陳祖祥 葛彥志 周莉 王春雷 陳俊杰 童培建 單樂(lè)天 劉福存

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 杭州 310053 2.浙江省腫瘤醫(yī)院 3.海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）的常見(jiàn)類型，是最常見(jiàn)的一種關(guān)節(jié)炎性疾病[1-4]，影響滑膜和關(guān)節(jié)，導(dǎo)致疼痛及關(guān)節(jié)僵硬，使患者日常活動(dòng)、運(yùn)動(dòng)和工作受限，嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量[5]。KOA是一種多因素性疾病，累及整個(gè)關(guān)節(jié)，包括軟骨、骨和滑膜[6-7]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療輕、中度KOA的方案主要有生活方式改變、運(yùn)動(dòng)療法以及藥物療法，藥物療法包括服用非甾體類抗炎藥（nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDS）、 類固醇激素關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射、關(guān)節(jié)內(nèi)粘彈性物質(zhì)氨基葡萄糖補(bǔ)充療法[8-11]。以上療法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，NSAIDS因其胃腸道并發(fā)癥而限制了長(zhǎng)期應(yīng)用，而類固醇激素關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射及氨基葡萄糖補(bǔ)充療法在臨床上仍有爭(zhēng)議，因此當(dāng)前尚未發(fā)現(xiàn)理想的治療方法，也無(wú)法針對(duì)KOA的病因進(jìn)行治療。

中醫(yī)認(rèn)為，KOA屬“骨痹”“歷節(jié)”范疇，乃風(fēng)寒濕三氣痹阻關(guān)節(jié)所致[12-13]。張仲景在《傷寒雜病論》中應(yīng)用大量篇幅闡述了風(fēng)寒濕邪痹阻關(guān)節(jié)的傳變及治療，并確立了理法方藥。附子湯首見(jiàn)于《傷寒論·辨少陰病脈證并治》，主論陽(yáng)虛有寒導(dǎo)致的關(guān)節(jié)疼痛，有云：“少陰病，身體痛，手足寒，骨節(jié)痛，脈沉者，附子湯主之?！鼻捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，去毒附子湯（detoxicated Fuzi decoction，F(xiàn)ZT）中的君藥去毒附子具有抗炎鎮(zhèn)痛作用，并且可以調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨代謝[14-15]，但是FZT治療KOA的作用機(jī)制尚不明確。既往國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)多種信號(hào)通路與KOA發(fā)生密切相關(guān)，其中包括Wnt/β-連環(huán)蛋白 （Wnt/β-catenin）信號(hào)通路和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號(hào)通路等[16]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活能顯著減少軟骨細(xì)胞外基質(zhì)分泌，抑制軟骨細(xì)胞分化[17]。因此本研究擬從Wnt/β-catenin信號(hào)通路切入，通過(guò)構(gòu)建KOA大鼠模型，并且采用血清藥理學(xué)、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time quantitativepolymerase chain reaction，Real time-qPCR）及Western blot等方法，初步探索FZT治療KOA的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性無(wú)特殊病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)SD大鼠40只，8周齡，體質(zhì)量（180±20）g，購(gòu)于上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)碼：SCXK（滬）2018-0006]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心全封閉SPF環(huán)境中 [實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)碼：SYXK（浙）2018-0012]。 室溫25℃，相對(duì)濕度40%～60%，每日光照12h，自由攝食和飲水。本研究經(jīng)過(guò)浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理審查 （決議編號(hào)：ZSLL-2017-091）。

1.2 主要試劑 Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Takara公司（批號(hào)：AHF1813A、AI40832A）；SYBR Green購(gòu)于Bimake公司（批號(hào)：B21202）；碘乙酸（monoiodoacetate，MIA）購(gòu)于Sigma-Aldrich公司（批號(hào)：I4386）；β-actin、Wnt、糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β） 和β-catenin抗體購(gòu)于Cell Signaling Technology公司（批號(hào)：#3700S、#2721、#5676、#8480）；卷曲關(guān)聯(lián)蛋白（frizzled-related protein，F(xiàn)RZB）抗體購(gòu)于Abcam公司（批號(hào)：ab205284）；低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（low density lipoprotein receptor related proteins 5/6，LRP5/6） 抗體購(gòu)于Novusbiologicals公司（批號(hào)：NBP1-45687）；番紅O-固綠（safranine O-fast green，SO）染色液購(gòu)于Sigma公司（批號(hào)：HT90432）；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraaceticacid，EDTA）購(gòu)于Solarbio公司（批號(hào)：E8030）。

1.3 主要儀器 ScopeA1型光學(xué)顯微鏡購(gòu)于德國(guó)ZEISS公司；37370足底熱輻射測(cè)痛儀購(gòu)于意大利UGO BASILE公司；YLS-3E電子壓痛測(cè)定儀為安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；SW-CJ-1F層流超凈工作臺(tái)購(gòu)于蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；100μm細(xì)胞篩、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱均為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 FZT的制備 全方由去毒附子12g、茯苓9g、人參6g、白術(shù)12g、白芍9g等藥組成，上述飲片均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠提供。先按前期方法制備去毒附子提取物[14-15]，將濃縮的去毒附子提取液加入其他藥材，加入約10倍量水，提取2次，每次0.5h，減壓濃縮成含有生藥2g·mL-1的藥液。根據(jù)等效劑量系數(shù)折算法計(jì)算藥品稀釋濃度[18]，得到FZT終濃度為：低劑量2.4g·kg-1，中劑量4.8g·kg-1（相當(dāng)于臨床用藥劑量），高劑量9.6g·kg-1。

1.4.2 FZT含藥血清的制備 選擇10只SD大鼠隨機(jī)分為空白血清組和FZT含藥血清組，每組5只。FZT含藥血清組給予中劑量FZT灌胃，空白血清組給予相同劑量的0.9%氯化鈉溶液灌胃，每天灌胃2次，連續(xù)7d。于末次灌胃2h后，大鼠腹腔注射麻醉，無(wú)菌條件下心臟采血，4℃保存2h后，3 000r/min離心10min，取上層血清，56℃水浴滅活，以0.22μm微孔濾膜濾過(guò)除菌，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 動(dòng)物處理

1.4.3.1 分組與造模 將其余30只大鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，F(xiàn)ZT低、中、高劑量組，每組6只。除正常組外，其他各組采用關(guān)節(jié)腔注射MIA的方法造模，以3%戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔注射麻醉，麻醉滿意后，剃去膝關(guān)節(jié)局部被毛，消毒后固定大鼠并屈曲膝關(guān)節(jié)，將濃度為40mg·mL-1的MIA 50μL微量注射至關(guān)節(jié)腔內(nèi)。

1.4.3.2 干預(yù)方法 MIA注射1周后進(jìn)行疼痛行為學(xué)檢測(cè)，造模后的大鼠疼痛閾值顯著降低即造模成功[19]。造模成功后開(kāi)始灌胃給藥，F(xiàn)ZT低、中、高劑量組分別以2.4、4.8、9.6g·kg-1FZT灌胃，模型組和正常組以同劑量的0.9%氯化鈉溶液灌胃，均為1次/d，連續(xù)4周。

1.4.4 疼痛行為學(xué)檢測(cè) 首次給藥前和末次給藥后，對(duì)各組大鼠進(jìn)行疼痛行為學(xué)檢測(cè)。

1.4.4.1 壓痛檢測(cè) 固定待測(cè)大鼠，放松其腿部，采用電子壓痛測(cè)定儀的感應(yīng)探針刺壓大鼠足趾區(qū)域，待一定壓力下大鼠出現(xiàn)掙扎抬腿，暫停刺壓并記錄壓力強(qiáng)度。重復(fù)檢測(cè)3次后取平均值，為壓痛閾值。

1.4.4.2 熱痛檢測(cè) 將待測(cè)大鼠置于獨(dú)立小室中，使其自由活動(dòng)直至安靜狀態(tài)，而后啟動(dòng)底部的加熱儀，觀察大鼠足部動(dòng)作，一旦足部收縮立即停止，記錄反應(yīng)時(shí)間。重復(fù)檢測(cè)3次后取平均值，為熱痛閾值。

1.4.5 原代軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng) 將3周齡左右的SD大鼠處死，無(wú)菌條件下剪取雙側(cè)股骨頭及膝關(guān)節(jié)，以75%乙醇充分浸泡，剔除關(guān)節(jié)周圍的肌肉和肌腱組織，打開(kāi)關(guān)節(jié)腔，削取軟骨組織塊，置入無(wú)菌培養(yǎng)皿。加入磷酸鹽緩沖液 （phosphate buffer saline，PBS）充分漂洗，進(jìn)而將軟骨塊剪碎至lmm3大小，濾干后置入盛有0.2%的Ⅱ型膠原酶的廣口瓶中，于37℃恒溫震蕩箱中消化，40min后將上層消化液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，800r/min離心5min，收集底部細(xì)胞，再加入含10%胎牛血清的杜爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）制成細(xì)胞懸液，過(guò)濾后計(jì)數(shù)。 調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)·mL-1，置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.6 組織病理學(xué)觀察 末次給藥后1周，過(guò)量麻醉處死各組大鼠，剪取膝關(guān)節(jié)并剔除多余肌肉組織，浸入甲醛溶液中固定。1周后取出，用水沖洗干凈，再以EDTA制備的脫鈣液進(jìn)行脫鈣。待關(guān)節(jié)組織變軟后，依次完成脫水、包埋、切片和SO染色，光鏡下觀察，并分別參照Mankin評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[20]進(jìn)行評(píng)分：（1）形態(tài)評(píng)分：形態(tài)正常為0分，表面不規(guī)則為1分，關(guān)節(jié)出現(xiàn)血管翳為2分，關(guān)節(jié)出現(xiàn)血管翳和軟骨表面不規(guī)則為3分，軟骨表面存在裂隙為4分，軟骨深部存在裂隙為5分，鈣化帶存在裂隙為6分；（2）軟骨細(xì)胞評(píng)分：軟骨細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量正常為0分，彌漫性軟骨細(xì)胞增多為1分，局部軟骨細(xì)胞增多為2分，軟骨細(xì)胞過(guò)少為3分；（3）軟骨基質(zhì)染色評(píng)分：染色區(qū)域正常為0分，染色區(qū)域輕度減少為1分，染色區(qū)域中度減少為2分，染色區(qū)域重度減少為3分，病理切片未著色為4分；（4）潮線完整性評(píng)分：潮線完整為0分，潮線被血管破壞為1分。評(píng)分總分為0～14分，由2人以上進(jìn)行雙盲評(píng)分。

1.4.7 MTT檢測(cè)FZT對(duì)軟骨細(xì)胞增殖活力的影響 將軟骨細(xì)胞以4×105個(gè)·mL-1的密度接種于96孔板中，每孔加入Iscove改良的杜爾伯克培養(yǎng)基（Iscove's modified Dulbecco's medium，IMDM）100μL，貼壁培養(yǎng)24h后移除培養(yǎng)基，將細(xì)胞分為空白組、MIA組、干預(yù)組，其中空白組加入空白培養(yǎng)基100μL，MIA組加入MIA100μL，干預(yù)組在MIA組基礎(chǔ)上加入不同濃度的FZT含藥血清 （2.5%、5%、10%、15%、20%），分別培養(yǎng)24、48、72h。 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)向每孔中加入MTT溶液10μL，37℃孵育4h后再加入二甲基亞砜150μL，酶標(biāo)儀上檢測(cè)450nm吸光度（absorbance 450，A450），重復(fù)操作3次。

1.4.8 Real-time qPCR檢測(cè)相關(guān)mRNA的表達(dá) 將軟骨細(xì)胞分為NC組、TNF-α組、TNF-α+FZT組。其中，TNF-α組、TNF-α+FZT組均采用10ng·mL-1的TNF-α預(yù)處理6h，TNF-α+FZT組使用10%的FZT含藥血清處理24h，其余兩組使用空白培養(yǎng)基處理24h。各組細(xì)胞處理完成后加入氯仿劇烈振蕩，靜置5min后12 000r/min離心15min，取上清液并加入等量異丙醇，混勻后靜置10min，再以12 000r/min離心10min，去上清液，75%乙醇清洗，干燥沉淀后，加入RNase-free水溶解，提取總RNA。使用All-in-one cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，再用SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒檢測(cè)軟骨2型膠原（collgen type 2，Col2）、10型膠原（collgen type 10，Col10）、 基質(zhì)金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP13）、帶有血小板凝血酶敏感蛋白結(jié)構(gòu)域的解聚素與金屬蛋白酶4（adisintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4，Adamts4）、帶有血小板凝血酶敏感蛋白結(jié)構(gòu)域的解聚素與金屬蛋白酶5（adisintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs5，Adamts5），Wnt/β -catenin信號(hào)通路相關(guān)因子FRZB、Wnt、LRP5/6、GSK-3β、β-catenin的mRNA表達(dá)，以2-ΔΔCt計(jì)算結(jié)果表示各目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物由生工生物工程 （上海）股份有限公司合成。見(jiàn)表1。反應(yīng)總體系為20μL，反應(yīng)條件為：95℃變性5min，循環(huán)重復(fù)95℃變性10s，60℃退火和延伸30s，共40個(gè)循環(huán)。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.4.9 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá) 細(xì)胞分組和處理同1.4.8。收集細(xì)胞，去掉培養(yǎng)基，以PBS洗滌2次后加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min，超聲破碎15s，離心收集上清液，以聚氰基丙烯酸正丁酯（butyleyanoacrylate，BCA）試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，取等濃度樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresi，SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜后封閉2h，洗膜后分別加入Wnt、LRP5/6、FRZB、GSK-3β和β-catenin一抗 （稀釋比例：1:1 000），4℃過(guò)夜，洗膜后加入二抗（稀釋比例：1:10 000），化學(xué)發(fā)光試劑（electrochemiluminescence，ECL）顯色與定影。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示。組間總體比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）檢驗(yàn)，兩兩比較均采用students-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠疼痛行為學(xué)結(jié)果比較 各組間總體比較，大鼠的熱痛閾值和壓痛閾值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.01）。 與正常組比較，模型組大鼠的熱痛閾值和壓痛閾值顯著降低（P＜0.01，P＜0.01）；FZT灌胃干預(yù)后，F(xiàn)ZT低、中、高劑量組大鼠的熱痛閾值和壓痛閾值較模型組顯著提高 （均P＜0.01），并靠近正常水平。見(jiàn)圖1及表2、3。上述結(jié)果表明，F(xiàn)ZT低、中、高劑量對(duì)MIA造成的KOA關(guān)節(jié)疼痛有顯著緩解作用。

表2 各組大鼠壓痛閾值比較（±s，g）Tab.2 Comparison of mechanical withdrawal threshold in each group（±s，g）

表2 各組大鼠壓痛閾值比較（±s，g）Tab.2 Comparison of mechanical withdrawal threshold in each group（±s，g）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01Note:Compared with normal group，##P＜0.01;compared with model group，**P＜0.01

組別n 造模后第4周正常組 6 267.61±33.57模型組 6 132.89±26.61##FZT 低劑量組 6 224.33±13.31**FZT 中劑量組 6 241.20±29.80**FZT 高劑量組 6 259.40±21.20**

表3 各組大鼠熱痛閾值比較（±s，s）Tab.3 Comparison of thermal withdrawal latency in each group（±s，s）

表3 各組大鼠熱痛閾值比較（±s，s）Tab.3 Comparison of thermal withdrawal latency in each group（±s，s）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01Note:Compared with normal group，##P＜0.01;compared with model group，**P＜0.01

組別n 造模后第4周正常組 6 11.50±1.27模型組 6 4.83±1.05##FZT 低劑量組 6 8.07±1.35**FZT 中劑量組 6 9.91±1.20**FZT 高劑量組 6 10.90±1.00**

圖1 各組大鼠疼痛行為學(xué)結(jié)果比較Fig.1 Comparison of pain-related behavioral results in each group

2.2 各組大鼠KOA的組織病理學(xué)結(jié)果比較 SO染色提示，正常組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表面光滑、形態(tài)完整，基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞排列整齊、分布區(qū)域均勻、層次清晰，未見(jiàn)軟骨細(xì)胞肥大性退變，軟骨下骨小梁區(qū)域正常，無(wú)斷裂或減少。模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)明顯缺損和形態(tài)破壞，隨處可見(jiàn)降解的軟骨基質(zhì)，軟骨細(xì)胞大量丟失，可見(jiàn)典型的肥大性退變。FZT各劑量組中，關(guān)節(jié)軟骨改善明顯，F(xiàn)ZT低劑量組關(guān)節(jié)存在少量軟骨細(xì)胞，但仍有肥大化趨勢(shì)，較模型組改善明顯；FZT中劑量組關(guān)節(jié)軟骨可見(jiàn)許多正常形態(tài)軟骨細(xì)胞，軟骨基質(zhì)逐漸恢復(fù)正常；FZT高劑量組關(guān)節(jié)軟骨基本恢復(fù)正常，可見(jiàn)大量正常形態(tài)軟骨細(xì)胞，軟骨基質(zhì)染色充分。見(jiàn)圖2。Mankin病理評(píng)分表明，模型組較正常組顯著增高（P＜0.01），F(xiàn)ZT各劑量組評(píng)分較模型組顯著降低（均P＜0.01）。見(jiàn)圖3。

圖2 各組大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)觀察（SO染色，100×）Fig.2 Histopathological observation of rat joints in each group（SO staining，100×）

圖3 各組大鼠關(guān)節(jié)組織Mankin評(píng)分比較Fig.3 Comparison of Mankin's scoring of rat joints in each group

2.3 各組軟骨細(xì)胞增殖活力比較 MTT結(jié)果提示，加入FZT含藥血清共培養(yǎng)24、48和72h后，大鼠軟骨細(xì)胞增殖活力顯著增強(qiáng)，濃度從2.5%增加至20%，促增殖作用明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。作用24h和48h后，10%的FZT含藥血清促增殖作用最強(qiáng)，隨著濃度增加，促增殖作用趨于平穩(wěn)。見(jiàn)表4。因此本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用10%的FZT含藥血清進(jìn)行干預(yù)。

表4 各組大鼠軟骨細(xì)胞增殖活力比較（%，±s）Tab.4 Comparison of proliferative activity in each group（%，±s）

表4 各組大鼠軟骨細(xì)胞增殖活力比較（%，±s）Tab.4 Comparison of proliferative activity in each group（%，±s）

注：與同時(shí)點(diǎn)2.5%含藥血清比較，◆P＜0.05；與同時(shí)點(diǎn)5%含藥血清比較，◇P＜0.05Note:Compared with 2.5% drug-containing serum at the same time，◆P＜0.05;compared with 5% drug containing serum at the same time，◇P＜0.05

含藥血清濃度 給藥后24h 給藥后48h 給藥后72h 2.5% 4.97±4.55 3.38±3.31 7.60±2.90 5% 11.32±3.70◆ 8.57±2.49◆ 15.31±4.01◆10% 19.48±5.01◆◇ 12.57±3.49◆◇ 23.60±3.02◆◇15% 19.40±6.60◆◇ 12.43±2.72◆◇ 27.70±6.92◆◇20% 19.24±4.03◆◇ 11.30±4.07◆◇ 27.91±2.91◆◇

2.4 各組大鼠軟骨細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)比較 與NC組比較，TNF-α組軟骨細(xì)胞Col10、MMP13、Adamts4、Adamts5、Wnt、LRP5/6、GSK-3β以及β-catenin顯著上調(diào)，而Col2顯著下調(diào)（均P＜0.01）；經(jīng)10%的FZT含藥血清干預(yù)后，上述基因的mRNA表達(dá)變化均被顯著逆轉(zhuǎn)（均P＜0.01），而軟骨細(xì)胞FRZB的mRNA表達(dá)略有下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見(jiàn)圖4。

圖4 各組細(xì)胞Col2、Col10、MMP13、Adamts4、Adamts5、FRZB、Wnt、LRP5/6、GSK-3β、β-catenin的mRNA表達(dá)比較Fig.4 Comparison of mRNA expression of Col2，Col10，MMP13，Adamts4，Adamts5，F(xiàn)RZB，Wnt，LRP5/6，GSK-3β and β-catenin in each group

2.5 各組大鼠軟骨細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與NC組比較，TNF-α引起軟骨細(xì)胞Wnt、LRP5/6、FRZB、GSK-3β和β-catenin的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（均P＜0.01）；經(jīng)FZT含藥血清干預(yù)后，上述蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)（均P＜0.01）。見(jiàn)圖5。

圖5 各組細(xì)胞Wnt、LRP5/6、FRZB、GSK-3β和β-catenin蛋白表達(dá)比較Fig.5 Comparison of protein expression of Wnt，LRP5/6，F(xiàn)RZB，GSK-3β and β-catenin in each group

3 討論

0A是以關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞，滑膜炎癥，骨贅形成和軟骨下骨硬化為基本病理改變的疾病，主要臨床表現(xiàn)為慢性關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)僵硬、腫脹、畸形、活動(dòng)受限等。在世界范圍內(nèi)的所有成人關(guān)節(jié)病中，膝關(guān)節(jié)已經(jīng)成為OA最好發(fā)的部位[21]。研究提示，一生中罹患KOA的概率是14%，45歲以上的人群中40%患有不同程度的OA[4]。隨著人口的老齡化趨勢(shì)的上升和肥胖率的增加，可以預(yù)料，如果KOA的治療水平不能夠得到相應(yīng)的提升，那么KOA將對(duì)醫(yī)療系統(tǒng)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成沉重的負(fù)擔(dān)[4]。由于相關(guān)發(fā)病機(jī)制尚不清楚，因此目前臨床上對(duì)于KOA的治療手段非常有限。

近來(lái)研究表明，多種信號(hào)通路與KOA的發(fā)生密切相關(guān)，其中包括Wnt/β-catenin信號(hào)通路和TGF-β信號(hào)通路等。在大多數(shù)關(guān)節(jié)炎中都存在Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常激活，Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能參與了關(guān)節(jié)組織中軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞的功能調(diào)控[22]。在Wnt/β-catenin經(jīng)典信號(hào)通路中，分泌型的配體蛋白Wnt與膜表面受體蛋白FRZB結(jié)合后，激活胞內(nèi)蓬亂蛋白（dishevelled，DVL）[23]。DVL通過(guò)抑制GSK-3β等蛋白形成的β-catenin降解復(fù)合物的活性，從而可以穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)中游離狀態(tài)β-catenin蛋白的水平。細(xì)胞質(zhì)中穩(wěn)定積累的β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核后，與T細(xì)胞因子淋巴樣增強(qiáng)因子（T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF）轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)合，啟動(dòng)下游靶基因如原癌基因c-myc、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）等的轉(zhuǎn)錄[24]。Wnt-7a通過(guò)抑制2型膠原蛋白和蛋白聚糖的合成，能夠促使關(guān)節(jié)軟骨去分化，并且抑制其凋亡[16]；Wnt-5a和Wnt-5b通過(guò)對(duì)Cyclin D1和p130的調(diào)節(jié)，能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，而推遲其分化[17]。βcatenin在成骨細(xì)胞中廣泛表達(dá)，可與關(guān)節(jié)形成必需的轉(zhuǎn)錄因子Y染色體性別決定區(qū)-盒轉(zhuǎn)錄因子9（sex-determing region of Y chromosome-box transcription factor 9，SOX9）相關(guān)聯(lián)，而SOX9的功能是抑制βcatenin的活性從而調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞分化[25]。Hill等[26]研究表明，β-catenin在成骨細(xì)胞前體中有自我修復(fù)功能，Wnt/β-catenin信號(hào)通路是防止成骨細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化所必需的。綜合以上研究的結(jié)果，筆者推測(cè)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能是治療KOA的有效途徑。

祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的認(rèn)識(shí)中，OA屬于 “痹癥”“骨痹”范疇，其病因可分為內(nèi)外兩端?！端貑?wèn)·痹論》曰“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹”“痹者，重感于風(fēng)寒濕之氣也”?！断ス顷P(guān)節(jié)炎中醫(yī)診療專家共識(shí)（2015年版）》將KOA主要證型歸納為：氣滯血瘀、寒濕痹阻、肝腎虧虛、氣血虛弱四個(gè)證型，其中又以寒濕痹阻證較為多見(jiàn)[27]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為患者體質(zhì)素虛，腠理空疏，營(yíng)衛(wèi)不固，風(fēng)寒濕邪乘虛侵襲人體，導(dǎo)致氣血運(yùn)行受阻，進(jìn)而產(chǎn)生疼痛、腫脹、屈伸不利等一系列癥狀，是本病的根本病機(jī)[27]，所以針對(duì)KOA的中醫(yī)治療多以祛邪扶正為主。

中醫(yī)對(duì)附子湯的應(yīng)用始于《傷寒論》，有云：“少陰病，身體痛，手足寒，骨節(jié)痛，脈沉者，附子湯主之?！狈街杏酶阶訙啬I以扶真陽(yáng)之本，用人參大補(bǔ)元?dú)庖苑龊筇熘?，加茯苓、白術(shù)健脾利水化濕，又以芍藥以制術(shù)、附之溫燥以護(hù)陰，且配苓、術(shù)助疏泄以利水。歷代醫(yī)家認(rèn)為本方重在溫補(bǔ)元陽(yáng)、以散寒濕，將其譽(yù)為“溫補(bǔ)第一方”?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，以上5味藥的藥理活性成分均具有鎮(zhèn)痛、抗炎等作用[28-32]。劉毅等[33]以附子湯從少陰辨證治療寒濕型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎80例，結(jié)果治愈7例、顯效25例、有效39例，總有效率為88.8%。由此證實(shí)，附子湯具有治療KOA的臨床應(yīng)用價(jià)值。

疼痛是KOA患者的主要癥狀，減輕和消除疼痛是臨床治療的主要目標(biāo)之一[34-35]。KOA疼痛的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，滑膜炎癥是其主要的原因[36]?；ぱ装Y是OA的重要特征，表現(xiàn)為滑膜增厚，滲出增多，導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫脹，是造成炎性疼痛的主要成因[37]。在本研究中，采用MIA關(guān)節(jié)腔注射制備KOA大鼠模型，1周后疼痛行為學(xué)顯示模型組大鼠的壓痛和熱痛閾值較正常組顯著降低，這表明KOA大鼠模型成功建立。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行FZT干預(yù)。干預(yù)第4周后，F(xiàn)ZT低、中、高劑量組大鼠的熱痛和壓痛閾值較模型組均顯著提高，提示FZT能提高KOA模型大鼠的疼痛閾值，而且作用效果可能與劑量有關(guān)，但是其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

軟骨損傷是OA最主要的病理改變。楊帆[38]研究表明，KOA兔模型的軟骨結(jié)構(gòu)紊亂，層次不清，表層軟骨出現(xiàn)剝脫且表層細(xì)胞減少，局部軟骨細(xì)胞簇集，潮線消失。本研究中，模型組軟骨出現(xiàn)典型的KOA樣病變，F(xiàn)ZT各劑量組軟骨雖有少量軟骨細(xì)胞肥大，但與模型組比較，均有一定程度的改善和修復(fù)。同時(shí)Mankin評(píng)分也說(shuō)明FZT能夠改善軟骨退變的表現(xiàn)，而且其作用可能與劑量有關(guān)。

膠原酶誘導(dǎo)的Col2降解和蛋白聚糖酶誘導(dǎo)的聚集蛋白聚糖的降解是OA的早期病理標(biāo)志[39]。MMP13作為主要的膠原酶，而Adamts4/5作為主要的聚集蛋白聚糖酶，在OA進(jìn)展過(guò)程中能夠降解軟骨中的Col2和聚集蛋白聚糖[40-41]。Col10是OA中晚期軟骨細(xì)胞肥大標(biāo)記物，OA由于軟骨細(xì)胞肥大和鈣化，導(dǎo)致Col10水平上調(diào)，與OA患者不同程度的軟骨退化和炎癥有關(guān)[42]。在OA的發(fā)展過(guò)程中，促炎細(xì)胞因子如TNF-α，通過(guò)激活軟骨細(xì)胞分解代謝參與軟骨降解，KOA患者滑液中TNF-α的濃度升高也已得到證實(shí)[43]。因此，本研究應(yīng)用TNF-α處理的軟骨細(xì)胞作為KOA樣體外模型，并進(jìn)行細(xì)胞和分子實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估FZT對(duì)KOA的治療機(jī)制。本研究結(jié)果證實(shí)，TNF-α可以上調(diào)Adamts4/5、MMP13、Col10的表達(dá)并下調(diào)COL2的表達(dá)，F(xiàn)ZT含藥血清可以逆轉(zhuǎn)上述改變。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可以激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，破壞軟骨，促進(jìn)降解；FZT含藥血清則可以降低Wnt、LRP5/6、GSK-3β和β-catenin的 mRNA表達(dá)和Wnt、LRP5/6、FRZB、GSK-3β和β-catenin蛋白的表達(dá)。FRZB在干預(yù)前后雖然mRNA水平?jīng)]有變化，但是在蛋白水平上則顯著改變，這可能是由于檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的不同，也可能是由于轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的降解以及翻譯過(guò)程中的調(diào)控和修飾[44]，導(dǎo)致了mRNA和蛋白表達(dá)水平的差異，這些需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，F(xiàn)ZT能有效改善KOA大鼠的疼痛癥狀，防止軟骨退化，其分子機(jī)制與Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。本研究為FZT治療KOA的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)，也為FZT的臨床安全應(yīng)用和二次開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，由于KOA的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及病變部位不止軟骨，還有滑膜與軟骨下骨等，所以需要進(jìn)一步的研究來(lái)闡釋FZT治療KOA的機(jī)制，這對(duì)于了解KOA的發(fā)病機(jī)制和開(kāi)發(fā)治療KOA的藥物具有重要意義。