張 毅，馬丹丹，龔 齊，黃 華，曹 定，尚作宏，張 翌

0 引 言

結(jié)腸癌是胃腸道中常見的惡性腫瘤[1]。近年來，隨著飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣的變化,其發(fā)病率逐漸增加[2]。臨床上結(jié)直腸癌主要采用手術(shù)、化療、放療及生物靶向等方法治療[3]。但缺乏有效的分子標(biāo)記物輔助診斷及判斷預(yù)后的問題亟待解決。因此，探究結(jié)腸癌生長、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制是提高結(jié)腸癌患者診斷及預(yù)后的關(guān)鍵。

蓮房原花青素(procyanidins from lotus seedpod,LSPCs)是從睡蓮科植物蓮的成熟花托中分離的主要活性成分之一，是由兒茶素或表兒茶素以 C4-C8 或 C4-C6 鍵連接而成的 2-4 聚體所組成[4]。業(yè)已證實(shí) LSPCs 體內(nèi)外均具有強(qiáng)的清除自由基和抗氧化活性，能改善老齡及各種衰老模型動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力，抗腫瘤、改善心血管功能等，而蓮房原花青素作為公認(rèn)的強(qiáng)抗氧化劑和自由基清除劑，對炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激具有顯著調(diào)控作用[5]。但是，目前關(guān)于蓮房原花青素在結(jié)腸癌中的抗癌作用目前仍不清楚。

RAC1是普遍表達(dá)的Rho GTP酶，位于人染色體7p22,作為小分子GTP酶蛋白,已被證實(shí)參與多種腫瘤的進(jìn)展[6]。已有大量研究表明,PI3K/AKT信號(hào)通路在大多數(shù)癌癥包括結(jié)腸癌中被激活[7]。比如，UNC5B-AS1通過下調(diào)miR-622并抑制AMPK/PI3K/AKT通路從而抑制結(jié)腸癌的生長和轉(zhuǎn)移[8]。此外，姜黃素通過使細(xì)胞中mTOR/PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)途徑失活從而抑制結(jié)腸直腸癌的生長[9]。但蓮房原花青素能否通過調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路的傳導(dǎo)從而影響結(jié)腸癌的進(jìn)展尚待探究。

鑒于以上研究基礎(chǔ)，我們假設(shè)蓮房原花青素在結(jié)直腸癌中發(fā)揮重要作用，通過調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路的傳導(dǎo)從而影響結(jié)腸癌的進(jìn)展尚待探究，以期為蓮房原花青素在結(jié)直腸癌中的抗腫瘤作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞株(HCT116)購自AmericanTypeCultureCollection(ATCC, Rockville, MD, USA)。將這些細(xì)胞用含10%胎牛血清(fetalbovineserum, FBS) (ThermoFisherScientific,MA, USA)和1%青霉素/鏈霉素(Invitrogen, CA, USA)的RPMI1640 (ThermoFisherScientific, MA, USA)培養(yǎng)液、置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞的對數(shù)生長期采用0.25%胰蛋白酶(ThermoFisher, HyClone, Utah, USA)進(jìn)行消化傳代。

RAC1低表達(dá)質(zhì)粒以及相應(yīng)的陰性對照組均由GenePharma (Shanghai, China)獲得。取HCT116細(xì)胞，以3×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置37 ℃、5%CO2溫育培養(yǎng)24 h后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。根據(jù)供應(yīng)商的說明書用Lipofectamine? 3000 (Invitrogen; ThermoFisherScientific, Inc.) 轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞。用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。細(xì)胞在37 ℃和5% CO2條件下孵育24 h，待進(jìn)一步分析。

1.2實(shí)驗(yàn)分組對照組不予處理，實(shí)驗(yàn)組分別給予10 、20、40 μmol/L濃度的LSPCs干預(yù)24 h后，行CCK-8，Transwell及Western blot檢測細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲能力。HCT116細(xì)胞對照組不予處理，si-RAC組在給予確認(rèn)敲低后24 h行不同的檢測。

1.3RT-PCR實(shí)驗(yàn)根據(jù)制造商的方案(Invitrogen,Waltham,MA,USA)，使用TRIzol試劑提取組織或細(xì)胞總RNA。我們用Nanodrop-spectrophotometer檢測RNA濃度和純度。根據(jù)制造商的方案，我們使用PrimeScript-RT Kit(Madison,WI,USA)從1 μg總RNA中合成互補(bǔ)DNA(cDNA),然后我們使用SYBR?Premix-Ex-TaqTM(Takara, TX, USA)和ABI7300系統(tǒng)進(jìn)行quantitative reverse transcription-polymerase chainreaction (qRTPCR)。PCR體系的總體積為30 μL，每個(gè)樣品含有300ng cDNA。擴(kuò)增程序是在95 ℃下初始變性10 min，然后進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，即95 ℃10 s，60 ℃30 s，85 ℃20 s。我們將所有熒光數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為相對定量，GAPDH為RAC1的內(nèi)參。重復(fù)所有RT-PCR反應(yīng)3次。引物序列如下：Caspase-3前引物：GGATATGGCTCAGGGCAATG ，后引物：CAATTGGGAGTGGTAGGTC；Bax前引物：GGATTCCAGCCCACAGAACG，后引物：ACATTCTCGCTTCAGGGTGAA；Bcl-2前引物：GGCCTGCTGTTGGATCCTCTC，后引物：TCA TCTTGAGGGTCCGTCA；GAPDH前引物：GCTCTCTGCTCCTCCTGTTC，后引物：ACGACCAAATCCGTTGACTC。

1.4CCK-8法取對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞使用胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度至2×103/mL后，接種于96孔板，每孔100 μL細(xì)胞懸液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。之后將96孔板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后每個(gè)孔加入CCK8溶液(湖北百奧斯生物科技有限公司)10 μL，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中孵育1 h。終止培養(yǎng)后，將96孔板置于酶標(biāo)儀中，測定450 nm波長各孔的吸光度(A值)。此后在第24、48、72小時(shí)各測定一次細(xì)胞的吸光度。

1.5Transwell assay檢測細(xì)胞的侵襲能力按Chemicon公司的ECM550系列說明書要求，制備有基質(zhì)膠的Transwell小室(Corting, NY, USA)，將HCT116細(xì)胞分別接種200 μL于Transwell小室內(nèi)，調(diào)整密度為5×105個(gè)/mL，24孔板下室內(nèi)分別加入700 μL含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，吸除小室內(nèi)的培養(yǎng)液，用棉簽輕輕擦去小室內(nèi)的基質(zhì)膠，用PBS清洗1遍后風(fēng)干，將小室浸泡于甲醛內(nèi)20 min后，用PBS清洗1遍后風(fēng)干，將小室浸泡于結(jié)晶紫中染色20 min，染色后，用PBS清洗3遍后風(fēng)干，于正置顯微鏡(Olympus,Tokyo,Japan)下成像。

1.6Western blot方法待細(xì)胞處理完畢，棄培養(yǎng)基，加入蛋白裂解液(Roche)并分離總蛋白。取50 g 總蛋白加樣于12%聚丙烯酰胺凝膠中，100 V電泳2 h。然后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，TBST洗膜3次，每次10 min，Anti-Rac1 antibody(ab155938,1∶1000,abcam,MA,USA)Anti-PI3K antibody (ab191606,1∶1000,abcam,MA,USA),Anti-PI3k(phosphoY607)antibody (ab182651,1∶1000,abcam,MA,USA),Anti-pan-AKT antibody (ab18785,1∶1000,abcam,MA,USA)，Anti-AKT (phospho T308) antibody (ab38449,1∶1000,abcam,MA ,USA)在4 ℃下孵育過夜。在TBST洗膜后，在室溫下將膜用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗羊抗兔(ab150077,1∶3000,1∶1000,abcam,MA,USA)孵育1 h。TBST洗膜3次，每次10 min。最后用Western blot專用試劑(Invitrogen公司)顯色成像，采用Image J分析各蛋白灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 蓮房原花青素抑制了結(jié)腸癌的增殖，促進(jìn)其凋亡CCK8實(shí)驗(yàn)表明蓮房原花青素干預(yù)后細(xì)胞的增殖水平顯著下降，并且時(shí)間越長，增殖能力越弱(P<0.05)；流式凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蓮房原花青素干預(yù)后細(xì)胞的凋亡水平較對照組顯著增加(P<0.05)，見圖1。RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測蓮房原花青素對細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，蓮房原花青素干預(yù)可以顯著下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2，并且顯著上調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平，同時(shí)增加Caspase-3表達(dá)(P<0.05)。見表1。

a：CCK8實(shí)驗(yàn)；b:流式凋亡實(shí)驗(yàn)圖1 蓮房原花青素抑制了結(jié)腸癌的增殖，促進(jìn)其凋亡Figure 1 Lotus proanthocyanidin inhibited the proliferation of colon cancer and promoted its apoptosis

表1 RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)Table 1 Expression of Bcl-2, Bax and caspase-3 detected by RT-PCR

2.2蓮房原花青素抑制結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移、侵襲細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)表明蓮房原花青素干預(yù)的結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)量顯著低于對照組，同時(shí)蓮房原花青素干預(yù)的結(jié)腸癌細(xì)胞遷移能力較對照組明顯減弱，且呈濃度依賴效應(yīng)(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 蓮房原花青素抑制結(jié)腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移Figure 2 Inhibition of metastasis and invasion of colon cancer by lotus proanthocyanidins

表2 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)腸癌細(xì)胞遷移、侵襲Table 2 Transwell assay for detection of migration and invasion of colon cancer

2.3蓮房原花青素抑制結(jié)腸癌RAC1/PI3K/AKT的表達(dá)Western blot實(shí)驗(yàn)顯示，與對照組比較，蓮房原花青素能夠抑制RAC1/PI3K/AKT的表達(dá)(P<0.01)，隨LSPCs濃度增加，抑制作用增強(qiáng)。見圖3。

2.4抑制RAC1減弱了結(jié)腸癌的進(jìn)展和PI3K/AKT的活化CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組比較，敲低RAC1后細(xì)胞的增殖能力顯著下調(diào)(P<0.05)，且同時(shí)流式細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果證實(shí)敲低RAC1后細(xì)胞凋亡顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。Transwell實(shí)驗(yàn)表明，與對照組比較，敲低RAC1明顯下調(diào)了HCT116細(xì)胞的遷移與侵襲(P<0.05)，見表3。Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較敲低RAC1后，PI3K/AKT的活化顯著降低(P<0.05)。見圖4。

表3 細(xì)胞凋亡及細(xì)胞遷移、侵襲改變Table 3 Lotus proanthocyanidins inhibit the expression of Rac1/PI3K/Akt in colon cancer (The effect of lotus proanthocyanidins on Rac1/PI3K/Akt was detected by Western blot

1：對照組；2： LSPCs低濃度組；3： LSPCs中濃度組；4： LSPCs高濃度組與對照組比較，*P<0.05圖3 蓮房原花青素抑制結(jié)腸癌RAC1/PI3K/AKT的表達(dá)Figure 3 Lotus proanthocyanidins inhibit the expression of Rac1/PI3K/Akt in colon cancer

a：CCK8實(shí)驗(yàn)；b：Western blot檢測與HCT116細(xì)胞對照組比較，*P<0.05圖4 抑制RAC1減弱了結(jié)腸癌的進(jìn)展和PI3K/AKT的活化Figure 4 Inhibition of Rac1 attenuated colon cancer progression and PI3K/Akt activation

3 討 論

結(jié)腸癌是常見的發(fā)生于結(jié)腸部位的消化道惡性腫瘤[10]。其早期癥狀不明顯，到中晚期時(shí)伴隨著病灶轉(zhuǎn)移，貽誤了最佳治療時(shí)期，因此提高結(jié)腸癌的早期診斷率、尋找新的分子治療靶標(biāo)迫在眉睫。LSPCs是從睡蓮科植物蓮的成熟花托中分離的主要活性成分之一，是由兒茶素或表兒茶素以 C4-C8 或 C4-C6 鍵連接而成的 2-4 聚體所組成[11]。業(yè)已證實(shí) LSPCs 體內(nèi)外均具有強(qiáng)抗腫瘤、改善心血管功能等[12]。鑒于以上研究，我們大膽猜測，LSPCs在結(jié)腸癌中也發(fā)揮重要的抗癌作用。令人驚喜地的是，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，LSPCs在結(jié)腸癌中具有顯著的抑制腫瘤惡性生物學(xué)行為的作用，促進(jìn)了結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖、遷移與侵襲，是結(jié)腸癌分子靶向治療的潛在靶點(diǎn)。

已知LSPCs具有極強(qiáng)的抗氧化活性，是一種氧自由基清除劑和脂質(zhì)過氧化抑制劑。研究表明LSPCs為抗氧化劑保健藥物，已在較大范圍內(nèi)使用[13]。研究報(bào)道蓮房原花青素可抑制肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，且可能具有一定的抗肝損傷作用，其作用機(jī)理與蓮房原花青素對活性氧自由基的清除作用及其強(qiáng)還原性及螯合金屬離子的特性有關(guān)[14]。但是，目前關(guān)于LSPCs在抗腫瘤中的作用的仍不清楚。近年來，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)LSPCs導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞自噬和凋亡[15]。但是LSPCs在結(jié)腸癌中的作用仍不清楚。本研究的結(jié)果初步探索發(fā)現(xiàn)LSPCs在結(jié)腸癌中具有顯著的抑制腫瘤惡性生物學(xué)行為的作用，促進(jìn)了結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖、遷移與侵襲。并且，本研究還初步明確了LSPCs抑制結(jié)腸癌惡性生物學(xué)行為的可能機(jī)制，是通過抑制RAC1/PI3K/AkT信號(hào)傳導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)的。

RAC1是GTPases Rho家族的重要成員之一，有研究報(bào)道,結(jié)腸癌細(xì)胞中RAC1陽性表達(dá)明顯升高,且其結(jié)腸癌浸潤和轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能與CDC42、smad4、ERK/JNK等信號(hào)的激活,繼而促進(jìn)EMT有關(guān)[16-17]。葉志強(qiáng)等人的報(bào)道顯示，通過抑制RAC1的表達(dá), 可以有效阻止GTPase的激活, 從而抑制結(jié)腸癌的遷移及侵襲。同時(shí)，解娜等人的研究也證實(shí)沉默RAC1的表達(dá)能減慢結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖并抑制裸鼠移植瘤的生長[18]。此外，前人的研究已表明，RAC1/PI3K/AKT信號(hào)通路參與多種腫瘤的進(jìn)展，例如，Neo1通過激活RAC1/PI3K/AKT途徑正向調(diào)控ZEB1的表達(dá)從而促進(jìn)胃癌的增殖，運(yùn)動(dòng)和黏附[19]。屈恒義等人的研究也表明，香煙煙霧通過激活RAC1/Smad2和RAC1/PI3K/AkT信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn)肺癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[20]。與上述研究結(jié)論基本相符,在本研究中，我們發(fā)現(xiàn),RAC1在結(jié)腸癌中的表達(dá)顯著上調(diào)，同時(shí)抑制RAC1明顯減弱了結(jié)腸癌的進(jìn)展和PI3K/AKT的活化,這些結(jié)果表明RAC1過表達(dá)可能參與結(jié)腸癌細(xì)胞惡性演進(jìn)的生物學(xué)過程。

綜上所述，我們的研究證實(shí)了LSPCs在結(jié)腸癌中具有顯著的抑制腫瘤惡性生物學(xué)行為的作用，促進(jìn)了結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖、遷移與侵襲，其具體機(jī)制可能是通過抑制RAC1/PI3K/AkT信號(hào)傳導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)。這為結(jié)腸癌的治療和預(yù)后提供了新的干預(yù)靶點(diǎn), 也為進(jìn)一步免疫生物過繼治療提供了必要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但更多地分子機(jī)制還需更加深入地探究。