魏燕 金劍虹 王雁秋

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市中醫(yī)院 杭州 310007

肥胖是指體重超過標(biāo)準體重20%，而單純性肥胖是指全身脂肪分布比較均勻，不伴有內(nèi)分泌激素紊亂，主要由遺傳因素和營養(yǎng)過剩所致的肥胖。單純性肥胖占肥胖人群的95%左右。當(dāng)進食熱量多于人體消耗量，而以脂肪的形式儲存于體內(nèi)，脂肪細胞數(shù)量和體積增大，就會逐漸發(fā)展為單純性肥胖。近年來，隨著人們生活方式的變化，肥胖的發(fā)病率迅速增長[1]。因為肥胖、超重導(dǎo)致的慢性代謝紊亂以及由此引發(fā)的糖尿病、心腦血管病、腫瘤、不孕不育、焦慮抑郁等疾病的患病率也逐年攀升[2-5]，因此迫切需要尋求合理有效的干預(yù)措施。目前的減肥治療藥物，大都存在有效應(yīng)答率低、副作用大、停用后體重反彈等諸多問題[6]；而調(diào)整飲食與運動相結(jié)合的治療方式往往難以長期堅持，依從性差[7]。尋找有效治療單純性肥胖的藥物或方法成為近年來的研究熱點。

目前認為，腸道菌群在調(diào)節(jié)免疫炎癥和糖脂代謝方面發(fā)揮著重要作用[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，單純性肥胖患者腸道菌群的組成及其代謝產(chǎn)物紊亂，可影響免疫細胞如輔助性T細胞17（T helper cell 17，Th17）和調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）的生成和分化，從而導(dǎo)致慢性低水平免疫性炎癥和肥胖的發(fā)生[9-12]。目前，多項研究顯示中藥對腸道菌群具有重要影響，小檗堿、葛根芩連湯等中藥成分或中藥組方均具有改善菌群失調(diào)的作用[13-14]。芪山配方顆粒由葛根芩連湯化裁而來，該方系結(jié)合中科院仝小林院士和我院國家級名老中醫(yī)郁加凡的經(jīng)驗所創(chuàng)。前期研究結(jié)果顯示，芪山配方顆粒對糖尿病前期患者具有降低血糖、改善胰島素抵抗、降低體重的作用[15-16]，但作用機制尚未明確，且對單純性肥胖人群未作研究。因此，本研究將探索芪山配方顆粒治療單純性肥胖濕熱蘊脾證的療效，以及對腸道菌群-免疫炎癥途徑的影響，以期為中藥治療肥胖提供參考。

1 資料和方法

1.2 一般資料 采用隨機雙盲安慰劑對照前瞻性研究的方法，將2019年1月1日至12月31日就診于浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市中醫(yī)院的80例單純性肥胖患者，按隨機數(shù)字表法分為中藥組和對照組，每組各40例。本研究通過院內(nèi)倫理審查（倫理編號：2018KY038），所有患者均簽署知情同意書。兩組患者血壓、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）和糖化血紅蛋白（hemoglobin A1c，HbA1c）等一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。 見表1。

表1 兩組患者一般資料比較Tab.1 Comparison of general information in each group

1.3 納入標(biāo)準 同時滿足以下要求者，予以納入：（1）符合《肥胖癥基層診療指南（2019年）》[17]的單純性肥胖診斷標(biāo)準：男性腰圍≥90cm，女性≥85cm；且BMI≥28kg/m2；（2）年齡25～50歲；（3）參照《中醫(yī)內(nèi)科常見病診療指南中醫(yī)病癥部分》[18]中肥胖癥相關(guān)內(nèi)容，中醫(yī)辨證分型屬于濕熱蘊脾證：脘腹脹滿，食少倦怠，頭重如裹，便溏不爽，小便色黃，及全身濕熱黃疸征象，舌質(zhì)胖大，舌苔黃膩，脈滑數(shù)；（4）停用影響體重藥物4周；（5）患者自愿參與研究，并簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準 滿足以下任何一條者，予以排除：（1）因藥物、內(nèi)分泌疾病或其他疾病導(dǎo)致的體重增加；（2）合并嚴重的肝腎功能障礙或其他嚴重原發(fā)性疾??；（3）6個月內(nèi)有急性心腦血管事件或心肌梗死病史；（4）應(yīng)激狀態(tài)、繼發(fā)性高血糖或繼發(fā)性高血壓；（5）一年內(nèi)接受過減重手術(shù)；（6）4周內(nèi)有抗生素應(yīng)用史；（7）不能配合飲食控制，或不按規(guī)定用藥等拒絕合作者；（8）精神疾病或腫瘤患者；（9）妊娠或哺乳期女性，及計劃妊娠或無避孕計劃的女性；（10）可能對受試藥物過敏者；（11）已接受藥物治療的糖尿病患者。

1.5 治療方法

1.5.1 中藥組 給予芪山配方顆粒口服，芪山配方顆粒1包/次，2次/d，療程12周。芪山顆粒配方為葛根15g、黃芩10g、黃連10g、大黃3g、絞股藍10g、生黃芪15g、淮山藥15g、蒼術(shù)15g、茯苓15g、炒枳實10g、生山楂15g、川芎10g，由本院中藥制劑室生產(chǎn)。其他干預(yù)措施包括飲食調(diào)整、運動等，均予低脂糖尿病飲食，配合每日50min的有氧運動。

1.5.2 對照組 給予安慰劑口服，安慰劑1包/次，2次/d，療程12周。安慰劑配方為淀粉、色素、味素，由本院中藥制劑室生產(chǎn)。其他干預(yù)措施同中藥組。

1.6 觀察指標(biāo) 每4周觀察患者臨床癥狀，并檢測空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）、血脂、血壓、腰臀比、BMI、體脂含量、中醫(yī)癥狀積分等指標(biāo)。第0周和第12周檢測HbA1c、 空腹胰島素 （fasting insulin，F(xiàn)INS）、血清IL-17、TNF-α水平、Th17/Treg比例和糞便腸道菌群，以及肝腎功能、血常規(guī)、尿常規(guī)、心電圖。

1.6.1 菌群數(shù)量及組成測定 將定量的腸道排泄物梯度稀釋后接種于亞硫酸鉍瓊脂（bismuth sulfite agar，Bs）培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)48h，分離雙歧桿菌；以類桿菌-膽汁-七葉苷瓊脂（bacteroides-bile-escinagar，BBE）培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)24h，分離脆弱擬桿菌；以乳酸菌選擇性培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)24h、腸球菌瓊脂需氧培養(yǎng)24h，分離腸球菌；以FS培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)72h，分離梭桿菌；以KF鏈球菌瓊脂培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)24h，分離鏈球菌；以伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基需氧培養(yǎng)24h，分離大腸桿菌。待菌落長出后，以菌落形態(tài)、革蘭染色、生化反應(yīng)鑒定所需目的菌。在不同的培養(yǎng)基上，對菌落進行菌種鑒定。

1.6.2 熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR）分析腸道菌群數(shù)量變化 以無菌方法收集患者的糞便1g，置于EP管中，按試劑盒說明書提取糞便基因組DNA。根據(jù)雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌、擬桿菌、梭桿菌、鏈球菌16S rDNA基因序列，設(shè)計相應(yīng)菌屬PCR引物，并在BLAST基因庫內(nèi)比對引物序列相應(yīng)菌屬的特異性。取對照組各細菌的PCR產(chǎn)物，按DNA純化試劑盒說明進行純化，測定純化產(chǎn)物吸光度（absorbance，A）值及濃度，換算為各標(biāo)準品1μL的拷貝數(shù)，用于標(biāo)準曲線的制作。

1.6.3 生化指標(biāo)檢測 FPG、血脂等生化指標(biāo)均由本院Olympus 2000大型全自動生化儀測定；FINS、HbA1c由本院ADVIA Centaur? XP全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定。

1.6.4 流式細胞儀檢測Th17/Treg細胞比例 采集兩組患者的外周血，靜置1h，4℃下2 000r/min離心10min，收集并分裝血清，-20℃保存?zhèn)溆?。加入抗人CD3-PECY7單克隆抗體和抗人CD4-PE單克隆抗體各0.5μg，振蕩混合均勻后，避光室溫孵育30min。30min后洗滌，3 000r/min離心5min，以預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌后，流式細胞儀分別測定Th17/Treg細胞比例。

1.6.5 血清IL-17、TNF-α水平檢測 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清IL-17、TNF-α的水平。 采集兩組患者的外周血，靜置1h，4℃下2 000r/min離心10min，收集并分裝血清，-20℃保存?zhèn)溆谩＜尤?mL經(jīng)過稀釋的固定、透膜劑，反應(yīng)50min后，用透膜緩沖液洗滌并重懸，再加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的抗人IL-17單克隆抗體或叉頭框蛋白p3（forkhead box protein p3，F(xiàn)oxp3）陽性的抗原遞呈細胞單克隆抗體（同時設(shè)同型對照反應(yīng)管），采用ELISA測定血清IL-17、TNF-α的水平，具體操作嚴格參照ELISA試劑盒說明書進行。

1.7 療效判定標(biāo)準 臨床痊愈：中醫(yī)臨床癥狀、體征消失或基本消失，證候積分比例減少≥90%且體重減輕≥15%；顯效：中醫(yī)臨床癥狀、體征明顯改善，證候積分比例減少≥70%且＜90%，體重減輕≥10%且＜15%；有效：中醫(yī)臨床癥狀、體征均有好轉(zhuǎn)，證候積分比例減少≥30%且＜70%，且體重減輕≥5%且＜10%；無效：中醫(yī)臨床癥狀、體征均無明顯改善，甚或加重，證候積分比例減少＜30%或體重減輕＜5%。證候積分比例（%）=（治療前證候積分-治療后證候積分）/治療前證候積分×100%，總有效率（%）=（臨床痊愈例數(shù)+顯效例數(shù)+有效例數(shù)）/總例數(shù)×100%。

證候積分計分方法：脘腹脹滿計1分，乏力倦怠計1分，頭重如裹計1分，便溏不爽或大便干結(jié)計1分，小便色黃計1分，食欲旺盛計1分，口苦口臭計1分；舌質(zhì)胖大計2分，舌苔黃膩計2分，脈滑數(shù)計2分。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以±s描述，符合正態(tài)分布的計量資料組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗；若符合正態(tài)且方差齊的計量資料組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，符合正態(tài)但方差不齊，則采用兩獨立樣本t'檢驗。等級資料采用非參數(shù)秩和檢驗（Kruskal-Wallis檢驗）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者脫落情況統(tǒng)計 中藥組脫落2例，1例因工作調(diào)動于入組后第5周脫落，1例因家庭住址搬遷于入組后第9周脫落；對照組脫落2例，1例因合并上呼吸道感染使用抗生素于第5周脫落，1例因療效欠佳而不愿再配合觀察于入組后第5周脫落。脫落患者使用臨床試驗意向性分析，脫落者數(shù)據(jù)采用失訪前最后一次測量結(jié)果。

2.2 兩組患者臨床療效比較 治療后中藥組總有效率達80%，對照組總有效率52.5%，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。 見表2。

表2 兩組患者臨床療效比較（例）Tab.2 Comparison of clinical efficacy in each group（cases）

2.3 兩組患者治療前后生化指標(biāo)比較 與治療前比較，對照組患者治療后各組指標(biāo)變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；中藥組患者治療后FPG、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、BMI、體脂含量、HbA1c、FINS、腰臀比和中醫(yī)證候積分均顯著低于治療前，高密度脂蛋白水平高于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。治療后組間比較，中藥組患者治療后FPG、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、BMI、體脂含量、HbA1c、FINS、腰臀比和中醫(yī)證候積分均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 見表3。

表3 兩組患者治療前后生化指標(biāo)比較Tab.3 Comparison of biochemical indexes in each group before and after treatment

2.4 兩組患者治療前后腸道菌群數(shù)量比較 與治療前比較，對照組患者治療后乳酸菌和脆弱擬桿菌、雙歧桿菌的菌落數(shù)量高于治療前，而腸球菌和大腸桿菌菌落數(shù)量低于治療前，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；中藥組患者治療后乳酸菌和脆弱擬桿菌、雙歧桿菌的菌落數(shù)量均顯著高于治療前，腸球菌和大腸桿菌菌落數(shù)量顯著低于治療前，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。治療后組間比較，中藥組患者治療后乳酸菌和脆弱擬桿菌、雙歧桿菌的菌落數(shù)量高于對照組，而腸球菌和大腸桿菌菌落數(shù)量低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。FQ-PCR檢測各糞便細菌拷貝數(shù)也發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果。見表5。

表4 兩組患者治療前后腸道菌群數(shù)量比較（cfu·g-1）Tab.4 Comparison of number of intestinal flora in each group before and after treatment（cfu·g-1）

表5 兩組患者治療前后糞便細菌拷貝數(shù)比較（Log10 copies/g）Tab.5 Comparison of number of copies of fecal bacteriain each group before and after treatment（Log10 copies/g）

2.5 兩組患者治療前后炎癥指標(biāo)比較 與治療前比較，對照組患者治療后炎癥指標(biāo)均未見明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；中藥組患者治療后IL-17、TNF-α、Th17水平及Th17/Treg比例均顯著低于治療前，Treg水平高于治療前，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。治療后組間比較，中藥組患者治療后IL-17、TNF-α、Th17水平及Th17/Treg比例均低于對照組，Treg水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 見表6。

表6 兩組患者治療前后炎癥指標(biāo)比較Tab.6 Comparison of inflammation indexes in each group before and after treatment

2.6 不同Th17/Treg比例患者腸道益生菌總量比較 根據(jù)中藥組患者的Th17/Treg比例進行分組，將Th17/Treg比例＜0.5的患者作為低水平組，Th17/Treg比例＞0.5的患者作為高水平組。低水平組患者治療后益生菌總量明顯高于高水平組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 見表7。

表7 Th17/Treg高水平組與低水平組患者腸道益生菌總量比較（cfu）Tab.7 Th17/Treg comparison of total intestinal probiotics between high-level and low-level group（cfu）

3 討論

關(guān)于肥胖的病因，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有闡述?！端貑枴て娌≌摗吩唬骸按朔拭乐l(fā)也，此人必數(shù)食甘美而多肥也。肥者令人內(nèi)熱，甘者令人中滿，故其氣上溢，轉(zhuǎn)為消渴……治之以蘭。”明確指出飲食不節(jié)是引起肥胖的重要原因，肥胖最終導(dǎo)致消渴病的發(fā)生，而具有健脾化濕作用的藥物如蘭草可以治療肥胖。

筆者認為，胃強脾弱、腸化無權(quán)是肥胖的主要病因病機。胃強則胃火旺盛，消谷善饑，嗜食肥甘；脾弱則脾失健運，中焦壅滯，痰濕內(nèi)生，脾不散精，精化為濁，壅而為脂；腸化無權(quán)，則清濁不分，糟粕不降，甚則上承，積而為膏。胃為水谷之海，主受納腐熟水谷；脾主運化，為胃行其津液，二者相輔相成?！端貑枴そ?jīng)脈別論》云：“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾，脾氣散精?！薄端貑枴へ收摗吩唬骸捌⒅鳛槲感衅浣蛞阂病！逼⒅鬟\化，主升清，布精微，將葡萄糖、蛋白質(zhì)、脂肪等精微物質(zhì)輸布于五臟，而充養(yǎng)四肢百骸，故胃納正常、脾氣健運、升降有序、精歸正化則氣血陰陽平衡，反之則痰濕膏濁內(nèi)生，腹脹脘痞，形態(tài)肥胖。故胃強脾弱之意為胃的腐熟功能亢奮，而脾的運化功能無力，表現(xiàn)為消谷善饑，兼大便溏瀉。脾與胃相表里，經(jīng)過胃初步腐熟的飲食物適時下降到小腸，經(jīng)小腸分清泌濁，清者借脾氣升清布達五臟六腑，充養(yǎng)四肢百骸，濁者借其通降之性下輸闌門而入大腸。清濁各走其道，食物才得以充分消化吸收，氣調(diào)血暢。若小腸功能失司，化物無權(quán)，清濁不分，此時并非脾虛無法布散精微，而為小腸載濁上承，亦或但壅腸道，與新入飲食相雜一團，精濁相摻，脂膏不分，無力化物。

芪山配方顆粒由葛根芩連湯合六君子湯加減而成，主以健脾化濕、養(yǎng)陰清胃、升清降濁。方中生黃芪、淮山藥、絞股藍、茯苓補益脾氣、健脾化濕；黃連、黃芩大苦大寒，胃氣得苦寒則降，胃火得苦寒則消；葛根味辛性涼，能升發(fā)脾陽而鼓舞脾氣上行，使津液輸布以達到生津止渴之功，脾氣升胃氣降，則大氣一轉(zhuǎn)，運化自如；大黃瀉熱通腑，枳實、山楂理氣消食、化痰消積，蒼術(shù)芳香化濁，使腑氣得降、糟粕得瀉；川芎為血中之氣藥，作為佐藥，行氣活血，使周身氣血調(diào)暢。去掉葛根芩連湯原方中甘草，其目的在于防止血糖升高和水鈉儲留而導(dǎo)致的體重增加。全方使脾氣健運而水津四布，清痰濁內(nèi)熱，消肥甘中滿。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)芪山配方顆粒干預(yù)后不僅可以降低患者體質(zhì)量，改善血糖、血脂、血壓等生化指標(biāo)，而且能夠改善脘腹脹滿、乏力倦怠、頭重如裹、便溏不爽或大便干結(jié)、小便色黃、食欲旺盛、口苦口臭、舌質(zhì)胖大、舌苔黃膩、脈滑數(shù)等臨床癥狀。

研究證實，腸道菌群組成的差異與肥胖癥的發(fā)生關(guān)系密切，其機制主要與激活炎癥反應(yīng)、促進能量吸收、調(diào)節(jié)腸道通透性等有關(guān)[19-20]。還有研究表明，肥胖癥患者常伴隨炎癥信號通路的激活、免疫細胞浸潤等病理改變[21]。因此，本研究從腸道菌群-免疫炎癥途徑入手，探索芪山配方顆粒改善單純性肥胖的機制。結(jié)果提示，芪山配方顆?？梢哉{(diào)節(jié)腸道菌群，促使雙歧桿菌、脆弱擬桿菌、乳酸菌等腸道益生菌增加，大腸桿菌和腸球菌等有害菌群數(shù)量減少。

現(xiàn)代藥理研究也發(fā)現(xiàn)，芪山配方顆粒的組成藥物可影響腸道菌群。何旭云等[22]研究發(fā)現(xiàn)，生黃芪主要成分黃芪多糖能夠顯著抑制小鼠肥胖，并明顯調(diào)節(jié)腸道菌群。同時多項研究指出，葛根、黃芩、黃連、淮山藥、川芎、茯苓、黃芪等均能夠影響腸道菌群的組成和豐度[23-26]，從而進一步證實了芪山配方顆粒對腸道菌群的影響。

腸道菌群對免疫細胞的平衡具有重要的調(diào)控作用。方騫等[27]研究發(fā)現(xiàn)喘息型支氣管炎患兒糞便雙歧桿菌/大腸桿菌比例與Treg/Th17比例呈直線正相關(guān)關(guān)系。另有研究提示，小檗堿能夠調(diào)節(jié)大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)以及Th17/Treg細胞平衡[28]。而Th17細胞與Treg細胞之間平衡的破壞是很多免疫、代謝性疾病發(fā)病的關(guān)鍵因素[29-30]，因此本研究進一步檢測了芪山配方顆粒對炎癥細胞及炎癥因子的影響。結(jié)果顯示，中藥組患者IL-17、TNF-α水平和Th17/Treg比例均顯著降低，表明芪山配方顆粒能夠影響單純性肥胖患者體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。進一步探討Th17/Treg水平和腸道菌群關(guān)系發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)Th17/Treg低水平患者腸道益生菌總量顯著高于Th17/Treg高水平患者，表明單純性肥胖患者腸道益生菌數(shù)量和Th17/Treg比例存在關(guān)聯(lián)。因此可以推測，芪山配方顆?？赡芡ㄟ^提高單純性肥胖患者腸道菌群豐度和多樣性而抑制炎癥反應(yīng)，從而改善肥胖癥狀，而此作用可能與調(diào)節(jié)Th17/Treg比例有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)芪山配方顆粒能夠通過影響腸道菌群的構(gòu)成和豐度，從而調(diào)節(jié)Th17/Treg比例及炎性因子水平，減輕單純性肥胖濕熱蘊脾證患者臨床癥狀，起到重塑體型、改善生化指標(biāo)的作用，并最終達到治療肥胖的目的。然而本研究仍有不足之處，后續(xù)仍需進一步探究芪山配方顆粒發(fā)揮功效的主要成分以及腸道菌群影響體內(nèi)炎癥反應(yīng)的機制。