雷佳，倪雪晨，程偉，劉偉林，尤恒，丁坤明，王行國

(1.湖北大學生命科學學院, 湖北 武漢 430062; 2.咸寧市芽旗香茶葉研究中心,咸寧市農(nóng)業(yè)科學院, 湖北 咸寧 437100)

0 引言

1 材料與方法

1.1 細菌菌株與培養(yǎng)茶樹草螺菌(Herbaspirillumcamelliae) WT00C 由本實驗室分離并保存. 細菌日常在含有5 μg /mL 壯觀霉素和 10 μg /mL 氨芐青霉素的營養(yǎng)肉湯(NB) 培養(yǎng)基(蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、加水至1 L,pH 7.2) 中34 ℃培養(yǎng),-80 ℃貯存. 放大培養(yǎng)時,先用NB 培養(yǎng)基活化,再用LB 培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、酵母提取物5 g、加水至1 L, pH 7.2) 37 ℃培養(yǎng)[1,4]．

1.2 茶樹內(nèi)生草螺菌小規(guī)模發(fā)酵在上海保興生物設(shè)備有限公司5 L發(fā)酵罐(Biotech)中加入3 L LB液體培養(yǎng)(1%蛋白胨,0.5%酵母提取物,1%氯化鈉),121 ℃滅菌30 min. 待LB培養(yǎng)基冷卻后,按照1%的接種量接入30 mL 活化過夜的茶樹內(nèi)生草螺菌WT00C種子液.依據(jù)早前研究的優(yōu)化培養(yǎng)條件[1,4], 制定發(fā)酵條件,即溫度為34 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min、pH控制為7.0、通氣量為1 vvm. 每隔一段時間進行一次取樣并測定菌液OD600,待發(fā)酵菌液OD600值趨于平穩(wěn)后停止發(fā)酵.

1.3 茶樹內(nèi)生草螺菌規(guī)?；l(fā)酵首先制備發(fā)酵種子液.使用小型發(fā)酵罐(5 L), 加入3 L LB液體培養(yǎng)(1%蛋白胨,0.5%酵母提取物,1%氯化鈉)后121 ℃滅菌30 min. 待LB培養(yǎng)基冷卻后,按照1%的接種量接入30 mL 活化過夜的茶樹內(nèi)生草螺菌WT00C.發(fā)酵條件設(shè)定溫度34 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min、pH 7.0、通氣量為1 vvm、發(fā)酵6 h,OD600=1.0即為種子液.隨后進行大規(guī)模發(fā)酵,配制200 L LB液體培養(yǎng)基,加入250 L發(fā)酵罐(上海齊瑞生物科技有限公司,QRTN-200)內(nèi),在線121 ℃滅菌30 min. 待罐內(nèi)培養(yǎng)基溫度降低至34 ℃時,按照1%的接種量加入種子液. 設(shè)定轉(zhuǎn)速為200 r/min、 溫度34 ℃、通氣量1.0 vvm并發(fā)酵12 h.發(fā)酵12 h后停止發(fā)酵并下罐,OD600值可達 2.2.

1.4 促生劑的制備茶樹內(nèi)生草螺菌小規(guī)模發(fā)酵或規(guī)模化發(fā)酵時,發(fā)酵液的OD600值通常在2.0左右. 發(fā)酵液用新鮮LB培養(yǎng)基稀釋至OD600=1.0,再加1%甘油即為促生劑.使用時通常用水稀釋促生劑以獲得工作液,如1∶1(V水∶V促生劑=1∶1)稀釋的工作液用于茶樹扦插桿的浸泡,而1∶2(V水∶V促生劑=1∶2)稀釋的工作液用于大田修剪茶樹的頂端噴灑.

1.5 促生劑存放條件試驗18個500 mL培養(yǎng)瓶中分別加入500 mL發(fā)酵液并密封瓶口,然后分2組實驗, 每組9瓶,一組加入1%甘油, 另一組不加甘油.每組分別置3瓶于4、25、37 ℃存放. 在不同時間取樣并檢測活細菌數(shù),同時參照文獻[1,4]的方法檢測發(fā)酵液中IAA濃度.

1.6 促生劑對扦插苗的促生檢測在咸寧市芽旗香茶葉研究中心、崇陽縣白霓鎮(zhèn)石山村茶園茶苗育種棚內(nèi)選用兩塊地,每塊7.5 m2(7.5 m×1 m),其中2.5 m2為對照組，剩余的5 m2為實驗組.參照早前研究方法[4,6],將促生劑用清水按1∶1比例稀釋,浸泡碧香早和福鼎大白扦插桿(5 mm)1 h. 然后按常規(guī)的扦插方法進行扦插. 對照組則用清水作相同的處理．扦插的行距為 8～10 cm,株距為 1～2 cm． 實驗組和對照組的日常管理相同．扦插 160 d后觀察結(jié)果．

1.7 促生劑對茶樹促生的小規(guī)模測試在咸寧市芽旗香茶葉研究中心、崇陽縣白霓鎮(zhèn)石山村茶園選取一塊栽種有機茶鄂茶1號的茶地, 其中8壟為實驗用地,每壟長15 m ×1.5 m (22.5 m2). 8壟地塊中, 其中2壟為對照組,其他為實驗地塊.待春茶采收完后,立即修剪并在實驗組地塊上按3 000 mL/m2噴灑促生菌劑.茶樹內(nèi)生草螺菌促生劑制備采用小型發(fā)酵罐發(fā)酵,并制備OD600=1的促生劑.按比例(V水∶V促生劑=2∶1、1∶1和1∶2)稀釋后使用噴霧器噴灑.對照地塊則噴灑等量的清水.然后,所有地塊均按日常茶園管理法進行管理. 對照地和實驗地分開單獨采集樣本(包括夏茶和秋茶),分別收集每類茶葉采收量的數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計分析.

1.8 促生劑對茶樹促生的大田實驗示范地設(shè)陽性對照地、 陰性對照地和實驗示范地,其具體規(guī)劃見表1.年前冬季按照規(guī)劃準確、均勻地完成菜籽餅肥的施用.待春茶采收完后,立即修剪并在實驗用地中的茶樹上按64.5 mL/m2噴灑1∶2稀釋的促生菌劑.爾后按日常茶園管理法進行管理.對照地和實驗地分開單獨采集樣本(包括夏茶和秋茶).分別收集每類茶葉采收量的數(shù)據(jù)并統(tǒng)計單位畝產(chǎn)量.

表1 示范地規(guī)劃與餅肥施用

采用大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)茶樹內(nèi)生草螺菌促生劑. 細菌發(fā)酵液完成發(fā)酵后,用新鮮的LB稀釋至OD600=1.0,然后加入1%甘油即為茶樹內(nèi)生草螺菌促生劑.制備完成后,第二天運輸至茶葉基地.當天修剪茶園后,將茶樹內(nèi)生草螺菌促生劑按比例(V水∶V促生劑=1∶2)稀釋后使用噴霧器噴灑,噴酒量為64.5 mL/m2.對照地不噴酒.

1.9 數(shù)據(jù)采集及分析制作0.5 m2的塑料框(長×寬=0.5 m×1 m).然后按照茶地形狀隨機在每塊地內(nèi)選取9個點,將框放在每個點上,并將框內(nèi)全部的嫩芽枝條剪下,計數(shù)和稱重.然后計算出0.5 m2內(nèi)嫩芽平均數(shù)目、嫩芽平均總質(zhì)量(g)以及單個嫩芽平均質(zhì)量(g).實驗數(shù)據(jù)使用SPSS軟件分析,P≤ 0.05即為顯著性差異.茶葉質(zhì)量檢測由農(nóng)業(yè)部茶葉質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心完成.

2 實驗結(jié)果

2.1 茶樹草螺菌促生劑的制備與穩(wěn)定性在轉(zhuǎn)速為200 r/min、 溫度34 ℃、通氣量1.0 vvm發(fā)酵條件下,用LB培養(yǎng)基發(fā)酵茶樹內(nèi)生草螺菌WT00C,無論是小規(guī)?；l(fā)酵還是規(guī)模化發(fā)酵,細菌的發(fā)酵生長類似,細胞密度為OD600=2.0～2.2. 細菌的發(fā)酵生長曲線見圖1(A). 細胞生長良好、分布均勻、呈革蘭氏陰性且無其他細菌污染(見圖1(B)).

圖1 發(fā)酵罐發(fā)酵時茶樹草螺菌WT00C的生長曲線和革蘭氏染色

為了檢測茶樹草螺菌促生劑的穩(wěn)定性,將促生劑置于不同溫度(4、25、37 ℃)條件下存放,結(jié)果見圖2.圖2(A)顯示促生劑中的茶樹草螺菌在4 ℃似乎不再增殖且隨著時間的延長活細菌逐漸減少,21 d時活細菌減少一半. 與4 ℃不同,置于25和37 ℃的細菌在15 d內(nèi)活細菌數(shù)明顯增加. 只是15 d后活細菌急速減少. 18 d時活細菌數(shù)減少至15 d時的一半,23 d后細菌幾乎完全無活性. 另外, 加入1%甘油似乎對細菌的活性無影響. 同時,我們也檢測了促生劑中IAA的濃度. 置于4、25、37 ℃條件下存放30 d,促生劑內(nèi)的IAA含量稍有增加但無顯著性差異(見圖2(B)).這些結(jié)果顯示,茶樹草螺菌促生劑可在常溫條件下存放15 d.也就是說,常溫條件下存放茶樹草螺菌促生劑應(yīng)在15 d內(nèi)使用完.

圖2 茶樹草螺菌促生劑在4、25和37 ℃存放不同時間的活細菌和IAA濃度測定結(jié)果

2.2 茶樹草螺菌促生劑對扦插桿生根長芽的促生效果使用茶樹草螺菌促生劑對扦插桿處理后進行扦插,160 d后觀察結(jié)果. 圖3(A)顯示促生劑處理后扦插苗的生長狀況.與對照相比,促生劑處理后扦插苗生長旺盛,不定根數(shù)目和株高都優(yōu)于對照組.碧香早和福鼎大白扦插桿的成活率都達到88.5%,比對照組高15.3%. 隨機取1 000 株進行統(tǒng)計分析,碧香早和福鼎大白扦插苗的根數(shù)目明顯增多,比對照組增加40%～50%. 根的長度也明顯增加,碧香早扦插苗根的長度比對照組增長62.5%.新生苗的長度也顯示增加,福鼎大白扦插苗的長度比對照組增加30% (見圖3(B)). 這些結(jié)果說明茶樹草螺菌促生劑對扦插桿不定根的形成和頂芽的生長具有明顯的促生作用,促生劑的促生效果與早前報道的搖瓶培養(yǎng)的茶樹草螺菌菌液的效果[4,6]一致.

圖3 茶樹草螺菌促生劑處理碧香早和福鼎大白扦插桿的扦插苗生長比較與數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2.3 茶樹草螺菌促生劑對茶樹生長的促生作用為了檢測茶樹草螺菌促生劑對對茶園茶樹生長的促生作用,首先在咸寧市芽旗香茶葉研究中心、崇陽縣白霓鎮(zhèn)石山村茶園選取栽種有機茶鄂茶1號的茶地進行小規(guī)模測試.分別使用不同比例稀釋的細菌培養(yǎng)物噴灑機械修剪后的大田茶樹,菌液噴灑量為63 mL/m2.60 d后采樣收集夏茶數(shù)據(jù).圖4顯示噴灑細菌后茶樹生長旺盛,無任何病癥.采樣時,每組分6區(qū)采集新長出的幼嫩茶枝,每區(qū)100株,稱濕重和測量長度,共計600株.統(tǒng)計分析顯示每組6個區(qū)采集的樣本重量和長度之間無明顯差異(P> 0.05).不同比例稀釋的內(nèi)生草螺菌噴灑的茶樹修剪枝,長出的新生幼枝平均長度和100株平均重量均大于清水噴灑對照組(P> 0.05) (見圖5(A、B)). 春茶采收后進行機械修剪,60 d后進行秋茶采樣.每組600株,稱濕重并測量長度(見圖5(C、D)).統(tǒng)計分析顯示秋茶的采樣結(jié)果與春茶相似,1∶2和1∶1稀釋噴灑組中,新生幼枝平均長度和100株平均重量雖略有下降但均大于對照組,尤其在2∶1稀釋噴灑組中,新生幼枝平均長度和100株平均重量都大于對照組,差異極顯著(P< 0.01). 茶樹草螺菌促生劑有效促進大田茶樹修剪后新生芽的生長,提高茶葉產(chǎn)量(每666.67 m2鮮重增加約8 kg).這些結(jié)果與早前搖瓶培養(yǎng)的實驗結(jié)果[4]相似.同時,我們檢測了2次取樣樣本的茶葉組分.與對照組比較,實驗組茶葉中茶多酚、咖啡堿、氨基酸等主要成分均無顯著性變化(P>0.05),說明茶樹內(nèi)生草螺菌促生劑處理不會影響茶葉的質(zhì)量.

圖4 茶樹內(nèi)生草螺菌噴灑修剪茶樹后60 d的生長狀況

圖5 茶樹內(nèi)生草螺菌噴灑修剪茶樹的實驗結(jié)果

2.4 50畝大田示范效果在咸寧市芽旗香茶葉研究中心、崇陽縣白霓鎮(zhèn)石山村茶園選取栽種有機茶鄂茶1號的茶地33 333.5 m2(50畝)作為大田示范用地, 其中3 333.35 m2(5畝)為陰性對照，3 333.35 m2(5畝)為陽性對照,另26 666.8 m2(40畝)為大田實驗地. 在實驗用地中的茶樹上按64.5 mL/m2噴灑1∶2稀釋(V水∶V促生劑=1∶2)的促生劑后,60 d采集的夏茶數(shù)據(jù)和統(tǒng)計結(jié)果見圖6. 圖6顯示噴灑細菌后的茶樹生長旺盛、葉片碧綠且無任何病理癥狀. 表2和圖7(A)的統(tǒng)計結(jié)果顯示,同樣施用0.337 kg/m2餅肥,噴灑組嫩芽平均數(shù)目、平均總重量及單個嫩芽平均重量等各項指標均明顯優(yōu)于陰性對照組. 噴灑組中的嫩芽總數(shù)目雖稍少于陽性對照組但單個嫩芽平均重量卻高于陽性對照. 盡管噴灑組嫩芽平均數(shù)目和平均總重量弱小于陽性對照組,但與陰性對照組比較各項指標仍顯著提升. 每666.67 m2(1畝)嫩芽重量呈37.4%的增加說明,噴灑茶樹草螺菌促生劑可顯著促進茶樹的生長.

圖6 噴酒實驗組修剪噴灑后60 d的茶樹長勢

表2 噴灑草螺菌促生劑后夏茶采集數(shù)據(jù)結(jié)果

噴灑后所有地塊都不再追加任何肥料,夏茶采收完后進行再次修剪但不再噴灑促生剖.修剪后60 d再次采集秋茶數(shù)據(jù),統(tǒng)計結(jié)果見表3和圖7(B).噴灑組嫩芽平均數(shù)目、平均總重量及單個嫩芽平均重量等各項指標不僅大于陰性對照組而且也超過陽性對照組.與夏茶相比,3個組秋茶嫩芽平均數(shù)目差異變化不顯著但嫩芽平均總重量及單個嫩芽平均重量差異顯著(P< 0.01). 與陽性對照組類似,噴灑組在春茶生長時既增加嫩芽的數(shù)目又增加嫩芽的重量,而在秋茶生長時主要增加嫩芽的重量. 每666.67 m2(1畝) 增加44.3%的嫩芽重量說明使用茶樹草螺菌促生劑噴灑不僅顯著增加嫩芽的重量而且促生劑的促生效果可維持約一年.噴灑一次茶樹草螺菌促生劑的大田促生效力優(yōu)于每m2多施0.113 kg餅肥的效力.

表3 噴灑草螺菌促生劑后秋茶采集數(shù)據(jù)結(jié)果

圖7 噴酒實驗組修剪噴灑后60 d的茶樹夏秋茶采樣的數(shù)據(jù)分析

3 討論

前期實驗室研究發(fā)現(xiàn),茶樹內(nèi)生草螺菌不僅具有強的硒酸鹽還原能力與硒酸鹽耐受性而且對茶樹也具有顯著的促生作用[4-9].因此,離體發(fā)酵規(guī)?；a(chǎn)十分必要.依照前期的優(yōu)化條件,使用5 L小發(fā)酵罐和200 L大發(fā)酵罐在LB培養(yǎng)基、溫度34 ℃、轉(zhuǎn)速為200 r/min、通氣量1.0 vvm發(fā)酵條件下發(fā)酵12 h,細菌OD600值可達2.2,比搖瓶培養(yǎng)的OD600值(1.2)高1.0. 由于茶樹草螺菌是內(nèi)生菌,較低的細菌OD600值是不難理解的,因為LB培養(yǎng)基的成分并不能滿足細菌的最佳生長.由此可見,體外培養(yǎng)茶樹內(nèi)生草螺菌的培養(yǎng)基仍需進一步深入研究探討.

茶樹內(nèi)生草螺菌促生劑由OD600值為1.0的茶樹內(nèi)生草螺菌發(fā)酵液加1%甘油. 1%甘油不影響細菌的生長繁殖,只是用來增加細菌對茶樹切口處粘附,使細菌容易經(jīng)切口進入茶枝或茶桿內(nèi)定殖. 細菌定殖后才能有效地發(fā)揮其促生作用[4].茶樹草螺菌促生劑在常溫下的穩(wěn)定性為15 d,促生劑制備后應(yīng)在15 d內(nèi)使用. 另外,大田使用時茶樹內(nèi)生草螺菌促生劑應(yīng)按 1∶2稀釋(V水∶V促生劑=1∶2),并按64.5 mL/m2噴灑.

與實驗室前期搖瓶培養(yǎng)的細菌一樣,茶樹內(nèi)生草螺菌促生劑對扦插桿不定根的形成和頂芽的生長都具有明顯的促生作用. 使用茶樹內(nèi)生草螺菌促生劑噴灑頂端修剪后的茶樹,明顯促進大田茶樹修剪后新生芽的生長并提高茶葉產(chǎn)量.茶葉質(zhì)量檢測顯示使用茶樹草螺菌促生劑的茶葉中茶多酚、咖啡堿、氨基酸等主要成分均與未使用促生劑的茶葉組分相似、無顯著性變化.在33 333.5 m2(50畝)大田示范中,使用茶樹草螺菌促生劑噴灑,獲得了每666.67 m2(1畝)嫩芽重量增加82%的績效,比陽性對照組(78%)還高4%. 再次說明茶樹草螺菌促生劑可顯著促進茶樹生長、提高茶葉產(chǎn)量.這些結(jié)果表明,茶樹草螺菌促生劑值得在茶場的茶樹生產(chǎn)中推廣應(yīng)用.尤其是有機茶的生產(chǎn)中,施用肥料主要為各種餅肥[10],容易造成茶樹生長時缺少氮源.應(yīng)用茶樹草螺菌促生劑不僅降低餅肥的使用、提高產(chǎn)量而且可解決有機茶生產(chǎn)中氮肥不足的問題.