于鳳琳 袁丹 陳宇 李美芽 竇曉兵 蔣福升

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053

牡蒿（Artemisia japonica Thunb.）為菊科蒿屬植物，全草可入藥?！冬F(xiàn)代本草綱目》記載，中藥牡蒿味苦、微甘，寒，具有清熱、解表、涼血、殺蟲等功效；主治感冒發(fā)熱，勞傷咳嗽，潮熱，中暑，瘧疾，高血壓病，口瘡，疥癬，濕疹等[1]。藥理學(xué)研究表明，牡蒿富含多糖、萜類、黃酮類和酚類等成分[2]，具有活血、止血、抗炎[3]、抗氧化[4]和抗關(guān)節(jié)炎[5]等諸多藥理活性，且毒性低、安全性好[3-4]，民間也常作野菜食用和泡茶飲用[6]。

除了上述藥理活性外，牡蒿在民間也常用于肝炎治療。早在1977年，張世友[7]采用牡蒿根治愈一例傳染性肝炎；2017年，姚萍[8]采用鴨乙型肝炎病毒感染模型確證牡蒿提取物對鴨乙型病毒性肝炎具有較好療效。然而對于牡蒿的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究相對較少。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，牡蒿中含有大量綠原酸類成分。研究表明，綠原酸類成分具有良好的抗病毒[9]、保肝退黃、抗氧化、抗炎、抑菌等活性[10]，可見綠原酸類成分極有可能是牡蒿發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。因此，本研究擬采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）建立牡蒿葉中綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C的含量測定方法；另外由于綠原酸類成分不穩(wěn)定，易水解，因此本研究以上述4個綠原酸類成分總含量為響應(yīng)值，以乙醇濃度、液料比、超聲功率為主要因素，采用Box-Behnken響應(yīng)面法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以便更確切地反映牡蒿葉中綠原酸類成分含量，為其質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)，同時為牡蒿的后續(xù)開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 儀器 UltiMate3000型高效液相色譜儀購于美國戴安公司，配備LPG-3400A泵、WPS-3000SL自動進(jìn)樣器和PDA-3000檢測器；Thermo Scientific Syncronis Amino色 譜 柱 （4.6mm×250mm，5μm） 購 于 Thermo Fisher公司（批號：12156）；SK2510HP型超聲波清洗器購于上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；DFT-50型手提式高速粉碎機(jī)購于北京新諾立華儀器有限公司；Milli-Q Biocel超純水儀為美國密理博有限公司。

1.2 藥物和試劑 牡蒿采自福建省寧德市壽寧縣，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)丁志山教授鑒定為菊科蒿屬植物牡蒿（Artemisia japonica Thunb.），樣品保存于浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)研究所（編號：2019051001）；綠原酸對照品購于上海畢得醫(yī)藥科技有限公司（批號：AGA445，含量≥99%）；異綠原酸A對照品購于上海嶸崴達(dá)實業(yè)有限公司（批號：DST190918-036，含量≥98%）；異綠原酸B對照品、異綠原酸C對照品均購于成都普思生物科技股份有限公司（批號：PS001054、PS001057，含量≥98%）；色譜純乙腈購于默克公司（批號：JA078630）；色譜純甲酸購于上海麥克林生化科技有限公司（批號：C10332078）；95%醫(yī)用乙醇購于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司（批號：20190917）。

1.3 色譜條件 Thermo Scientific Syncronis Amino色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），乙腈:0.1%甲酸水（40:60，V/V）為流動相，流速1mL·min-1，柱溫25℃，檢測波長325nm，進(jìn)樣量10μL。

1.4 溶液制備

1.4.1 對照品溶液的配制 取綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C對照品，分別精密稱定，以60%乙醇溶解定容后進(jìn)行系列對倍稀釋，分別配成對照 品 濃 度 均 為200.00、100.00、50.00、25.00、12.50和6.25μg·mL-1的系列混合對照品溶液。

1.4.2 供試品溶液的制備 牡蒿葉于60℃烘干，打粉，過80目篩；精密稱取0.2g，置于50mL帶蓋管中，加入60%乙醇40mL，精密稱定，重復(fù)制備3份；超聲頻率53kHz，功率250W，50℃下提取30min，冷卻至室溫，以60%乙醇補足質(zhì)量，混勻，過0.22μm濾膜，備用。

1.5 測定方法建立

1.5.1 系統(tǒng)適用性實驗 分別取混合對照品溶液和供試品溶液，按照1.3中的色譜條件各進(jìn)樣10μL，記錄色譜圖，分析各峰分離度。

1.5.2 線性關(guān)系考察 按照1.3中的色譜條件，對系列對倍稀釋的混合對照品溶液進(jìn)行進(jìn)樣分析，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性關(guān)系擬合。

1.5.3 精密度實驗 精密吸取1.4.1配制的混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄4個對照品對應(yīng)峰面積，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值。

1.5.4 穩(wěn)定性實驗 取1.4.2制備的供試品溶液，按照1.3中的色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12、24h進(jìn)樣10μL，記錄峰面積，并計算綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C的RSD。

1.5.5 重復(fù)性實驗 精密稱取同一批樣品適量，共6份，按照1.4.2的方法制備供試品溶液，再按照1.3中的色譜條件進(jìn)樣分析，計算樣品中4個成分含量RSD。

1.5.6 加樣回收率實驗 取9份已知含量的牡蒿葉粉末樣品，精密稱定，分別加入已知成分含量80%、100%和120%的對照品，按照1.4.2的方法制備供試品溶液，然后按照1.3中的色譜條件進(jìn)樣分析，計算4個成分的平均加樣回收率及RSD。

1.6 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

1.6.1 單因素實驗 精密稱取牡蒿葉0.250g，固定其他因素不變，在超聲頻率53kHz條件下分別考察乙醇濃度、液料比、超聲功率、超聲時間和超聲溫度單因素變化對4個成分提取的影響，提取完成后分別定容至100mL，過0.22μm濾膜，按照1.3中的色譜方法進(jìn)樣分析。

1.6.2 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計 根據(jù)上述單因素實驗結(jié)果，選定乙醇濃度、液料比和超聲功率3個因素為優(yōu)化對象，設(shè)定3個水平；采用Design-Expert 8.0.6軟件，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，設(shè)置5個中心實驗點，共17組實驗；以4個成分總含量為響應(yīng)值，優(yōu)化提取工藝[11]。

1.7 工藝驗證和含量測定 根據(jù)響應(yīng)面法優(yōu)化的提取工藝方法，重復(fù)提取6次，按照1.3中的色譜方法進(jìn)樣分析，測定牡蒿葉中綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C含量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，各組間比較采用單因素方差分析。采用Design-Expert 8.0.6軟件對Box-Behnken響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行二次多項回歸方程擬合，并對其回歸系數(shù)進(jìn)行方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性驗結(jié)果 按照1.3中色譜條件進(jìn)樣分析，提示在該色譜條件下綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C理論塔板數(shù)均＞3 000，分離度均＞2，各成分基線分離良好。見圖1。

圖1 混合對照品和牡蒿提取物高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography of mixed reference and Artemisia japonica extract

2.2 測定方法學(xué)考察結(jié)果

2.2.1 線性關(guān)系考察結(jié)果 按照1.3中色譜條件，將對倍稀釋混合對照品溶液進(jìn)樣分析，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性關(guān)系擬合，結(jié)果提示4個對照品在6.25～200.00μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見表1。

表1 4個對照品線性關(guān)系Tab.1 Linear relationship of the four references

2.2.2 精密度實驗結(jié)果 精密吸取混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，分析4個對照品對應(yīng)峰面積RSD值，分別為1.059 6%、0.479 9%、0.386 2%和0.952 6%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性實驗結(jié)果 取供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24h進(jìn)樣10μL，計算得綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C的RSD分別為1.878 0%、0.778 1%、1.722 9%和1.478 4%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 重復(fù)性實驗結(jié)果 精密稱取同一批樣品適量，共6份，按照1.3中色譜條件進(jìn)樣分析，計算得出樣品中4個成分含量RSD分別為1.544 7%、1.883 1%、1.763 2%和1.772 8%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.5 加樣回收率實驗結(jié)果 4個成分RSD分別為0.887 1%、1.886 1%、2.219 3%和1.624 0%，加樣回收率均在95%～105%區(qū)間內(nèi)，且RSD小于3.000 0%，表明該方法準(zhǔn)確性良好。見表2。

表2 加樣回收率實驗結(jié)果（n=9）Tab.2 Results of sample recovery（n=9）

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.3.1 單因素實驗結(jié)果 各單因素分析結(jié)果表明，乙醇濃度、液料比、超聲功率、超聲時間和超聲溫度各單因素變化時，4個成分合計含量極差分別為6.731 4mg·g-1、5.334 1mg·g-1、2.689 7mg·g-1、1.546 8mg·g-1和0.683 0mg·g-1，表明上述5個因素對4個綠原酸類成分提取率影響排序為：乙醇濃度＞液料比＞超聲功率＞超聲時間＞超聲溫度。見圖2?？傮w上，異綠原酸B和異綠原酸C含量相對低，各因素變化對其提取率影響不大；綠原酸含量較高，但水溶性好，上述各因素變化情況下對綠原酸提取率影響也不顯著，在高乙醇（70%）提取條件下提取率反而有所下降。見圖2A。異綠原酸A含量最高，極性相比綠原酸有所降低，乙醇濃度、液料比和超聲功率對其有顯著影響。在超聲溫度50℃、液料比20:1mL·g-1、超聲頻率53kHz、超聲功率250W、超聲時間20min條件下，乙醇濃度50%時，提取率較高。見圖2A。在超聲溫度50℃、乙醇濃度50%、超聲頻率53kHz、超聲功率250W、超聲時間20min條件下，液料比達(dá)到20:1mL·g-1后提取率增加并不明顯。見圖2B。在超聲溫度50℃、乙醇濃度50%、液料比20:1mL·g-1、超聲頻率53kHz、超聲時間20min條件下，隨超聲功率增加，提取率增加，因此以儀器上限功率250W為提取超聲功率。見圖2C。而在乙醇濃度50%、液料比20:1mL·g-1、超聲頻率53kHz、超聲功率250W條件下，超聲時間和超聲溫度變化均未能顯著增加提取率。見圖2D、2E。綜合考慮提取率和能耗等因素，初步確定乙醇濃度50%、液料比20∶1mL·g-1、超聲功率250W、室溫超聲提取20min較為合適。

圖2 各提取因素對4個成分提取率影響Fig.2 Impact of extraction factors on the extraction rate of the four components

2.3.2 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計結(jié)果 根據(jù)上述單因素實驗結(jié)果，選定乙醇濃度、液料比和超聲功率3個因素為優(yōu)化對象，設(shè)定3個水平。見表3。采用Design-Expert 8.0.6軟件，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，設(shè)置5個中心實驗點，以4個成分總含量為響應(yīng)值，共完成17組實驗。見表4。

表3 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計因素與水平Tab.3 Factors and levels of response surface experiment design

表4 響應(yīng)面實驗設(shè)計安排與結(jié)果Tab.4 Arrangement and results of response surface experiment design

借助Design-Expert 8.0.6軟件分析，4個成分合計提取率對因素A、B、C的二次多項回歸方程為：提取率=11.86+0.72A+0.17B+0.050C-0.17AB-0.050AC+0.063BC-0.77A2-0.067B2+0.10C2，建立的回歸模型P＜0.01。見表5。表明模型對提取率預(yù)測較準(zhǔn)，擬合精度較好，可利用該模型作后續(xù)優(yōu)化設(shè)計。失擬項P=0.182 3＞0.05，表明該模型擬合較好。同時，多元相關(guān)系數(shù)R2=0.986 7，接近于1，表明相關(guān)性好；校正決定系數(shù)R2和預(yù)測系數(shù)R2均較高且數(shù)值接近，表示該回歸模型能充分解釋工藝過程。此外，變異系數(shù)＜10%，精密度＞4，表明實驗的可信度和精確度高，有效信號與噪聲比值較為合理。模型的二次項系數(shù)為負(fù)，曲線開口向下，說明提取率有極大值。一次項中因素A和二次項A2對結(jié)果影響極顯著，一次項因素B對結(jié)果影響顯著，因素A和B交互作用也非常顯著。見表5。

表5 Box-Behnken響應(yīng)面二次模型及其回歸系數(shù)方差分析Tab.5 Box Behnken response surface quadratic model and its regression coefficient variance analysis

2.3.3 響應(yīng)曲面和等高線圖分析結(jié)果 固定任意1個因素處于零水平，按照擬合的二次回歸方程對其他2個因素進(jìn)行編程運算，經(jīng)Design-Expert 8.0.6分析得到交互因素的響應(yīng)面和等高線圖。見圖3。從圖3中看出，乙醇濃度對4個成分提取率的影響最顯著，曲線弧度較大；液料比與超聲功率相對次之，曲線弧度較小。2個因素交互影響方面，乙醇濃度與液料比交互作用比較明顯。以提取量取最大值為參考，采用Design-Expert 8.0.6優(yōu)化分析，超聲提取牡蒿中總綠原酸最佳工藝為：乙醇濃度為59.75%，液料比為40:1mL·g-1，超聲頻率53kHz，功率為250W，室溫下提取20min，95%置信度下，提取量的預(yù)測值為49.061 2mg·g-1。

圖3 乙醇濃度、液料比和超聲功率對牡蒿葉4個綠原酸成分總提取率交互影響的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface diagram of interaction among ethanol concentration，liquid-solid ratio and ultrasonic power on total extraction rate of four chlorogenic acid components in Artemisia japonica leaves

2.4 工藝驗證和含量測定結(jié)果 為方便操作，調(diào)整乙醇濃度為60%，以液料比為40:1mL·g-1，超聲頻率53kHz，超聲功率為250W，室溫下提取20min，平行試驗6次，按照1.3中的色譜方法進(jìn)樣分析，實際測得綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C含量分別為14.317 0mg·g-1、27.945 2mg·g-1、1.230 4mg·g-1和5.066 5mg·g-1，合計總量達(dá)48.559 0mg·g-1。見表6。4個成分合計含量與理論預(yù)測值的相對偏差為1.0236%，表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的超聲提取牡蒿中4個綠原酸類成分的工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。此外，值得注意的是，與其他富含綠原酸類中藥相比，牡蒿葉中綠原酸和異綠原酸A含量高于大多數(shù)中藥材。見表7。

表6 牡蒿葉中各成分含量測定結(jié)果Tab.6 Content determination results of four chlorogenic acids in Artemisia japonica leaves

表7 各藥材中綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C含量（mg·g-1）Tab.7 Contents of chlorogenic acid，isochlorogenic acid A，isochlorogenic acid B and isochlorogenic acid C in different Chinese herbs（mg·g-1）

3 討論

綠原酸類成分是眾多藥用植物的藥效成分，常作為指標(biāo)成分用于中藥材質(zhì)量分析和藥物制劑質(zhì)控[12-20]。從文獻(xiàn)資料看，多數(shù)研究采用RP18反相色譜柱，以乙腈和甲酸水（或磷酸水）為流動相，對綠原酸類成分含量進(jìn)行測定[12-20]。而筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，牡蒿提取物中有少量雜質(zhì)峰，與異綠原酸A、B和C峰重疊，RP18色譜柱難以有效分離；但采用Thermo Scientific Syncronis Amino正相色譜柱，以乙腈:0.1%甲酸水（40:60，V/V）為流動相，1mL·min-1等度洗脫，大多雜質(zhì)峰在7min內(nèi)已出峰，綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C峰周圍未見雜質(zhì)峰，且4個成分分離度良好。Syncronis Amino正相色譜柱常用于糖類和氨基酸等水溶性成分分析，綠原酸類成分含奎尼酸基團(tuán)，極性大，從實驗結(jié)果看，該色譜柱也適用于綠原酸類成分分離，所建立的色譜方法穩(wěn)定可靠，適用于牡蒿葉中綠原酸類成分含量測定。

在單因素考察基礎(chǔ)上，以牡蒿葉中4個主要綠原酸類成分總提取率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken響應(yīng)面法對乙醇濃度、液料比和超聲功率3個因素進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計。結(jié)果與單因素考察結(jié)果類似，各因素的影響大小依次為乙醇濃度＞液料比＞超聲功率，其中乙醇濃度和液料比交互作用顯著。通過Design-Expert 8.0.6計算和工藝驗證，確定最佳提取工藝為：60%乙醇，液料比40:1（mL·g-1），超聲頻率53kHz，功率250W，室溫超聲提取20min。在該優(yōu)化提取工藝下，測得牡蒿葉中綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C含量 分 別 高 達(dá)14.317 0mg·g-1、27.945 2mg·g-1、1.230 4mg·g-1和5.066 5mg·g-1，與提取工藝優(yōu)化前比較，測得的4個成分含量明顯提高，這在一定程度上與綠原酸類成分穩(wěn)定性有關(guān)，尤其是水提過程中更易降解，因此通過合理優(yōu)化提取工藝后，能更為真實地反映牡蒿葉中綠原酸類成分的實際含量。另外，綜合比較現(xiàn)有文獻(xiàn)資料可以發(fā)現(xiàn)，牡蒿葉中綠原酸含量低于金銀花、甜葉菊和款冬花，與綿茵陳和毛連菜相當(dāng)；異綠原酸A含量低于金銀花，但高于綿茵陳；異綠原酸B和異綠原酸C含量也較高；4個成分總含量僅次于金銀花，高于大多傳統(tǒng)中藥。尤其值得注意的是，與同科屬植物綿茵陳比較，除了綠原酸含量相當(dāng)外，牡蒿中的其余3個成分含量均高于綿茵陳。綿茵陳具有清熱、利濕、退黃等功效，常用于治療濕熱黃疸和傳染性肝炎等病癥；而研究已證實綠原酸、異綠原酸類成分是其發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗病毒、保肝退黃等重要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[9-10]。因此，本研究從物質(zhì)含量角度，間接提示了牡蒿治療黃疸型肝炎的潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，中藥成分復(fù)雜，建立多指標(biāo)成分測定方法對建立中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、提升中藥材品質(zhì)具有重要意義[21]，因此本研究為牡蒿的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定了良好的基礎(chǔ)。