黃元城，郭文磊，王正加

（浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300）

LBD轉(zhuǎn)錄因子是一類在其蛋白質(zhì)N端具有側(cè)生器官邊界(LOB)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的植物特有轉(zhuǎn)錄因子[1]。SHUAI等[2]首次發(fā)現(xiàn)了LBD基因，發(fā)現(xiàn)它在植物側(cè)生器官的邊界細胞中表達并且參與側(cè)生器官的發(fā)育形成。根據(jù)側(cè)生器官邊界(LOB)域的結(jié)構(gòu)，擬南芥Arabidopsisthaliana中的LBD轉(zhuǎn)錄因子家族通常可被分為2類。類1(Group 1)具有1個完整的高度保守的CX2CX6CX3C鋅指結(jié)構(gòu)，通常能夠結(jié)合特定DNA序列。同時類1的LBD基因具有高度保守的甘氨酸GAS結(jié)構(gòu)和亮氨酸拉鏈(zipper-like)結(jié)構(gòu)(LX6LX3LX6L)，它們之間會形成卷曲-螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)并相互作用。而類2(Group 2)只含有1個保守的CX2CX6CX3C鋅指結(jié)構(gòu)[1?4]。大多數(shù)的LBD轉(zhuǎn)錄因子基因從屬于類1。類2的LBD蛋白質(zhì)往往保存有1個可能不具有功能的殘缺的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，它會形成1個盤繞-線圈結(jié)構(gòu)[4]。最近，CHEN等[5]通過研究小麥TriticumaestivumLBD蛋白質(zhì)中LOB結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)，揭示了之前提到的CX2CX6CX3C鋅指結(jié)構(gòu)實際是C4型鋅指結(jié)構(gòu)。C4鋅指結(jié)構(gòu)常常與GAS結(jié)構(gòu)以及α4和α5之間的垂直構(gòu)象共同作用，從而精確識別DNA，并能對結(jié)合位點的空間構(gòu)型進行定位。最初的一些LBD基因功能研究表明：LBD基因通常在側(cè)生器官底部的邊界新生細胞中表達，在器官分化和側(cè)生器官發(fā)育中具有潛在功能[1]。同時，LBD基因還能夠參與植物花青素、氮元素代謝和器官再生等關(guān)鍵過程[6]。類1的LBD基因大多數(shù)參與植物發(fā)育過程[4,7]和由生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)的側(cè)根形成過程。相反，類2基因往往作為花青素合成的阻遏物和有效性信號參與了新陳代謝過程[8]。在擬南芥LBD轉(zhuǎn)錄因子的表達模式研究中，病原體幾乎誘導(dǎo)了類2的所有LBD基因的表達，這表明LBD基因能夠在植物病原防御反應(yīng)中發(fā)揮作用[9]。LBD基因參與到擬南芥許多組織發(fā)育過程中，比如葉片發(fā)育[10]、根部側(cè)生器官發(fā)育[11?13]、細胞分裂素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[14]和赤霉素途徑[15]。值得一提的是，擬南芥中的AthLBD16基因會促進側(cè)根的起始發(fā)育[16]，AthLBD29則能夠抑制擬南芥莖纖維壁增厚的生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[17]。在尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum中AtLBD20作為易感基因似乎能夠調(diào)節(jié)茉莉酸(JA)信號傳導(dǎo)和激活尖孢鐮刀菌中JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程依賴的反應(yīng)[18]。除擬南芥之外LBD基因功能在許多物種中同樣被研究過，如OsIG1基因會參與配子發(fā)生過程并影響水稻Oryzasativa的花器官數(shù)量[19]；MdLBD13蛋白質(zhì)則可以抑制蘋果Malus×domestica中的花色苷合成和氮吸收[20]。與此同時，在許多物種中也開展了利用基因組數(shù)據(jù)資源對LBD基因家族鑒定和分析的研究，如茶樹Camelliasinensis[21]、馬鈴薯Solanumtuberosum[22]、桉樹Eucalyptusrobusta[23]、蕓薹Brassicacampestris[24]、葡萄Vitisvinifera[25]、大豆Glycinemax[26]。但是目前薄殼山核桃Caryaillinoensis中的LBD基因研究卻鮮有報道。在薄殼山核桃全基因組測序組裝完成后LBD基因家族仍然沒有進行系統(tǒng)的研究[27]。本研究通過生物信息學(xué)手段鑒定了薄殼山核桃全基因組內(nèi)的LBD基因，分析其基因結(jié)構(gòu)、基序(motif)分布、轉(zhuǎn)錄組表達模式并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，預(yù)測LBD基因家族在薄殼山核桃中可能的功能，并為進一步研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 多物種全基因組蛋白質(zhì)序列獲取

薄殼山核桃、山核桃Caryacathayensis、核桃Juglansreiga的全基因組蛋白質(zhì)序列來源于胡桃科Juglandaceae數(shù)據(jù)庫(http://www.juglandaceae.net/)[28]。銀杏Ginkgobiloba、無油樟Amborellatrichopoda、藍星睡蓮Nymphaeacoloratar、大豆、葡萄、水稻的全基因組蛋白質(zhì)序列來源于美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)。擬南芥的全基因組蛋白質(zhì)序列來源于擬南芥信息資源庫(TAIR，https://www.arabidopsis.org/)。

1.2 LBD轉(zhuǎn)錄因子基因的鑒定與蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

以LBD為關(guān)鍵詞，搜索獲取LBD在擬南芥中的10條核酸編碼序列(CDS)，并下載這10條基因的FASTA格式的核酸序列。將獲得的10條擬南芥編碼序列通過本地NCBI-BLAST 2.9.0軟件的BLASTX程序與1.1中獲得的全基因組蛋白質(zhì)序列進行同源比對，在Pfam數(shù)據(jù)庫[29]中下載LOB結(jié)構(gòu)域的種子文件，得到的候選LBD蛋白質(zhì)序列用HMMER軟件[30]使用隱馬爾科夫模型算法篩選出LBD基因，利用ExPASy蛋白質(zhì)在線分析網(wǎng)站對蛋白質(zhì)序列進行理化性質(zhì)的鑒定和分析。

1.3 LBD 基因組共線性區(qū)塊分析

通過MCSCAN軟件[31]，將薄殼山核桃全基因組核酸編碼序列CDS文件和基因組注釋GFF文件輸入執(zhí)行Pairwise Synteny Search程序，得到的Anchor Pairwise結(jié)果以30個基因為閾值過濾小片段block。在最后的gene block中尋找1.2中鑒定到的LBD基因。

1.4 LBD 基因多重序列比對

利用ENSEMBL的CLUSTALW軟件[32]對獲取的52條薄殼山核桃LBD基因進行多重序列比對，將比對后的ALN文件輸入至ENDscript網(wǎng)站進行多序列比對的可視化。

1.5 LBD 基因系統(tǒng)發(fā)育、基因結(jié)構(gòu)和基序分析

利用MUSCLE v3.8.31軟件[33]分別對獲取的52條薄殼山核桃和547條多物種LBD基因的蛋白質(zhì)序列進行多序列比對。獲得的多序列比對結(jié)果文件使用FastTree V2.1.11軟件[34]的JTT+CAT算法[35]構(gòu)建最大似然樹，獲得的樹文件通過Evolview在線網(wǎng)站[36]可視化。在胡桃科數(shù)據(jù)庫下載薄殼山核桃基因組結(jié)構(gòu)注釋GFF文件，并利用Gene Structure Display Server 2.0在線網(wǎng)站[37]可視化LBD基因結(jié)構(gòu)圖。在MEME網(wǎng)站上傳52條薄殼山核桃蛋白質(zhì)序列分析基序。

1.6 LBD 基因表達模式分析

轉(zhuǎn)錄組原始測序數(shù)據(jù)從NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) PRJNA435846下的SRA數(shù)據(jù)庫獲?。篠RR6793964、SRR6793963、SRR6793962、SRR6793961、SRR6793960、SRR6793959、SRR6793958、SRR6793957、SRR6793956、SRR6793955。從GIGADB (http://gigadb.org/)獲取薄殼山核桃全基因組序列和基因組注釋GFF文件，利用fastp軟件進行質(zhì)控和過濾，STAR軟件進行序列比對，RSEM軟件對基因進行定量分析，計算TPM值并生成基因表達數(shù)據(jù)框。得到的表達數(shù)據(jù)通過R軟件將表達值進行對數(shù)轉(zhuǎn)換后利用pheatmap包繪制表達熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 LBD 基因鑒定與蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

通過BLASTX初篩出LBD的同源基因，經(jīng)HMM-SEARCH程序[29]分析和篩選，供試的10個物種中共獲得551條LBD基因(表1)。其中大豆中LBD基因的數(shù)量是無油樟的4.46倍、核桃的1.61倍，推測這可能和大豆是由古四倍體演化而來的二倍體有關(guān)[38]。根據(jù)薄殼山核桃基因組GFF注釋文件，發(fā)現(xiàn)有pecanLBD50、pecanLBD51和pecanLBD52等3個基因是位于scaffold123681的短串聯(lián)重復(fù)基因。

表 1 多物種 LBD 基因鑒定結(jié)果Table 1 Identify result of LBD genes in multi-species

MCSCAN分析顯示：薄殼山核桃基因組共有211個共線性的區(qū)塊。在這些共線性的區(qū)塊中找到了13對在可能全基因組加倍事件中發(fā)生重復(fù)的同源LBD基因?qū)Γ簆ecanLBD1和pecanLBD25、pecanLBD4和pecanLBD17、pecanLBD5和pecanLBD16、pecanLBD11和pecanLBD33、pecanLBD11和pecanLBD32、pecanLBD12和pecanLBD33、pecanLBD12和pecanLBD32、pecanLBD14和pecanLBD43、pecanLBD14和pecanLBD42、pecanLBD19和pecanLBD26、pecanLBD20和pecanLBD29、pecanLBD21和pecanLBD36、pecanLBD34和pecanLBD41。共線性分析共得到基因23個，占所有LBD基因的44.2%，這說明了全基因組加倍事件使LBD基因家族得到了擴張。

通過理化性質(zhì)分析(表2)：在氨基酸數(shù)量、分子量、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)和脂肪系數(shù)等方面存在差異。氨基酸數(shù)量為 92～326個，大部分為 170～300個；等電點為4.48～9.85，＞7.5的有24個，多在堿性范圍內(nèi)；不穩(wěn)定系數(shù)＜40的有51個，為穩(wěn)定蛋白質(zhì)；＞40僅1個，為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)的脂肪系數(shù)大多＜100，為疏水性蛋白質(zhì)，僅有pecanLBD50脂肪系數(shù)＞100，為親水性蛋白質(zhì)。

表 2 薄殼山核桃LBD轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白質(zhì)理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of LBD transcription factor family protein in C.illinoensis

表 2 (續(xù))Table 2 Continued

2.2 薄殼山核桃LBD基因系統(tǒng)發(fā)育、基因結(jié)構(gòu)和基序分析

如圖1所示：52個薄殼山核桃LBD基因聚成3類：GroupⅠ、GroupⅡ、GroupⅢ。其中，GroupⅠ含有最多的33個LBD基因，它們可能承擔(dān)了LBD基因促進側(cè)生器官發(fā)育的主要功能。GroupⅠ中有1對蛋白質(zhì)序列完全相同的基因pecanLBD22和pecanLBD48，導(dǎo)致它們在進化樹上沒有顯示變異，而pecanLBD41的進化枝長度達到3.734 6，是GroupⅠ中相對于其他LBD基因變異程度最大的。GroupⅡ細分為3支基因簇，其中 Sub groupⅠ和Sub groupⅢ的進化枝相對較短，因此序列和功能變異不大；而Sub groupⅡ有明顯的進化變異，其中pecanLBD6的枝長為6.274 8，是Sub groupⅡ中變異最大的基因，它可能已經(jīng)出現(xiàn)了功能上的分化變異。GroupⅢ是3類中最保守的一支，其中的pecanLBD9基因的枝長在所有52個LBD基因中最長，達6.764 2。

圖 1 薄殼山核桃LBD基因家族系統(tǒng)進化樹Figure 1 Phylogenetic tree constructed based on the full-length sequences of pecan LBD genes using JTT+CAT algorithm with FastTree software

如圖2中52個薄殼山核桃LBD基因基序分析結(jié)果所示：共發(fā)現(xiàn)了10個基序并命名為Motif1～Motif10。對LBD轉(zhuǎn)錄因子家族較重要的有3個基序：Motif1含GAS(Gly-Ala-Ser)甘氨酸保守結(jié)構(gòu)；Motif 2擁有完整的高度保守的CX2CX6CX3C鋅指結(jié)構(gòu)，通常具有結(jié)合特定DNA序列的能力；Motif 3 為亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(LX6LX3LX6L)。Motif1和Motif3往往會形成卷曲-螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)并相互作用。52個薄殼山核桃LBD基因中的39個具有完整的Motif1、Motif2和Motif3的順序基序結(jié)構(gòu)；而pecanLBD34、pecanLBD41和pecanLBD9在進化過程中丟失了 Motif1的 GAS甘氨酸保守結(jié)構(gòu)；pecanLBD6、pecanLBD19、pecanLBD26、pecanLBD45、pecanLBD37、pecanLBD2 和pecanLBD3 丟失了Motif3亮氨酸zipper-like結(jié)構(gòu)(LX6LX3LX6L)，盡管它們?nèi)跃哂蠫AS結(jié)構(gòu)但已經(jīng)喪失了和Motif1結(jié)合生成卷曲-螺旋蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的功能；pecanLBD50則丟失了所有的基序，可能喪失了LBD基因的基本功能。

圖 2 薄殼山核桃LBD轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)發(fā)育樹和保守蛋白質(zhì)基序結(jié)構(gòu)Figure 2 Phylogenetic tree constructed based on the full-length sequences of pecan LBD genes using JTT+CAT algorithm with FastTree software

基因結(jié)構(gòu)分析顯示：薄殼山核桃LBD基因一般具有1～3個外顯子。其中pecanLBD41～pecanLBD52都只具有1個外顯子(除pecanLBD47有2個外顯子除外)，并且都屬于GroupⅠ；具有3個外顯子的基因只有pecanLBD3、pecanLBD34和pecanLBD9，在每類都有部分；剩余的LBD基因都為2個外顯子，占所有薄殼山核桃LBD基因的67.3%。因此，薄殼山核桃LBD轉(zhuǎn)錄因子家族的大多數(shù)基因較為保守，有著相似的基序、基因結(jié)構(gòu)，執(zhí)行并發(fā)揮LBD的主要功能，而其發(fā)生變異的小部分可能已經(jīng)丟失了原來的基因功能或者特化出新的功能。

2.3 薄殼山核桃 LOB 結(jié)構(gòu)域多序列比對

對52個薄殼山核桃LBD轉(zhuǎn)錄因子基因的LOB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域多序列比對(圖3)發(fā)現(xiàn)：LOB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域主要由3個保守序列模式組成：長度為16個氨基酸的CX2CX6CX3C鋅指結(jié)構(gòu)、長度為50個氨基酸的甘氨酸GAS結(jié)構(gòu)和LX6LX3LX6L亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。其中pecanLBD50和pecanLBD21完全缺失了鋅指結(jié)構(gòu)和部分的甘氨酸GAS結(jié)構(gòu)，而其他的LBD的鋅指結(jié)構(gòu)則全部保存下來沒有發(fā)生缺失或者突變，較為保守。甘氨酸GAS結(jié)構(gòu)相對鋅指結(jié)構(gòu)變異程度較大，GroupⅠ中pecanLBD23～pecanLBD47、pecanLBD10、pecanLBD51發(fā)生了1～2個氨基酸的變異，GroupⅡ中 pecanLBD6、pecanLBD19、pecanLBD26、pecanLBD45、pecanLBD37、pecanLBD2、pecanLBD3等7個轉(zhuǎn)錄因子GAS中的丙氨酸突變?yōu)榫彼?、絲氨酸突變?yōu)楸彼幔?2個LBD轉(zhuǎn)錄因子中有12個發(fā)生了突變，2個缺失了GAS結(jié)構(gòu)。LX6LX3LX6L亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)中，上述7個轉(zhuǎn)錄因子的第1個亮氨酸位置都突變?yōu)楦拾彼?，?個亮氨酸位置突變?yōu)楦拾彼峄蛱K氨酸，有5個轉(zhuǎn)錄因子的第2個亮氨酸位置發(fā)生了突變，由此可見上述7個LBD轉(zhuǎn)錄因子與進化模式(圖1)一致，已經(jīng)發(fā)生了較大程度的變異，可能已經(jīng)分化出新的功能。pecanLBD15、pecanLBD47、pecanLBD10、pecanLBD51、pecanLBD52、pecanLBD7 和 pecanLBD24 的第2個亮氨酸位置發(fā)生了突變，第3個亮氨酸位置只有pecanLBD40、pecanLBD23和pecanLBD10發(fā)生了突變，相對保守。

圖 3 薄殼山核桃LBD 轉(zhuǎn)錄因子家族LOB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域多序列比對Figure 3 Multiple sequence alignment of LOB domain in C.illinoensis transcription factor family

2.4 顯花植物L(fēng)BD轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)發(fā)育分析

由圖4可見：與薄殼山核桃LBD系統(tǒng)發(fā)育樹相似，圖4中各物種LBD轉(zhuǎn)錄因子可以聚為3類：GroupⅠ、GroupⅡ和 GroupⅢ。其中 GroupⅠ有 314個 LBD基因，為總數(shù)的 57.0%，占比最多；GroupⅡ有166個LBD基因，占總數(shù)的30.1%；而GroupⅢ的基因數(shù)量最少，只有71個，占總數(shù)的12.9%。從表1鑒定到的LBD轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量來看，裸子植物銀杏的數(shù)量是早期被子植物類群的2倍，這與銀杏最近一次特異性的WGD事件有關(guān)[39]；早期被子植物類群和單子葉植物水稻的LBD基因數(shù)量接近；而雙子葉植物的LBD基因數(shù)量明顯又發(fā)生了1次倍增。從分布來看，GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ中每個植物類群都存在LBD基因，因此LBD轉(zhuǎn)錄因子家族可能在裸子植物和被子植物未分化前已經(jīng)分為3類，分化后3類LBD繼續(xù)各自進化。從變異程度看GroupⅠ和GroupⅡ相對較為保守，而GroupⅢ內(nèi)的所有LBD基因共享一支較長的分支，說明它們已發(fā)生了較大的變異，可能已經(jīng)分化出新的功能。

圖 4 利用從裸子植物銀杏到高等植物551個LBD基因全長蛋白質(zhì)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 4 Phylogenetic tree constructed based on the full-length sequences of 551 LBD genes from gymnosperm ginkgo to higher angiosperms

2.5 薄殼山核桃LBD基因組織表達模式分析

為了探究LBD轉(zhuǎn)錄因子家族在胚發(fā)育的關(guān)鍵過程中的作用，從NCBI網(wǎng)站的SRA原始測序數(shù)據(jù)庫中下載了薄殼山核桃胚成熟過程中3個關(guān)鍵時期的原始測序數(shù)據(jù)：子葉伸展早期(early extended stage of cotyledon development)、子葉完全伸展期(fully extended stage of cotyledon development)、胚完全成熟期(fully matured stage of embryo)，并進行分析和繪制聚類熱圖(圖5)。不同LBD基因和不同發(fā)育階段之間的表達模式有顯著差異。基因表達量可以聚為4類：①pecanLBD2、pecanLBD19和pecanLBD26在3個階段的表達量比較高；②pecanLBD30、pecanLBD3和pecanLBD37在子葉伸展早期和子葉完全伸展期表達；③pecanLBD11、pecanLBD18、pecanLBD8、pecanLBD25、pecanLBD6、pecanLBD42、pecanLBD13、pecanLBD52、pecanLBD17、pecanLBD35、pecanLBD1、pecanLBD43、pecanLBD29和pecanLBD44 僅在子葉伸展早期有表達；④其余的LBD基因在3個階段都不表達。從2.2中系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果來看：③類表達的14個LBD基因(78.6%)，屬于較為保守的Group I，因此它們在胚發(fā)育過程中主要參與經(jīng)典的器官分化過程，加快子葉邊界新生的細胞分化。而①類表達的基因都是進化枝較長、變異程度較大的GroupⅡ中Sub GroupⅡ的成員，可見GroupⅡ中Sub Group Ⅱ的LBD成員已經(jīng)發(fā)生了較大程度的變異，它們參與到胚發(fā)育的全程，可能與胚中營養(yǎng)物質(zhì)的積累過程和胚組織分生發(fā)育的過程密切相關(guān)。②類中pecanLBD30和pecanLBD3屬于GroupⅡ，pecanLBD37屬于GroupⅠ，它們在功能上可能介于①類和③類，即既參與了器官分化、細胞分裂的過程調(diào)控，又和胚中營養(yǎng)物質(zhì)積累的過程相關(guān)?？傮w上，薄殼山核桃胚發(fā)育過程中LBD基因功能較為保守，主要參與新生細胞分裂分化、子葉形態(tài)建成等，但GroupⅡLBD基因的變異程度較大，可能進化出新的功能，在胚發(fā)育過程中發(fā)揮更加關(guān)鍵的作用。

圖 5 薄殼山核桃LBD 轉(zhuǎn)錄因子家族胚發(fā)育表達模式Figure 5 Transcriptome expression profile of LBD gene family in embryo development

3 結(jié)論與討論

本研究分別在銀杏、無油樟、藍星睡蓮、水稻、擬南芥、葡萄、大豆、核桃、山核桃和薄殼山核桃全基因組蛋白質(zhì)序列中系統(tǒng)鑒定了551個LBD基因。這些LBD基因包含典型的LOB結(jié)構(gòu)域，即1個含有DNA結(jié)合活性所需的 (CX2CX6CX3C)鋅指結(jié)構(gòu)、1個Gly-Ala-Ser(GAS)結(jié)構(gòu)和1個負責(zé)蛋白質(zhì)二聚體化的亮氨酸拉鏈 (LX6LX3LX6L)結(jié)構(gòu)。根據(jù)LOB結(jié)構(gòu)域的組成模式和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析結(jié)果。薄殼山核桃52個LBD基因可分為GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ 3類。33個LBD基因被劃分為GroupⅠ，15個被劃分為GroupⅡ，4個為GroupⅢ。根據(jù)進化枝的長度，GroupⅠ是數(shù)量較多同時也比較保守的一支，而GroupⅡ和 GroupⅢ都發(fā)生了一定程度的變異。

新基因功能產(chǎn)生或分化的一大動力是基因重復(fù)，基因重復(fù)對物種提高環(huán)境適應(yīng)性至關(guān)重要[40]。在進化過程中，重復(fù)的基因可能會經(jīng)歷功能分化、亞功能分化或功能丟失等多種過程[41]?；蛑貜?fù)通常會導(dǎo)致基因家族擴張[42]。為了揭示薄殼山核桃LBD基因家族的復(fù)制機制，利用MCScanX對薄殼山核桃的基因組共線性區(qū)塊內(nèi)成對的LBD基因進行篩選。根據(jù)目前的基因組內(nèi)LBD基因位置分析結(jié)果，薄殼山核桃基因組內(nèi)只存在1個連續(xù)3個LBD基因的串聯(lián)重復(fù)事件，但是存在13對23個由全基因組加倍產(chǎn)生的LBD基因共線性基因?qū)?。這說明全基因組加倍在LBD基因家族進化中起到了主導(dǎo)性的推動作用。

本研究構(gòu)建了以裸子植物(銀杏)、早期被子植物(無油樟、睡蓮)、單子葉植物(水稻)、雙子葉植物(擬南芥、葡萄、大豆)、近緣種植物(核桃、山核桃)和薄殼山核桃為顯花植物中主要類群的LBD基因系統(tǒng)發(fā)育樹。顯花植物L(fēng)BD系統(tǒng)發(fā)育樹與與薄殼山核桃LBD相似，同樣可以聚為3類。從分布來看，GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ中每個植物都存在LBD基因，因此LBD轉(zhuǎn)錄因子家族可能在裸子植物和被子植物未分化前已經(jīng)分化為3類。從變異程度看，GroupⅠ和GroupⅡ相對較為保守，而GroupⅢ內(nèi)的所有LBD基因共享一支較長的分支，說明已發(fā)生了較大的變異，可能已經(jīng)分化出新的功能。

LBD蛋白質(zhì)協(xié)調(diào)了很多植物發(fā)育過程，并對環(huán)境刺激作出反應(yīng)，特別是在調(diào)控側(cè)根器官發(fā)育和代謝過程中起著至關(guān)重要的作用。例如LBD18通過抑制LBD18 DNA-結(jié)合活性控制側(cè)根發(fā)育[43]。一般來說，主根受到側(cè)根過度生長的影響，會降低植物提取水分和養(yǎng)分的能力。在土壤中蔓延的側(cè)根過多，將增加被病原體攻擊的可能性。以前的一些工作已經(jīng)證明了這些預(yù)測。如LBD1通過抑制主根生長和維持側(cè)根萌發(fā)來控制鹽脅迫下的根結(jié)構(gòu)[44]。LBD基因由于其對一系列下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，成為植物病原體入侵的關(guān)鍵分子靶基因[7]。

在薄殼山核桃研究中胚的發(fā)育是非常重要的階段[45]，特別是胚內(nèi)蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、淀粉等重要營養(yǎng)物質(zhì)累積過程是薄殼山核桃研究的熱點[46?47]。本研究分析LBD轉(zhuǎn)錄因子家族在薄殼山核桃子葉伸展早期、子葉完全伸展期和胚完全成熟期3個時期的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)：薄殼山核桃LBD基因存在4種表達模式?？梢奓BD基因具有參與調(diào)控胚發(fā)育過程的功能，通?；谠趥?cè)生器官底部的邊界新生的細胞中調(diào)控細胞分裂分化來控制子葉的發(fā)育和形態(tài)建成。薄殼山核桃LBD基因中有在整個胚發(fā)育過程中都高表達的一簇基因，這些基因在胚發(fā)育過程中發(fā)揮了更加重要的作用，因此有必要對這一簇LBD基因進行更為深入的基因功能研究，可為進一步改良薄殼山核桃遺傳性狀提供基礎(chǔ)。