李慧來， 洪承剛， 潘井宇， 朱 靈， 劉 勇， 楊 柯*

(1.中國科學院合肥物質科學研究院安徽光學精密機械研究所， 合肥 230031； 2.中國科學技術大學， 合肥 230026)

細胞趨化性是指細胞朝著特定的化學濃度梯度發(fā)生遷移運動。許多細胞都具有感知的外部化學信號并朝向化學引誘物發(fā)生遷移運動的能力，如T淋巴細胞、癌細胞、白細胞等[1]。這種現象已被證明在胚胎發(fā)育[2]，傷口愈合[3]，腫瘤轉移[4]中發(fā)揮了重要作用。

細胞趨化性研究依托能形成穩(wěn)定趨化因子濃度梯度裝置和評價細胞遷移方法。經典的梯度發(fā)生器，如博伊登室[5]、Install室[6]等已經被用于細胞趨化性研究多年,目前仍然活躍在實驗室中，但是其消耗的試劑量大且操作煩瑣，實驗成本過于高昂。目前的評價細胞遷移方法有劃痕實驗法和Transwell實驗法[7-8]，但是這兩種方法都有明顯的不足。劃痕實驗法重復性較差，且損傷細胞。Transwell實驗法則操作復雜且不適合動態(tài)觀測，為此，人們發(fā)展了以微流體芯片為基礎的微流體梯度發(fā)生器。微流體芯片的管道尺寸在微米量級，與細胞的大小相當，消耗的細胞和試劑量少，且能較好的模擬體內環(huán)境，不損傷細胞，適合動態(tài)觀察[9]。微流體芯片為研究細胞生命科學的平臺搭建提供了良好的選擇?；谖⒘黧w芯片的細胞趨化性研究需要依托專業(yè)的活細胞成像設備，且在定時采集一系列的細胞圖像之后，需要專業(yè)的科研人員使用ImageJ圖像處理軟件手動追蹤細胞運動軌跡并分析細胞趨化性，檢測方法較為煩瑣且時間和實驗成本較高。幸運的是，各種廉價的圖像傳感器模塊，如電行耦合元件(charge-coupled device，CCD)和互補金屬氧化物半導體(compementary metal oxide semiconductor，CMOS)圖像傳感器已經廣泛應用于數碼相機、網絡攝像頭和智能手機。有鑒于此，近年來研究人員已經致力于開發(fā)便攜式的細胞趨化遷移系統(tǒng)。Chen等[10]利用手機開發(fā)了一款可觀測細胞形態(tài)和蛋白質光譜的光譜成像系統(tǒng)。Liao等[11]利用無透鏡圖像傳感技術和全整數量化算法構建了一套卷積神經網絡(convolutional neural networks，CNN)鏡頭硬件系統(tǒng)來進行細胞圖像采集和分析。Go等[12]將基于智能手機的數字在線全息顯微(digtal in-line holographic microscopy，DIHM)系統(tǒng)和機器學習算法相結合，開發(fā)了一款不需要人工解讀的便攜式設備，用來對微粒子進行感知和分類。但這些研究成果均不是專業(yè)的細胞趨化性研究設備。

針對細胞趨化性研究領域對便攜式研究設備的需求，擬基于USB顯微鏡設計一套便攜式細胞趨化遷移分析系統(tǒng)并應用于人體中性粒細胞對細胞趨化因子——白細胞介素(interleukin 8，IL8)的趨化性研究和高血糖對人體中性粒細胞趨化性的影響研究。該系統(tǒng)首先使用USB顯微鏡在實驗過程中以10 s的間隔時間采集90幅細胞圖像，再使用基于美國國家儀器公司(National Instruments, NI)的IMAQ Vision圖像處理軟件包開發(fā)的集成軟件處理細胞運動圖像。系統(tǒng)一方面可通過將第一幅和最后一幅細胞圖像的寬度像素均分為10份，采用細胞分區(qū)計數和數字得分方法對細胞趨化性進行簡單分析。此外，還可通過識別細胞的中心坐標并結合最小距離法追蹤細胞運動追跡，進而計算細胞的趨化性指數CI、總遷移距離LAD、運動速度VMS和梯度位移LGD,從而評估細胞趨化性以及不同物質對其的影響。通過該遷移分析系統(tǒng)，可實現自動采集，分析細胞遷移軌跡，避免手工操作時出現的誤差，保障了實驗的重復性；且該系統(tǒng)結構結構簡單，集成度較高，無需專業(yè)人員進行操作，有利于該系統(tǒng)的應用推廣。

1 系統(tǒng)的工作原理

便攜式細胞趨化遷移分析系統(tǒng)的結構示意圖如圖1所示。整個裝置包含計算機、USB顯微鏡、微流體芯片、溫控單元、發(fā)光二極管(light-emitting diode，LED)光源等。檢測原理是：①LED光源通過透明加熱片為微流體芯片提供照明，LED光源由多個LED發(fā)光二極管組成，可以實現不同的光源照射角度；②溫控單元由數字溫度控制器和透明加熱片組成，加熱片與微流體芯片貼合以保證芯片溫度維持在(37±0.5) ℃；③USB顯微鏡每間隔10 s采集一幅細胞圖像，實驗時間15 min。圖像存儲于計算機硬盤并用于分析。

圖1 便攜式細胞趨化性實驗裝置Fig.1 Portable experimental apparatus for cell chemotaxis for cell chemotaxis

2 細胞趨化性分析方法

2.1 分析系統(tǒng)

便攜式細胞趨化遷移分析系統(tǒng)如圖2所示。趨化因子濃度梯度測試結果如圖2(b)所示，微流體芯片如圖2(c)所示。芯片主通道深度為60 μm，寬度為300 μm。芯片具有4個小腔，1為高濃度趨化因子入口，2為培養(yǎng)液注入口，3為細胞溶液入口，4為廢液口。實驗時，首先在趨化因子入口1和細胞培養(yǎng)液入口2分別注入10 nmol/L趨化因子50 μL IL8和0.4%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)溶液50 μL。趨化因子和BSA溶液通過連續(xù)層流和擴散機制在主通道顯微鏡檢測區(qū)域5形成穩(wěn)定的化學濃度梯度。如圖2(b)所示，化學濃度梯度平滑，可用于細胞趨化性檢測。

圖2 細胞趨化性檢測裝置圖Fig.2 Physical graph of cell chemotactic deterction devices

2.2 集成軟件開發(fā)

2.2.1 LabVIEW開發(fā)平臺

NI公司的IMAQ Vision軟件包為圖像處理提供了完整的功能，它將4種功能整合到應用軟件中，為實現強大的圖像處理功能提供了可能，如灰度、彩色及二值化圖像的顯示、處理、形狀匹配、分析計算等[13]。界面圖如圖3(a)所示。

2.2.2 圖像采集和預處理

由于照明光線等因素的影響，圖像在采集、傳輸過程中，質量會變差，為了便于圖像分析和處理，需要對圖像進行預處理，使圖像更加清晰，凸顯幾何特征。USB顯微鏡采集的圖像是彩色圖像，圖像數據量較大。因此，首先利用NI公司的IMAQ Vision圖像處理軟件包中的相關函數將彩色圖像轉化為灰度圖像，即二值化處理。一幅灰度圖像就是一個對應大小的數字矩陣，矩陣中的0代表黑色，255代表白色，中間的數值部分代表灰色。二值化處理后，再進行高斯濾波去噪操作。二值化和濾波操作程序框圖如圖3(b)、圖3(c)所示，圖像處理結果如圖4(b)所示。

IMAQ Extract Single Color Plane：IMAQ提取單色平面；Red：紅色；IMAQ Create：IMAQ生成；IMAQ ReadFile：IMAQ讀取文件；Error in 2：錯誤輸入2；IMAQ MathLookup：IMAQ數學查找；IMAQ Write File 2：IMAQ寫文件2；Power 1/X：1/X次冪；Flie Path 3：文件路徑3；Progressing：進展；Pclose：關閉進程；Dilate：膨脹；Erode：腐蝕；IMAQ Morphology：IMAQ形態(tài)學；IVA Circle Image %gf：IVA中心圖像%gf；IMAQ Find Circles：IMAQ 發(fā)現中心；Image out：圖像輸出；Error out：錯誤輸出；Circles Detaction 1：中心探測1；Binary：二進制；Palette Type：選項板類型圖3 圖像處理程序框圖Fig.3 Blocking diagram of image processing program

噪聲處理后，隨即進行細胞圖像分割處理。圖像分割，即識別目標物體，根據圖像的一些特性對圖像像素進行分門歸類，然后根據類別劃分圖像區(qū)域，使其后的圖像分析、識別等高級處理階段所處理的數據量減少，同時又保留有關圖像結構特征的信息[14]。Canny邊緣檢測算法是較為理想的圖像分割算法，其基本原理是：首先采用二維高斯函數在任一方向上的一階導數作為噪聲濾波器，接著通過與圖像f(x,y)卷積進行濾波，最后尋找圖像梯度的局部放大值，對圖像邊緣進行判斷[15]。圖像邊緣檢測程序框圖如圖3(c)所示，圖像處理結果如圖4(c)所示。結果表明Canny算子邊緣檢測算法較好地區(qū)分了細胞，并將彼此不相連的細胞很好地劃分開來。

Canny算子分割細胞圖像后，可繼續(xù)使用形態(tài)學方法進行圖像后處理，進一步提高后期細胞計數的精度。形態(tài)學操作主要是對圖像進行膨脹、腐蝕等運算處理，完成去除圖像邊界干擾等任務。腐蝕和膨脹是最基本的形態(tài)操作，腐蝕收縮圖像，膨脹擴大圖像，它們互為對稱。利用這兩種運算可以分離相互粘接顆粒圖像[16]。形態(tài)學操作程序框圖如圖3(d)所示。形態(tài)學處理之后，可以得到細胞中心坐標等信息并用于后期細胞分區(qū)計數分析。細胞中心坐標信息提取的程序框圖如圖3(e)所示。

2.2.3 細胞圖像分區(qū)計數算法

圖像預處理之后，可以得到細胞的中心坐標，隨即可以根據細胞中心坐標評估細胞在微流體芯片主通道中的位置分布情況。具體操作過程為：①將微流體通道在寬度方向的像素值平均分為10等份；②依次掃描所有細胞的中心坐標，在掃描過程中，將每個細胞的坐標y值與芯片寬度像素均值作求取整數商運算，并根據細胞中心坐標位置將其劃分在10個區(qū)域之中。搜索窗掃描細胞圖像和每一區(qū)域的細胞數分布分別如圖4(d)、圖4(e)所示。

圖4 圖像處理結果Fig.4 Image processing results

2.2.4 實時細胞運動軌跡追蹤分析算法

細胞分區(qū)計數程序框圖如圖5(a)所示，其中row1-row10代表10個分區(qū)，num表示細胞個數，PER/%表示細胞占總數的百分比，Tab為繪制表格，sum為總和，ROW_1和ROW_2為例，表示區(qū)域1，2。在得到細胞的中心坐標后，可以根據細胞中心坐標計算細胞在實驗過程中的運動軌跡。由于在實驗中使用的細胞溶液濃度較低，在進行細胞遷移實驗時，細胞間的干擾很小。將每幅圖片中所有細胞的中心坐標提取出來，將相鄰兩幅圖片中的細胞中心坐標依次進行比較，計算坐標之間的距離，距離最小的兩個坐標即為同一個細胞在這兩幅圖片中的軌跡坐標。按此方法計算出90幅細胞圖片中所有細胞的軌跡坐標，以x坐標為橫坐標，以y坐標為縱坐標，繪制出細胞的移動軌跡曲線。細胞追跡程序框圖如圖5(b)所示。

在確定了細胞的移動軌跡后，即可根據運動軌跡計算細胞的趨化性指數CI和趨化性速度。CI指細胞朝向梯度的位移(梯度位移)與總遷移距離之間的比值；趨化性速度指總遷移距離與總遷移時間的比值。由細胞在第一幅圖片和最后一幅圖片中的y坐標計算其梯度方向位移，細胞的運動軌跡坐標計算其總遷移距離，兩者比值即為趨化性指數CI；再將總遷移距離比上總實驗時間即得趨化性速度。細胞CI和趨化性速度計算程序框圖如圖5(c)所示。

圖5 細胞趨化性分析程序框圖Fig.5 Block diagram of chemotaxis analysis program

(1)

(2)

式中：CI為趨化性指數；LGD為細胞朝向梯度的位移(梯度位移)；LAD為總遷移距離；VMS為運動速度；T為總遷移時間。

3 實驗驗證

3.1 微流體芯片

微流體芯片通過標準的光刻技術來制[17]。首先，利用AutoCAD設計光掩膜并使用高分辨率打印機打印光掩模。隨后將圖案化的光掩模與旋涂有SU-8光刻膠、直徑為80 mm的硅片相接觸，經過紫外曝光后產生約60 μm的光刻膠厚度。光刻基板制作好之后，將硅片放入細胞培養(yǎng)皿后倒入聚二甲基硅氧烷(polydimethysioxane，PDMS)膠水，并將培養(yǎng)皿放入200 ℃烤箱烘烤1 h。最后，采用氧氣等離子體處理PDMS芯片和玻璃基片60 s，改善PDMS和玻璃表面活性，然后貼合放置，使芯片永久性黏合[18]。實驗開始前，首先在微流體芯片中注入0.25 mg/mL纖連蛋白，靜置1 h后再注入0.4%的牛血清蛋白，以幫助細胞黏合在微流體通道上。

3.2 細胞制備與實驗

中性粒細胞通過人體全血經梯度密度離心法分離并存儲在37 ℃保溫箱中[19]。實驗時，先將中性粒細胞注入預先形成有白細胞介素化學梯度的單通道芯片，并每間隔10 s采集一幅細胞圖像，實驗時間為15 min。如圖6所示，實驗進行15 min后，中性粒細胞朝向白細胞介素濃度較高的區(qū)域發(fā)生了明顯地遷移運動。

圖6 不同時刻不同區(qū)域的細胞分布和細胞柱狀圖Fig.6 Cell distribution and histogram of different regions at different times

3.3 基于細胞分區(qū)計數及數字評分法的細胞趨化性能評估

為了更加簡便地分析細胞趨化性，基于分區(qū)計數方法開發(fā)了數字評分法。數字評分法原理：①計算2副圖像中每一個劃分區(qū)域中細胞數量；②根據實驗開始和結束時，同一區(qū)域中細胞數量的增減來評分。如果同一分區(qū)中的細胞數量在實驗開始和結束時的差值大于0，則得1分，表明有細胞進入這一區(qū)域；如果差值小于0，則得-1分，表明有細胞遠離這一區(qū)域；如果差值為0，則得0分；③分別計算1～5分區(qū)(低濃度白細胞介素)和6～10分區(qū)(高濃度白細胞介素)所有得分的總和。數字評分表如表1所示。表1表明6～10分區(qū)的細胞趨化性得分為16，明顯高于1～5分區(qū)的細胞趨化性得分-20；④將1～5分區(qū)得分的絕對值和6～10分區(qū)得分的值相加，以確定最后的趨化性得分為36。數字評分法將提供一種簡單的方法來評估細胞趨化運動能力。

表1 不同時刻不同區(qū)域的細胞數及數字得分分析

3.4 基于實時細胞運動軌跡的細胞趨化性能評估

通過分析采集的90幅細胞圖像，對部分細胞進行追蹤后繪制的軌跡曲線如圖7所示，圖7中曲線的坐標已經過歸一化處理。如圖7所示，中性粒細胞的移動軌跡都是朝向白細胞介素濃度較高的區(qū)域延伸。根據細胞的運動軌跡計算了它們的總遷移距離LAD和梯度位移LGD，進而計算了這些細胞的趨化性指數CI和平均運動速度VMS，如表2所示。從表2中可以看到，中性粒細胞在從低濃度白細胞介素區(qū)向高濃度白細胞介素區(qū)的移動過程中，其平均總遷移距離LAD為157.379 μm，平均梯度位移LGD為78 μm，CI為0.491，平均運動速度VMS為0.175 μm/s。

表2 細胞追跡數據

圖7 細胞移動軌跡曲線Fig.7 Cell trajectory curve

3.5 高血糖對中性粒細胞趨化性的影響實驗研究

膿毒癥是糖尿病常見的并發(fā)癥，研究表明膿毒癥會導致糖尿病患者體內中性粒細胞趨化性異常[20]。而糖尿病的典型癥狀就是血液葡萄糖含量過高。為探究高血糖和中性粒細胞遷移的關系，使用濃度分別為0(對照組)、1、5 mmol/L(人體血液中正常血糖濃度)，25 mmol/L的葡萄糖溶液孵育中性粒細胞，孵育時間設定為1 h。隨后使用便攜式細胞趨化遷移分析系統(tǒng)分析中性粒細胞運動情況，獲取CI和VMS數據。實驗結果如圖8所示。

圖8 不同濃度葡萄糖處理下的中性粒細胞遷移情況Fig.8 Neutrophil migration under different glucose concentrations

實驗結果顯示，經過5 mmol/L葡萄糖溶液處理過的中性粒細胞，VMS最大，LAD最大，CI最大，LGD最大；經過25 mmol/L葡萄糖溶液處理過的中性粒細胞，VMS最小，LAD最小，CI最小，LGD值最小； 1 mmol/L葡萄糖溶液處理過的中性粒細胞，其VMS、LAD、CI、LGD比沒經過葡萄糖處理的中性粒細胞略高。

實驗結果表明，低濃度葡萄糖會促進細胞趨化性，但是當葡萄糖濃度達到一定值時，葡萄糖反而會抑制細胞趨化性。在正常人體血糖濃度情況下，中性粒細胞的趨化性指數最佳，趨化性最好。在高血糖濃度下，中性粒細胞的趨化性指數最差，趨化性最差。

分析原因在于：低濃度葡萄糖會給細胞提供趨化能量，提高細胞趨化能力。但是當細胞處于高濃度葡萄糖時，細胞由于滲透壓等因素，影響了中性粒細胞活性，使得中性粒細胞趨化性變差。

4 結論

在USB顯微鏡、微流體芯片、計算機等構成的硬件基礎上，基于LabVIEW開發(fā)了便攜式細胞趨化遷移分析系統(tǒng)。使用NI公司的IMAQ Vision軟件包開發(fā)了一套集成軟件，其具有細胞運動圖像采集和預處理、細胞分區(qū)計數、細胞運動速度和趨化性指數分析功能。通過采集和分析中性粒細胞的運動圖像驗證了便攜式細胞趨化性檢測系統(tǒng)的檢測性能。同時，運用該系統(tǒng)探究了不同葡萄糖濃度對中性粒細胞趨化性能的影響，得出如下結論。

(1)高血糖環(huán)境會影響中性粒細胞的遷移運動能力，便攜式細胞趨化遷移分析系統(tǒng)提高了整個細胞趨化性研究裝置的集成化和便攜性。

(2)目前制約實驗效果的是LED光源和USB顯微鏡的分辨率，相信隨著采用新型的LED光源和高分辨率的USB顯微鏡，該系統(tǒng)會有更大的發(fā)展?jié)摿?。目前研究還停留在實驗室階段，還有待進一步完善，使得該裝置的應用范圍更廣，將其運用到如癌細胞的趨化研究中。