楚雄州植保植檢站 云南 楚雄 675000

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 設(shè)不施氮(N0=0kgha-1)、N1=45kgha-1、綠色超級(jí)稻目標(biāo)氮肥用量(GSRN=90kgha-1)、N2=135kgha-1和農(nóng)民習(xí)慣施氮量(HN=180kgha-1)，共5個(gè)施氮水平。其中GSRN，N1、N2和HN按基肥40%、分蘗期追肥30%、幼穗分化始期追肥30%施用，尿素作為氮源。所有處理的磷、鉀肥一致，純磷用量為40kgha-1(以過磷酸鈣為肥源)，作為基肥一次性施入，純鉀用量為100kgha-1(以氯化鉀為肥源)，分為基肥和幼穗分化肥施用，各占50%。另有三個(gè)處理都用農(nóng)民習(xí)慣施氮量(HN=180kgha-1)，來進(jìn)行生防菌防效實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程及方法

1.2.1 自小滿節(jié)的頭一天，楚雄州植保站站長(zhǎng)王貴斌、楚雄市植保站站長(zhǎng)蘇龍及相關(guān)科技人在省農(nóng)大國(guó)家工程中心主任李成云教授、李根華等相關(guān)專家的指導(dǎo)下，到東華鎮(zhèn)新柳村委會(huì)苴午村二組進(jìn)行稻田施肥水平與稻瘟病、紋枯病發(fā)生程度關(guān)系田間肥效試驗(yàn)。試驗(yàn)品種為當(dāng)?shù)丶y枯病易感品種云粳37號(hào)，試驗(yàn)田面積1.6畝，設(shè)8個(gè)處理，三次重復(fù)，實(shí)驗(yàn)田小區(qū)隨機(jī)排列，小區(qū)間間隔30-40cm.用薄膜隔開，避免小區(qū)之間肥效的相互影響。整過施肥過程把GSRN、低N1、低N2和HN按基肥40%、分蘗期追肥30%、幼穗分化始期追肥30%作3次分施，并于7月23日施完。根據(jù)施肥后水稻稻瘟病、紋枯病發(fā)生程度，于8月22采用人工接菌的方法誘導(dǎo)水稻發(fā)病。期間施用農(nóng)大植保系研制的3種生防菌(蠟狀芽孢桿菌、放線菌A8、一株弱毒絲核菌)進(jìn)行生物防治。寒露節(jié)的第3天(9月26)對(duì)試驗(yàn)田進(jìn)行了測(cè)產(chǎn)驗(yàn)收，圓滿完成水稻病害發(fā)生與施肥水平關(guān)系的試驗(yàn)示范工作。

1.2.2 在水稻分蘗中期施用在實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵好的三種生防菌(一種蠟狀芽孢桿菌，一株弱毒絲核菌AG-L和一株放線菌A8)

1.2.3 水稻分蘗后期至抽穗前期，待稻瘟病和紋枯病發(fā)病后，進(jìn)行病害調(diào)查，分析施氮量與水稻病害的關(guān)系。

1.2.4 分別在水稻三個(gè)生育期采集土壤樣品(移栽前，施肥后發(fā)病時(shí)，收種后)，進(jìn)行土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)檢測(cè)，和土壤微生物多樣性檢測(cè)。

1.2.5 在稻瘟病和水稻紋枯病發(fā)病后，將發(fā)病植株帶回實(shí)驗(yàn)室，將發(fā)病部位剪下提取RNA，進(jìn)行PCR，檢測(cè)不同處理下，水稻的八個(gè)抗性相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 收種時(shí)，每小區(qū)單獨(dú)測(cè)產(chǎn)，分析施氮量與水稻產(chǎn)量之間的關(guān)系。

1.3 在水稻分蘗中期施用在實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵好的三種生防菌

1.3.1 蠟狀芽孢桿菌：32℃，200r/min于LB液體培養(yǎng)液中，搖床培養(yǎng)24h后制成種液。以1：100的比率在LB培養(yǎng)液中擴(kuò)繁。

1.3.2 弱毒絲核菌：實(shí)驗(yàn)室保存的10株弱毒雙核絲核菌。28℃，180r/min于PDB培養(yǎng)液中培養(yǎng)4天。

1.3.3 放線菌A8：將放線菌A6和A8分別制成不同比例的帶毒平板，接強(qiáng)致病菌AG1-IA M-911。抑菌率最好的還是單獨(dú)發(fā)酵的A8培養(yǎng)液。

1.3.4 固體發(fā)酵：將200ml培養(yǎng)液在超凈工作臺(tái)中加入到300g滅菌谷殼中，培養(yǎng)4天。陰涼處晾干，每小區(qū)施用3kg。

1.4 水稻分蘗后期至抽穗前期，待紋枯病和稻瘟病發(fā)病后，進(jìn)行病害調(diào)查，分析施氮量與水稻病害的關(guān)系

1.4.1 病害等級(jí)：采用5級(jí)調(diào)查法，調(diào)查稻瘟病病害發(fā)生程度。

1.4.2 發(fā)病率：每小區(qū)移栽水稻400株，調(diào)查稻瘟病發(fā)病率。

1.4.3 分別在水稻三個(gè)生育期采集土壤樣品(移栽前，施肥后發(fā)病時(shí)，收種后)，進(jìn)行土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)檢測(cè)，和土壤微生物多樣性檢測(cè)?；A(chǔ)理化性質(zhì)：送檢。土壤微生物多樣性：送檢。

1.4.4 在水稻稻瘟病發(fā)病后，將發(fā)病植株帶回實(shí)驗(yàn)室，將發(fā)病部位剪下提取RNA，進(jìn)行PCR，檢測(cè)不同處理下，水稻的八個(gè)抗性相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.4.1 采樣：為保證材料中RNA質(zhì)量，將活體植株帶回實(shí)驗(yàn)室，剪下發(fā)病部位迅速用液氮處理保存。

實(shí)驗(yàn)：提取RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr，8個(gè)樣品，3次重復(fù)。本實(shí)驗(yàn)采用的八個(gè)水稻抗性相關(guān)基因分別是：幾丁質(zhì)酶基因(Chit1)和幾丁質(zhì)受體基因(CEBiP)；病程相關(guān)基因：PR1a、PR3、PBZ1；轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因：WRKY53、WRKY71、NAC4。

1.5 收種與測(cè)產(chǎn)

收種：每小區(qū)單獨(dú)收種。

測(cè)產(chǎn)：直接稱量每個(gè)小區(qū)的水稻鮮重。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)論與分析

2.1 三種生防菌中，放線菌A8的大田防效試驗(yàn)結(jié)果最佳，顯著降低水稻稻瘟病害發(fā)生率。

2.2 在一定施氮量范圍內(nèi)，水稻稻瘟病病發(fā)生程度與發(fā)病率隨著施氮量的增加而增加。

2.3 過量施氮，降低了土壤p H和有機(jī)質(zhì)含量。隨著施氮量的增加，土壤微生物豐度降低。與HN相比，施用生防菌的小區(qū)土壤微生物豐度明顯增加。

2.4 隨著施氮量的增加，水稻抗性相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)。施用生防菌的水稻，與相同施氮量的小區(qū)相比，其抗性相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量上調(diào)幅度很大。

2.5 在施氮量為GSRN=90kgha-1)、N2=135kgha-1和農(nóng)民習(xí)慣施氮量(HN=180kgha-1)范圍時(shí)，隨著施氮量的增加，水稻產(chǎn)量也在增加，但增產(chǎn)幅度很小，稻瘟病發(fā)病率低，超除此范圍隨著施氮量的增加，水稻產(chǎn)量遞減，稻瘟病發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。