同，蛋雞的卵泡閉鎖一般主要發(fā)生在初級卵泡和前等級(小白、大白和小黃)卵泡階段，其發(fā)生一般是通過凋亡、自噬和其他未知途徑死亡，其中以凋亡為主[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)卵泡內(nèi)一定量的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)對卵泡發(fā)育和排卵具有重要的生理作用，然而ROS的過度堆積會引起氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)卵泡閉鎖，造成繁殖性能衰退[3-4]。對于產(chǎn)蛋雞而言，隨著集約化程度的提高，產(chǎn)蛋或其他應(yīng)激因素(熱應(yīng)激、霉菌毒素、重金屬等)可引起氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致卵泡閉鎖，這可能是降低蛋雞全期產(chǎn)蛋率和生產(chǎn)潛力的根本原因，而氧化應(yīng)激是多種應(yīng)激因素?fù)p害繁殖性能的共同機(jī)制。因此，探討氧化應(yīng)激導(dǎo)致卵泡閉鎖的機(jī)制對挖掘家禽生產(chǎn)性能有重要理論和實(shí)踐意義。本文針對氧化應(yīng)激對卵泡閉鎖的影響及機(jī)制進(jìn)行綜述，旨在為家禽卵泡閉鎖機(jī)制的研究提供理論依據(jù)，也為繁殖學(xué)的理論研究和人類卵巢疾病研究提供科學(xué)的參考。

1 家禽卵泡的命運(yùn)

家禽在孵化時擁有約480萬個原始卵泡，但終生僅排卵500～1 000個，不足1‰，還具有巨大的生產(chǎn)潛力。與哺乳動物類似，家禽的原始卵泡主要存在3種命運(yùn)(圖1)[5]：第一，維持靜默狀態(tài)，構(gòu)成原始卵泡庫(primordial follicle reserve，PFR)；第二，在外部因子(各類繁殖激素、生長因子、細(xì)胞因子等)的刺激下原始卵泡被激活，發(fā)育成初級卵泡、前等級卵泡[直徑1～8 mm：包括小白卵泡(SWF，直徑<1 mm)、大白卵泡(LWF，直徑2～5 mm)、小黃卵泡(SYF，直徑5～8 mm)、大黃卵泡(LYF，直徑9～12 mm)]和等級卵泡(按體積大小分別為F1～F7)，并發(fā)育成熟和最終排卵，若遇應(yīng)激和疾病等因素導(dǎo)致發(fā)育受阻，則會發(fā)生卵泡閉鎖；第三，靜默狀態(tài)的原始卵泡經(jīng)歷細(xì)胞凋亡、自噬或其他未知途徑死亡，形成卵泡閉鎖[2]。卵泡閉鎖是指卵泡及其中的卵母細(xì)胞在發(fā)育過程中停止生長并逐漸退化的現(xiàn)象。成熟卵泡主要由卵黃、卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞層和膜細(xì)胞層(圖1)等組成。由于家禽和哺乳動物一樣，在出生后缺乏生殖干細(xì)胞[5]，因而其在胚胎發(fā)育時期所建立的原始卵泡庫是出生后生殖細(xì)胞的唯一來源，而卵泡閉鎖的數(shù)量直接影響家禽產(chǎn)蛋率的高低。

圖1 原始卵泡的3種命運(yùn)

2 氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致卵泡閉鎖

氧化應(yīng)激(oxidative stress)是指機(jī)體在內(nèi)外環(huán)境各種有害刺激下，體內(nèi)產(chǎn)生的ROS和活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)過多，超過機(jī)體自由基清除能力，從而引起細(xì)胞和組織器官損傷的現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)氧自由基的過度堆積會引起氧化應(yīng)激，造成繁殖性能衰退[3-4]。ROS是細(xì)胞通路的重要調(diào)控分子，能調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡[6]。已有研究表明，卵泡內(nèi)一定量的ROS對其發(fā)育和排卵具有重要的生理作用[7]，然而ROS過度升高將會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)卵泡閉鎖[3,8-9]。在哺乳動物上的研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激會降低卵巢各階段卵泡數(shù)量，損傷卵巢功能[10-14]。有研究發(fā)現(xiàn)添加抗氧化劑(如茶多酚提取物)可以緩解由金屬鉬和鎘誘導(dǎo)氧化應(yīng)激時卵泡數(shù)量的下降[15-16]，在哺乳動物上的研究也發(fā)現(xiàn)已知的強(qiáng)抗氧化劑(原花青素、沒食子酸、維生素E、白藜蘆醇)可以緩解顆粒細(xì)胞的凋亡[17-19]，進(jìn)一步說明了氧化應(yīng)激與卵泡閉鎖關(guān)系密切。

3 氧化應(yīng)激導(dǎo)致卵泡閉鎖的機(jī)制

卵泡主要由卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞層和膜細(xì)胞層組成，是卵巢的基本功能單位。目前的研究表明，氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞的凋亡，并均可導(dǎo)致卵泡閉鎖[2,20]，其中關(guān)于顆粒細(xì)胞介導(dǎo)的卵泡閉鎖的研究較多，也更為深入。

3.1 顆粒細(xì)胞介導(dǎo)的卵泡閉鎖機(jī)制

顆粒細(xì)胞通過間隙連接與卵母細(xì)胞相連，可以與卵母細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)交換，對卵母細(xì)胞靜默、激活和死亡等命運(yùn)起決定作用。前人研究證實(shí)，顆粒細(xì)胞的凋亡是引起卵泡閉鎖的根本原因，當(dāng)顆粒細(xì)胞凋亡數(shù)量達(dá)到10%時，標(biāo)志著卵泡進(jìn)入閉鎖狀態(tài)[5]。目前的研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激可以引起顆粒細(xì)胞凋亡[21-25]。

顆粒細(xì)胞凋亡是一個各種信號傳導(dǎo)系統(tǒng)參與的復(fù)雜生理生化反應(yīng)過程，包括線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑[26-27]。第1條途徑由線粒體介導(dǎo)，細(xì)胞色素c(cytochrome c，Cyt-c)從線粒體釋放是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟。釋放的Cyt-c與細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor,AIF)結(jié)合，并與半胱天冬蛋白酶(cysteine aspartate-specific protease，Caspase)9結(jié)合形成凋亡小體[Cyt-c/d ATP/凋亡酶激活因子-1(apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1)]，進(jìn)而招募、激活下游凋亡執(zhí)行者Caspase 3和8。而被激活的Caspase裂解細(xì)胞內(nèi)重要的參與細(xì)胞功能調(diào)控和修復(fù)DNA的蛋白，如細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)有關(guān)蛋白和DNA修復(fù)酶聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)，最終引起細(xì)胞凋亡[28]。第2條途徑為死亡受體途徑，主要參與因子為Fas/FasL、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)及腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)，最終線粒體途徑和死亡受體途徑都可以通過Caspase 8和10的激活，再進(jìn)一步激活Caspase 3來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而第3條途徑為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑，主要機(jī)制是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(蛋白質(zhì)錯誤折疊或未折疊、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫)導(dǎo)致Caspase 7和12的激活，并進(jìn)一步激活Caspase 9，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[29-30]。此外，B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)家族中的促凋亡蛋白[如Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl2-associated X protein，Bax)、Bcl-2同源拮抗劑(Bcl-2 homologous antagonist/killer，Bak)、Bcl-2樣蛋白11(Bcl-2 protein like 11，Bim)等]和抗凋亡蛋白[Bcl-2、B細(xì)胞淋巴瘤-xL(B-cell lymphoma-2 xL，Bcl-xL)和髓樣細(xì)胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)]是參與調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白。在小鼠模型上的研究表明，氧化應(yīng)激可以提高小鼠卵巢ROS和丙二醛(malondialdehyde，MDA)濃度，引起卵泡閉鎖，降低小鼠卵巢中各階段卵泡數(shù)量[31-33]。另外，叉頭轉(zhuǎn)錄因子1家族成員叉頭框蛋白O1(forkhead box protein O1，F(xiàn)oxO1)是促使卵泡閉鎖和顆粒細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子[34]，可以通過調(diào)控促凋亡基因TRAIL、FasL和p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子(p53 up-regulated modulator of apoptosis，PUMA)的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[35-36]。研究表明，氧化應(yīng)激可以引起顆粒細(xì)胞內(nèi)FoxO1的高表達(dá)，從而調(diào)控其下游基因，引起顆粒細(xì)胞凋亡。而磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3-K)受FoxO1的調(diào)控，Wang等[37]研究證明卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)可以通過下調(diào)蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)-PI3K-蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)-FoxO1軸緩解顆粒細(xì)胞凋亡。劉澤群[38]研究表明，氧化應(yīng)激[過氧化氫(H2O2)處理]可以導(dǎo)致卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，此過程是通過c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)/FoxO1/PUMA信號通路來實(shí)現(xiàn)的。另外，也有研究表明，在順鉑治療卵巢癌過程中JNK也可激活PUMA導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[39]。其他研究也發(fā)現(xiàn)PUMA可以通過下調(diào)下游抗凋亡蛋白(Mcl-1和Bcl-xL)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)由順鈀誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞的凋亡[40-41]。此外，Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路也被證明是調(diào)節(jié)卵泡生長、發(fā)育和成熟的一個關(guān)鍵途徑，可以調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡，該通路受損時，會導(dǎo)致抗穆勒氏管激素(anti-Mullerian hormone，AMH)表達(dá)下降，導(dǎo)致卵母細(xì)胞提前成熟，原始卵泡庫耗竭，從而引起哺乳動物卵巢早衰[42]。Wang等[43]研究發(fā)現(xiàn)，家禽閉鎖卵泡中參與Wnt4的信號通路的基因弱于其他優(yōu)勢卵泡，進(jìn)而表明Wnt4信號通路參與了家禽卵泡閉鎖。

此外，近年來的研究發(fā)現(xiàn)自噬也參與了卵泡閉鎖的過程。自噬是真核細(xì)胞中高度保守的自我更新過程，其特征是將細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)吞噬到雙膜囊泡(自噬體)中，隨后在溶酶體中降解[44]。通常，自噬機(jī)制對于清除功能障礙的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器是必不可少的[45]，但過度自噬也會導(dǎo)致細(xì)胞死亡[44]。研究表明，具有正常ROS產(chǎn)生量的哺乳動物細(xì)胞通常表現(xiàn)出基礎(chǔ)自噬活性，而過度自噬可誘導(dǎo)遭受氧化損傷的細(xì)胞自我毀滅[46]；進(jìn)一步研究證明，在卵泡閉鎖期間，卵泡顆粒細(xì)胞中自噬信號升高[47-48]。Shen等[25,49]和Lou等[50]研究表明，氧化應(yīng)激可以通過激活FoxO1依賴的PI3K-AKT-FoxO1軸和目的沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1,SIRT1)-FoxO1-自噬相關(guān)蛋白7(autophagy related protein 7，ATG7)軸以及抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mammalian or mechanistic target of rapamycin complex 1,mTORC1)和促進(jìn)p53信號通路導(dǎo)致鼠顆粒細(xì)胞自噬，進(jìn)而引起卵泡閉鎖。氧化應(yīng)激還可以通過JNK的激活促進(jìn)自噬關(guān)鍵蛋白Beclin1的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞自噬[51]，而SIRT1已經(jīng)被證明在卵巢中大量存在，且與卵巢的抗氧化和衰老密切相關(guān)；并且，研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)褪黑素可以通過抑制JNK/Bcl2/Beclin1信號傳導(dǎo)，也可以通過抑制SIRT1信號通路，來抑制顆粒細(xì)胞因氧化損傷而導(dǎo)致的自噬[25,32,51]。Kang等[52]通過3-硝基丙酸構(gòu)建鵝顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，研究發(fā)現(xiàn)，抑制Bcl-2會促進(jìn)Caspase3基因的表達(dá)，從而引起鵝顆粒細(xì)胞自噬和凋亡。Li等[14]研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激引起的氧化應(yīng)激可以通過死亡受體通路(FasL-Fas和TNF-α)引起細(xì)胞凋亡，進(jìn)而降低蛋雞的產(chǎn)蛋率。

3.2 卵母細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的卵泡閉鎖機(jī)制

家禽卵母細(xì)胞是卵泡內(nèi)最大的細(xì)胞，被顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞包裹，卵母細(xì)胞的凋亡也是導(dǎo)致卵泡閉鎖的主要原因[53]。人和模型動物上的大量研究表明，ROS的大量產(chǎn)生或抗氧化系統(tǒng)的失衡會導(dǎo)致卵母細(xì)胞凋亡，是減少卵泡儲備的重要原因[54-56]。有研究表明，由氟化物引起的氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致卵母細(xì)胞發(fā)生凋亡，損傷卵巢功能。Luan等[57]和Nguyen等[58]研究發(fā)現(xiàn)，cyclophosphamide或cisplatin(常用的癌癥化療藥物)會通過線粒體凋亡途徑(Cyt-c-Bax/Bcl2-Caspase)引起卵母細(xì)胞凋亡，減少原始卵泡的數(shù)量。Nguyen等[58]和Myers等[59]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，促凋亡蛋白PUMA及其上游關(guān)鍵信號Tap63(p63)是參與癌癥治療藥物(cyclophosphamide、cisplatin、doxorubicin)，可導(dǎo)致線粒體途徑的卵母細(xì)胞凋亡，并最終降低原始卵泡儲備的關(guān)鍵信號通路[57,60]。

另外，人及模型動物上的研究表明，卵母細(xì)胞的自噬也參與了哺乳動物青春期卵泡大量閉鎖[61]。卵母細(xì)胞可以經(jīng)歷多種形式的程序性死亡途徑[62-63]：1)自噬的誘導(dǎo)促進(jìn)了凋亡的發(fā)生；2)自噬和凋亡共同發(fā)生，促進(jìn)細(xì)胞程序性死亡。Xu等[64]通過研究發(fā)現(xiàn)，沉默信息調(diào)節(jié)因子2(silent information regulator 2，SIRT2)失活是卵母細(xì)胞衰老的關(guān)鍵機(jī)制，而SIRT2的抑制作用有助于成熟后卵母細(xì)胞的自噬依賴性細(xì)胞凋亡；已有研究也發(fā)現(xiàn)SIRT1信號通路參與了氧化應(yīng)激誘導(dǎo)卵泡閉鎖的過程，激活SIRT1信號通路有助于卵泡的存活[63,65-66]。因此，在出生后卵母細(xì)胞死亡介導(dǎo)卵泡閉鎖的機(jī)制在不同的時期中可能有不同的途徑，但家禽上氧化應(yīng)激對卵母細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究相對缺乏，有待進(jìn)一步研究。

4 抗氧化劑對卵泡閉鎖的影響

抗氧化劑是清除過量ROS的清除劑，有助于維持機(jī)體的氧化/抗氧化劑平衡，包括酶類抗氧化系統(tǒng)和非酶類抗氧化系統(tǒng)[51]，后者主要由天然和合成的抗氧化劑構(gòu)成，包含維生素C、維生素E、植物多酚(茶多酚、白藜蘆醇、槲皮素等)等[34,51]。近年來，大量模式動物上的研究表明，在癌癥治療以及卵泡體外培養(yǎng)過程中，使用抗氧化劑可以提高卵泡的存活和卵巢的功能[16,37]。

茶多酚是茶葉里面的主要多酚類活性物質(zhì)，已被證明具有強(qiáng)抗氧化和抗凋亡活性[67]。研究表明注射或者口服茶多酚均可以降低卵母細(xì)胞的凋亡和卵泡閉鎖，并增加原始卵泡庫的數(shù)量，從而延緩小鼠卵巢的衰老[16,68]。體外試驗(yàn)進(jìn)一步揭示茶多酚中的表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)可以通過PI3K-AKT信號通路降低腔前卵泡閉鎖[69]。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究也表明，飼糧中添加茶多酚可以緩解過渡金屬鉬和釩引起的氧化應(yīng)激，提高蛋雞產(chǎn)蛋率和雞蛋抗氧化性能[15,70-71]。

白藜蘆醇是研究最多的天然多酚類化合物之一，存在于70多種植物和紅酒中，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤和延緩衰老等作用[72]。最近大量研究表明白藜蘆醇可以緩解氧化應(yīng)激，降低卵泡閉鎖，增加原始卵泡數(shù)量，進(jìn)而延緩卵巢壽命[16,73-75]。Jiang等[75]在小鼠卵巢早衰模型中的研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以緩解卵巢早衰導(dǎo)致的卵巢氧化損傷和卵巢炎癥，并且發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制與hedgehog(Hh)通路相關(guān)。另外，由于白藜蘆醇是SIRT1的激活劑，其緩解氧化應(yīng)激，降低卵泡閉鎖的機(jī)制可能與其激活SIRT1及其下游通路(FoxO1)有關(guān)[17,76]。

槲皮素是一種廣泛存在于水果、蔬菜和樹葉中的天然自由基清除劑，動物(鼠、豬和禽)模型上的研究表明槲皮素可以增加卵巢中抗氧化酶的活性，緩解由重金屬(鎘)造成的卵巢功能降低，降低由氧化應(yīng)激(H2O2、重金屬鎘、T-2毒素誘導(dǎo))引發(fā)的顆粒細(xì)胞凋亡，從而提高卵巢功能[16,77-80]。

此外，其他植物提取物如姜黃素(curcumin)[81-84]、原花青素[85]、辣椒素[82]等也可以緩解氧化應(yīng)激導(dǎo)致的顆粒細(xì)胞的凋亡和卵泡閉鎖，緩解卵巢氧化損傷，但抗氧化劑對卵泡閉鎖的作用目前研究的還不深入，機(jī)制有待進(jìn)一步揭示。

5 小 結(jié)

卵泡閉鎖是影響家禽產(chǎn)蛋性能和繁殖性能的重要因素，近年來的研究表明氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)卵泡閉鎖的重要因素之一，而凋亡和自噬均是卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞死亡的重要機(jī)制。已有的研究表明，氧化應(yīng)激可以通過線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑以及死亡受體途徑引起顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞的凋亡，也可以通過FoxO1依賴的自噬通路引起顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞的死亡；同時，抗氧化物質(zhì)如茶多酚、白藜蘆醇、槲皮素等還可以緩解氧化應(yīng)激，降低卵泡閉鎖。因此，深入研究并揭示卵泡閉鎖的關(guān)鍵機(jī)制，可為通過營養(yǎng)手段調(diào)控卵泡的閉鎖，提高家禽的繁殖性能提供理論基礎(chǔ)。