陳 勇，史利寧，胡毓安，曹 進(jìn)，孫 寧，姚新月，張 靜，王 穎，范 明，王衛(wèi)萍

0 引 言

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa ，PA)是醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌，隨著碳青霉烯類藥物的廣泛和不合理使用，耐碳青霉烯PA日益增多[1-2]，尤其是多重耐藥甚至是泛耐PA的數(shù)量和比例迅速上升[3]，給PA所致的感染的治療帶來了極大的困難[4-6]。臨床現(xiàn)有可選抗菌藥物少，治療難度高，嚴(yán)重影響患者的轉(zhuǎn)歸。由PA所引起的醫(yī)院內(nèi)感染達(dá)30%[7]，其中呼吸道感染率最高，死亡率可高達(dá)61.1%[8]。PA碳青霉烯耐藥主要與OprD2孔蛋白缺乏相關(guān)[9]。但研究人員對(duì)全球碳青霉烯耐藥PA的流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)碳青霉烯酶的PA所占比例正急劇增高[10]，不同的酶其流行的區(qū)域不同。本文收集了泛耐藥PA，調(diào)研碳青霉烯酶的存在情況，并對(duì)其耐藥分子機(jī)制及其臨床分布進(jìn)行探討，為預(yù)防和控制耐藥菌株的傳播以及臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源收集了東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院2018年7-12月的臨床首次分離的泛耐藥PA112株，-20 ℃凍存待用。

1.2主要試劑和儀器BHI培養(yǎng)基(英國OXOID公司)、MiSeq測(cè)序儀(美國Illumina公司)、DNA Marker2000(上?；鄯f公司)、Qiagen Large-Construct Kit(德國QIAGEN公司)、PCR儀(美國ABI公司)、瓊脂糖凝膠電泳儀(深圳博偉爾公司)、凝膠成像系統(tǒng)(英國Syngene公司)。

1.3菌株鑒定用16S rRNA進(jìn)行菌種鑒定，在BHI平板上挑取單個(gè)菌落，置于100 μL的去離子水中，100 ℃ 10 min 裂解菌體，13 000×g離心1 min，取上清作為模板，16S rRNA基因擴(kuò)增參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送去上海英捷維基公司測(cè)序。

1.4碳青霉烯酶的檢測(cè)及其類型用改良Carba NP 法檢測(cè)碳青霉烯酶及其類型[12-13]。取甘油菌接種于新鮮的肉湯，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至A600值約1.0，取1 mL菌液4 ℃離心集菌，用20 mmol/L Tris-HCl(pH7.8)清洗2遍后，用500 μL 20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.8)重懸菌體，在冰浴中超聲5 s，后4 ℃下10 000×g離心5 min ，取50 μL上清分別與底物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ混合，37 ℃孵育1～2 h檢測(cè)碳青霉烯酶及其類型。底物Ⅰ為酚紅+硫酸鋅，底物Ⅱ?yàn)閬啺放嗄?酚紅+硫酸鋅，底物Ⅲ為亞胺培南+酚紅+硫酸鋅+他唑巴坦，底物Ⅳ為亞胺培南+酚紅+硫酸鋅+EDTA，底物Ⅴ為亞胺培南+酚紅+硫酸銨+他唑巴坦+EDTA。

1.5碳青霉烯酶基因的檢測(cè)用PCR法檢測(cè)碳青霉烯酶基因。根據(jù)文獻(xiàn)查閱各種碳青霉烯酶耐藥基因引物信息，部分引物序列見表1，以PA全基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物過1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.6質(zhì)粒測(cè)序與生物信息學(xué)分析使用QiagenLarge-Construct Kit從PA14057中提取質(zhì)粒DNA[14]，并將攜帶blaKPC基因的質(zhì)粒命名為p14057-KPC。用高通量全基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，用RAST 2.0與UniProtKB/Swiss-Pro數(shù)據(jù)庫和RefSeq數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST搜索，預(yù)測(cè)開放閱讀框(ORFs)和假基因。 用BLASTP和BLASIN對(duì)UniProt和NR庫進(jìn)行注釋。 用Inkscape 0.48.1繪制基因結(jié)構(gòu)圖，對(duì)測(cè)序的質(zhì)粒全序進(jìn)行生物信息學(xué)分析，繪制質(zhì)粒圖譜。

1.7質(zhì)粒同源性分析根據(jù)上述質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果，針對(duì)質(zhì)粒骨架區(qū)(復(fù)制區(qū)、穩(wěn)定區(qū)和接合區(qū))分別設(shè)計(jì)三個(gè)引物，見表2；并對(duì)其他產(chǎn)KPC的PA進(jìn)行質(zhì)粒同源性分析。PCR條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物過1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

2 結(jié) 果

2.1 菌株鑒定經(jīng)16S rRNA菌種鑒定，收集112株 均為PA。

2.2CarbaNP產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)112株中20株產(chǎn)A類碳青霉烯酶，占17.9%。5株產(chǎn)B類碳青霉烯酶，占4.46%。

2.3碳青霉烯酶基因的檢測(cè)產(chǎn)A類碳青霉烯酶的20株菌均檢出blaKPC基因，與CarbaNP產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。5株產(chǎn)B類碳青霉烯酶中，有2株檢出blaIMP、基因,未檢出blaVIM、blaDIM、blaSIM基因。blaKPC基因PCR結(jié)果見圖1。

M:DNA marker；1、2：產(chǎn)A類碳青霉烯酶的菌株，編號(hào)分別為14057,21005；3：不產(chǎn)A類碳青霉烯酶的菌株，編號(hào)為15012圖1 碳青霉烯酶基因檢測(cè)結(jié)果Figure 1 Carbapenemase gene test results

2.4p14057-KPC質(zhì)粒全序測(cè)定與生物信息學(xué)分析

2.4.1 p14057-KPC的概述運(yùn)用高通量測(cè)序[15]，該質(zhì)粒大小為51 663 bp的環(huán)狀DNA，平均G+C含量為59.2%，含有69個(gè)開放閱讀框，由骨架區(qū)和外源插入?yún)^(qū)兩部分組成。骨架區(qū)長(zhǎng)度約為40.6 kb ，與公共序列數(shù)據(jù)庫中可用的DNA序列相似性較低(同源性<20%)，含有復(fù)制區(qū)(repA)、穩(wěn)定區(qū)(potF等)和接合區(qū)(virB6等)。該質(zhì)粒含有單個(gè)外源插入?yún)^(qū)，即blakpc-2區(qū)域。見圖2。

基因由箭頭表示，骨架區(qū)和外源插入?yún)^(qū)分別以黑色和灰色突出顯示圖2 p14057-KPC示意圖Figure 2 Schematic map of p14057-KPC

2.4.2p14057-KPC的外源插入?yún)^(qū)外源插入?yún)^(qū)即blakpc-2區(qū)域。按順序分別由3.5 kb 的Tn1403骨架區(qū)，6.5 kb的ΔTn6296區(qū)和IS6100元件構(gòu)成。見圖3。

基因用箭頭表示。 基因，移動(dòng)元素和其他功能基于功能分類進(jìn)行著色。 陰影表示同源區(qū)(> 95%核苷酸同一性)。 括號(hào)中的數(shù)字表示相應(yīng)質(zhì)粒內(nèi)的核苷酸位置。 用于參考的Tn6296和Tn1403的登錄號(hào)分別是FJ628167和AF313472圖3 p14057-KPC的外源插入?yún)^(qū)，并與相關(guān)遺傳內(nèi)容進(jìn)行比較Figure 3 The accessory regions of p14057-KPC and comparison to related genetic contents

2.5質(zhì)粒同源性分析結(jié)果顯示：產(chǎn)KPC的20株菌中有17株菌與p14057-KPC相似質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，占85%，其余菌株有待進(jìn)一步研究。見圖4。

1、2:均為產(chǎn)KPC的菌株，編號(hào)分別為14057,21005； M:DNA marker圖4 質(zhì)粒同源性分析Figure 4 Plasmid homology analysis

2.6產(chǎn)KPC PA的臨床分布共20株菌產(chǎn)KPC，占17.9%。其中ICU 病房16株，占80.0%；非ICU 病房4株，占20.0%。

3 討 論

KPC型碳青霉烯酶首次報(bào)道于1996年美國的一株肺炎克雷伯菌，2005年法國、以色列和哥倫比亞等許多國家和地區(qū)也報(bào)道了產(chǎn)KPC酶的細(xì)菌的產(chǎn)生，產(chǎn)KPC酶的細(xì)菌在世界各地相繼流行和播散。2006年哥倫比亞首次報(bào)道了產(chǎn)KPCPA，接著在波多黎各，美國和中國有出現(xiàn)，且分離率越來越高。

從我院數(shù)據(jù)來看，17.9%的泛耐藥PA檢出blaKPC，提示產(chǎn)KPC酶已成為泛耐藥PA對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥的重要原因。其中ICU 病房16株，占80.0%；非ICU 病房4株，占20.0%。

blaKPC基因既可存在于質(zhì)粒上，從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)檢索結(jié)果顯示，攜帶blaKPC基因的PA質(zhì)粒有5個(gè)，其中2個(gè)為IncP-6，2個(gè)為IncU，1個(gè)為未知分型。為進(jìn)一步探究我院產(chǎn)KPC酶PA的分子耐藥機(jī)制，我們選擇了編號(hào)為14057的菌株，提取質(zhì)粒，并對(duì)其質(zhì)粒進(jìn)行了全序測(cè)定。結(jié)果顯示，該質(zhì)粒全長(zhǎng) 51 663 bp，有69個(gè)開放閱讀框[15](ORFs)，平均GC含量59.2 %，與數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)存序列同源性<20%，為一個(gè)全新的質(zhì)粒。僅帶有blaKPC-2一個(gè)耐藥基因，序列分析確認(rèn)為blaKPC-2亞型。對(duì)耐藥區(qū)域的詳細(xì)分析發(fā)現(xiàn)，p14057-KPC質(zhì)粒的blaKPC-2區(qū)域由Tn1403核心轉(zhuǎn)座模塊、△Tn6296和一個(gè)IS6100構(gòu)成。Tn1403是PA的一個(gè)多藥耐藥轉(zhuǎn)座子，帶有In28和Tn5393c。Tn6296來自中國的一個(gè)帶blaKPC-2基因的肺炎克雷伯菌質(zhì)粒，其中△Tn3:ISKpn27到△repB為blaKPC-2核心區(qū)。Tn1403和Tn6296均屬于Tn3家族Tn21亞群。因此，來自Tn6396的blaKPC-2核心區(qū)和Tn1403的核心轉(zhuǎn)座模塊tnpA-tnpR區(qū)域通過同源重組形成了p14057-KPC質(zhì)粒的blaKPC-2區(qū)域。

根據(jù)p14057-KPC測(cè)序結(jié)果，針對(duì)質(zhì)粒骨架區(qū)(復(fù)制區(qū)、穩(wěn)定區(qū)和接合區(qū))分別設(shè)計(jì)三個(gè)引物對(duì)其他產(chǎn)KPC的銅綠假單菌進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)有17株菌與p14057-KPC相似質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，其中ICU病房16株，神經(jīng)外科1株。有2株(泌尿外科)未檢出，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，產(chǎn)KPC酶是PA對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥的另一耐藥機(jī)制，PA中帶blaKPC-2基因質(zhì)粒的出現(xiàn)，提示這種耐藥特性將如同其在腸桿菌科一樣在PA中播散。通過對(duì)產(chǎn)KPC酶PA的耐藥分子機(jī)制的研究，對(duì)指導(dǎo)臨床用藥和控制醫(yī)院感染具有重要意義。