田凱兵，王亮，馬駿鵬，王科，張俊廷，吳震

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100070)

脊索瘤是一種起源于脊索組織殘余的低度惡性腫瘤，主要發(fā)生在骶尾部(29%)和顱底(32%～42%)，發(fā)病率為(0.080～0.089)/10萬(wàn)，患病率男性[(0.100～0.160)/10萬(wàn)]高于女性[(0.060～0.066)/10萬(wàn)][1]。脊索瘤對(duì)鄰近軟組織有局部侵襲性，對(duì)周圍骨骼破壞性明顯。顱底脊索瘤常包繞血管、腦神經(jīng)等重要結(jié)構(gòu)，患者常出現(xiàn)腦神經(jīng)功能障礙癥狀，包括頭痛、復(fù)視、視力下降、視野缺損、吞咽困難、面癱、感覺障礙等。徹底切除顱底脊索瘤較困難，往往會(huì)引起嚴(yán)重的并發(fā)癥，目前推薦的治療方案為盡可能手術(shù)切除輔助術(shù)后放療，術(shù)后腫瘤進(jìn)展是困擾患者和神經(jīng)外科醫(yī)師的難題[1-5]。近年來(lái)，盡管有突破性的創(chuàng)新方法應(yīng)用于顱底脊索瘤患者的臨床治療，但對(duì)該病分子水平的認(rèn)識(shí)仍不足[6]。人第10號(hào)染色體上缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)是一種腫瘤抑制蛋白，在多種惡性腫瘤中表達(dá)[7-9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)PTEN的表達(dá)與顱底脊索瘤骨質(zhì)侵襲程度有關(guān)[10]。本研究主要探討PTEN與顱底脊索瘤臨床病理學(xué)和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2008年1月至2015年11月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科接受手術(shù)治療的顱底脊索瘤患者53例，其中男30例、女23例，年齡11～62歲，平均(39±14)歲；腫瘤直徑18～85 mm，平均(46±14) mm；術(shù)前KPS評(píng)分40～90分，平均(80±13)分；術(shù)中腫瘤侵襲性切除26例，非侵襲性切除27例。隨訪時(shí)間3～62個(gè)月，無(wú)失訪。本組13例患者死亡，36例患者出現(xiàn)術(shù)后腫瘤進(jìn)展，中位PFS 17.83個(gè)月，3年無(wú)進(jìn)展生存率為49.50%。首次手術(shù)后，22例患者因腫瘤進(jìn)展再次手術(shù)，1例患者再次接受了2次手術(shù)，2例患者再次接受3次手術(shù)，1例患者由于多次術(shù)后腫瘤進(jìn)展而接受了另外4次手術(shù)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡11～62歲；②患者或家屬具備正常溝通、交流能力，配合術(shù)后隨訪；③患者及家屬均簽署了知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并顱內(nèi)外其他嚴(yán)重疾病，如腦血管病、心肌梗死；②合并其他部位、類型腫瘤者；③存在認(rèn)知、心理及精神障礙者。所有患者腫瘤石蠟樣本為術(shù)中腫瘤取出后30 min內(nèi)用10%甲醛固定，24 h后將樣本進(jìn)行石蠟包埋。冰凍組織樣本在術(shù)中取出后30 min內(nèi)儲(chǔ)存于液氮中。腫瘤組織石蠟樣本及冰凍樣本均存放于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心。

1.2主要試劑和儀器 封閉用山羊血清(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20081901)；PTEN抗體(英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：GR154649-2)；二抗Goat Anti-Rabbit IgG (H+L),HRP Conjugate(北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20020219)；DAB染液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：2040A0925)；TRIzol(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)：15596018)；帶有g(shù)DNA Erase的PrimeScript RT試劑盒(日本Takara公司，批號(hào)：AJF1731A)；聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒TaqManTMUniversal Master Mix Ⅱ,no UNG(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)：4440048)；TaqMan探針(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，PTEN：Hs02621230-g1，GAPDH：Hs02758991-g1)。

包埋儀(EG1150C)、免疫組織化學(xué)一體機(jī)(ASP，200S)、顯微鏡(DM2000)、切片機(jī)(RM2245)[徠卡顯微系統(tǒng)(上海)有限公司]；PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Applied Biosysterms公司，PCR System 9700)；PCR儀(瑞士羅氏公司，LightCyler480 PCR)。

1.3方法

1.3.1PTEN蛋白的檢測(cè) 石蠟樣本制作5 μm切片，試驗(yàn)開始前60 ℃烤片2 h，經(jīng)過脫蠟、水合，應(yīng)用檸檬酸鈉進(jìn)行抗原修復(fù)，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，抗原封閉，一抗(1∶400倍稀釋)4 ℃孵育12 h，二抗(1∶250倍稀釋)室溫孵育1 h，DAB染液顯色，復(fù)染后脫水、透明、封片[11]。

每例樣本由兩位病理科醫(yī)師分別隨機(jī)評(píng)估400倍鏡下的陽(yáng)性率及染色強(qiáng)度，依據(jù)染色強(qiáng)度、染色百分率進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度評(píng)分：0(無(wú)染色)，1(染色弱)，2(中等染色)，3(強(qiáng)染色)。染色百分率評(píng)分：0(0%)，1(<20%)，2(20%～50%)，3(>50%)。染色強(qiáng)度和百分率評(píng)分之和為最終評(píng)分，最終評(píng)分0～2分定義為低表達(dá)，3～6分定義為高表達(dá)[11]。

1.3.2PTEN基因的檢測(cè) 采用TRIzol提取mRNA，20 mg組織添加1 mL TRIzol，步驟如下：研磨組織制作組織勻漿，加TRIzol室溫放置10 min，4 ℃下12 000 ×g離心5 min，取上清液加入氯仿(1 mL TRIzol加入200 μL氯仿)，4 ℃下12 000×g離心15 min，取上層水相加入異丙醇(1 mL TRIzol加入0.5 mL異丙醇)室溫放置10 min，4 ℃下12 000×g離心10 min，棄去上清液，75%乙醇(1 mL TRIzol加入1 mL 75%乙醇)洗滌RNA，4 ℃下7 000×g離心5 min，棄去上清液，晾干5～10 min，無(wú)菌純水溶解。

使用帶有g(shù)DNA Erase的PrimeScript RT試劑盒依據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，依據(jù)說(shuō)明書配置溶液后置于PCR擴(kuò)增儀去除組織DNA并逆轉(zhuǎn)錄。使用TaqManTMUniversal Master Mix Ⅱ,no UNG實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒，TaqMan探針法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。靶片段在10 μL系統(tǒng)中擴(kuò)增。反應(yīng)過程如下：95 ℃ 10 min，40個(gè)循環(huán)：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s。結(jié)果取每個(gè)樣本2-ΔΔCT值代表PTEN基因表達(dá)水平進(jìn)行分析[12]，腫瘤2-ΔΔCT值高代表腫瘤中PTEN表達(dá)水平高，樣本2-ΔΔCT值計(jì)算過程如下：ΔCT=CTPTEN-CTGAPDH；2-ΔΔCT=2-(ΔCT-ΔCT所有樣本均數(shù))。

1.4臨床評(píng)價(jià) 收集患者的臨床資料，包括性別、年齡、術(shù)前KPS評(píng)分、腫瘤直徑、侵襲類型、分期、分隔、質(zhì)地、切除方式、病理類型。其中腫瘤質(zhì)地分為軟和硬(后者包括軟韌不均成分的腫瘤)，腫瘤分隔分為瘤內(nèi)無(wú)纖維分隔和有纖維分隔。隨訪主要在門診患者中進(jìn)行，對(duì)少數(shù)不能就診的患者采用電話隨訪。所有組織學(xué)標(biāo)本均由至少兩名有5年以上脊索瘤分析經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)醫(yī)師觀察，根據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)分型進(jìn)行病理分型(包括經(jīng)典型、軟骨樣型和未分化型，本研究樣本中無(wú)未分化型)[13]。所有磁共振成像影像資料由兩位具備5年以上顱底腫瘤診斷經(jīng)驗(yàn)的放射科醫(yī)師使用影像存檔與通信系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估：記錄腫瘤直徑；侵襲性分為骨侵襲性(侵犯周圍骨)和非骨侵襲性；分期根據(jù)是否存在硬腦膜破壞而定；切除方式包括侵襲性切除(切除程度>90%)和非侵襲性切除(切除程度≤90%)。術(shù)后腫瘤進(jìn)展定義為殘余腫瘤再生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)。分析患者PTEN蛋白、PTEN基因表達(dá)水平與以上臨床病理學(xué)及無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)的關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1PTEN蛋白表達(dá)結(jié)果 PTEN主要分布于基質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，PTEN蛋白低表達(dá)26例，高表達(dá)27例。PTEN蛋白高表達(dá)與低表達(dá)者的年齡、術(shù)前KPS評(píng)分、腫瘤直徑比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(34±15)歲比(38±14)歲,t=1.207,P=0.233；80(70,90)分比75(70,80)分，Z=-1.156,P=0.248；(43±16) mm比(48±10) mm,t=1.309,P=0.196]。Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，PTEN蛋白低表達(dá)者術(shù)后PFS較高表達(dá)者顯著縮短[(9.00±1.91)個(gè)月比(35.00±3.18)個(gè)月](P<0.05)。見圖1。

PTEN：人第10號(hào)染色體上缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物

PTEN蛋白表達(dá)在顱底脊索瘤患者不同性別、分期、分隔、切除方式及病理類型方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但PTEN蛋白表達(dá)在不同侵襲類型、質(zhì)地方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，非骨質(zhì)侵襲腫瘤中PTEN蛋白高表達(dá)率低于骨質(zhì)侵襲腫瘤，質(zhì)地軟的腫瘤中PTEN高表達(dá)率高于質(zhì)地硬的腫瘤(P<0.05)。見表1、圖2。

表1 顱底脊索瘤PTEN蛋白表達(dá)結(jié)果 [例(%)]

2.2PTEN基因表達(dá)結(jié)果 PTEN基因的表達(dá)水平與患者年齡、腫瘤直徑、術(shù)前KPS評(píng)分無(wú)關(guān)性(r=-0.210，P=0.128；r=0.080，P=0.554；r=-0.070，P=0.643)；不同性別、侵襲類型、分期、分隔、質(zhì)地、切除方式、病理類型間PTEN基因表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 顱底脊索瘤患者PTEN基因表達(dá)結(jié)果

3 討 論

脊索瘤是一種少見的慢性低度惡性腫瘤，以骶尾部和顱底較常見。脊索瘤多呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，對(duì)周圍骨組織破壞嚴(yán)重，術(shù)后易復(fù)發(fā)，患者遠(yuǎn)期預(yù)后差，給臨床治療帶來(lái)很大挑戰(zhàn)[1]。目前尚無(wú)針對(duì)脊索瘤的有效藥物治療方案，為明確相關(guān)作用因子和通路，包含較多樣本的蛋白質(zhì)、基因水平的研究亟待開展，本研究基于前期研究結(jié)果，著重探討在顱底脊索瘤中PTEN的蛋白和基因表達(dá)水平。

2a:骨侵襲腫瘤，染色較淺，陽(yáng)性細(xì)胞多，陽(yáng)性部位主要位于胞質(zhì)和細(xì)胞間基質(zhì)；2b:非骨侵襲腫瘤，染色深，可見陽(yáng)性細(xì)胞核，所有腫瘤細(xì)胞染色；2c:質(zhì)地軟的腫瘤，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞間基質(zhì)中呈強(qiáng)陽(yáng)性染色；2d:質(zhì)地硬的腫瘤，染色較淺，偶見陽(yáng)性染色；PTEN：人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物

PTEN是一種常見的腫瘤抑制基因，其翻譯產(chǎn)物 PTEN蛋白在細(xì)胞脂質(zhì)信號(hào)磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸的去磷酸化過程中起作用，影響細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化等過程。此外，PTEN抑制其他途徑，如哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)激酶靶點(diǎn)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，也可部分調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)活性[14]。PTEN在多種腫瘤中發(fā)揮作用，包括前列腺癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤、胰腺黏液性非腫瘤性囊腫和骨髓相關(guān)腫瘤[15-16]。近年來(lái)，脊索瘤中也有PTEN表達(dá)的報(bào)道[17-18]。本研究結(jié)果證實(shí)，PTEN蛋白與腫瘤骨質(zhì)侵襲性和質(zhì)地及PFS顯著相關(guān)，PTEN基因與患者臨床病理學(xué)及PFS無(wú)相關(guān)性，提示在顱底脊索瘤中PTEN發(fā)揮作用主要通過其蛋白表達(dá)調(diào)控而非基因表達(dá)。

PTEN蛋白低表達(dá)與腫瘤的侵襲性相關(guān)。Lee等[14]研究證實(shí)脊索瘤中PTEN雜合性缺失可導(dǎo)致脊索瘤細(xì)胞侵襲性增加，本研究結(jié)果與本課題組前期研究結(jié)果一致[10]，PTEN蛋白表達(dá)與顱底脊索瘤骨質(zhì)侵襲性相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，PTEN無(wú)表達(dá)和mTOR表達(dá)與骶尾部脊索瘤侵襲性及臨床預(yù)后相關(guān)[11]。另外，Wang等[19]發(fā)現(xiàn)PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)在PTEN減少的乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中被激活，推測(cè)PI3K/Akt通路的激活與腫瘤的侵襲和遷移有關(guān)。Puzio-Kuter等[20]研究證實(shí)，mTOR通路在前列腺癌的侵襲性中起重要作用。由此推斷，PTEN也可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR通路間接調(diào)控顱底脊索瘤的侵襲性，腫瘤中PTEN高表達(dá)，PI3K/Akt/mTOR通路受到抑制，腫瘤對(duì)周圍骨質(zhì)侵襲能力增強(qiáng)，而腫瘤中PTEN低表達(dá)PI3K/Akt/mTOR通路激活，導(dǎo)致腫瘤侵襲能力減弱。

雖然PTEN表達(dá)與腫瘤組織質(zhì)地的關(guān)系較少見報(bào)道，但本研究結(jié)果顯示，質(zhì)地軟的PTEN蛋白高表達(dá)率高于質(zhì)地硬的腫瘤。而本課題組前期研究證實(shí)腫瘤質(zhì)地是影響患者術(shù)后PFS的潛在風(fēng)險(xiǎn)因素，質(zhì)地軟的腫瘤患者PFS較質(zhì)地硬的腫瘤患者更長(zhǎng)[21]，其原因可能是質(zhì)地軟的腫瘤中PTEN蛋白高表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤增殖較質(zhì)地硬的腫瘤慢而PFS延長(zhǎng)。不同質(zhì)地腫瘤中PTEN蛋白表達(dá)差異的原因可能是質(zhì)地軟的腫瘤中PTEN蛋白高表達(dá)，對(duì)周圍骨質(zhì)侵襲性高，腫瘤內(nèi)骨質(zhì)侵襲完全而腫瘤質(zhì)地軟；而質(zhì)地硬的腫瘤中PTEN蛋白表達(dá)水平低，對(duì)周圍骨質(zhì)的侵襲性弱，骨質(zhì)破壞不全導(dǎo)致腫瘤內(nèi)部骨性成分多而質(zhì)地偏硬。

另外，PTEN蛋白低表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。Yang等[18]對(duì)脊柱脊索瘤中PTEN表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，PTEN低表達(dá)患者術(shù)后PFS和生存期均顯著縮短。Lee等[14]發(fā)現(xiàn)脊索瘤中PTEN雜合性缺失導(dǎo)致PTEN腫瘤抑制作用下降，而細(xì)胞增殖加快。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，顱底脊索瘤PTEN蛋白低表達(dá)者PFS顯著縮短，術(shù)后腫瘤進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)增加，即PTEN在顱底脊索瘤中的表達(dá)降低可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。關(guān)于PTEN抑制脊索瘤細(xì)胞增殖的分子機(jī)制較少見報(bào)道，Michmerhuizen等[22]研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt/mTOR通路抑制劑可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖并促進(jìn)其凋亡，而PTEN是針對(duì)該通路的抑癌基因，由此推斷，顱底脊索瘤中PTEN低表達(dá)可降低對(duì)PI3K/Akt/mTOR通路的抑制作用，減弱對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的抑制作用、減少凋亡，進(jìn)而加速腫瘤進(jìn)展。

本研究結(jié)果表明，PTEN蛋白在顱底脊索瘤中的表達(dá)與腫瘤骨質(zhì)侵襲性、質(zhì)地及腫瘤進(jìn)展相關(guān)，而骨質(zhì)侵襲性、腫瘤進(jìn)展是顱底脊索瘤的重要特性，因此進(jìn)一步研究PTEN在顱底脊索瘤中發(fā)揮作用的分子機(jī)制具有重要臨床意義。但本研究也存在不足之處，納入例數(shù)較少，PTEN在顱底脊索瘤中更多的作用及相關(guān)機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

綜上所述，非骨質(zhì)侵襲腫瘤中PTEN蛋白高表達(dá)率低，質(zhì)地軟的腫瘤PTEN蛋白高表達(dá)率高，PTEN蛋白低表達(dá)的顱底脊索瘤患者PFS顯著縮短。