馬 悅，于 冰

（1黑龍江大學農(nóng)業(yè)微生物技術教育部工程研究中心，哈爾濱150500；2黑龍江大學生命科學學院/黑龍江省普通高校分子生物學重點實驗室，哈爾濱150080）

0 引言

由nsLTPs基因編碼的非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(non-specific lipid transfer protein，nsLTPs)具有促進磷脂在細胞膜間轉(zhuǎn)移的能力并因此命名[1-2]。nsLTPs在植物界廣泛分布，屬于醇溶蛋白超家族[3]，具有促進兩親分子在細胞膜間交換和轉(zhuǎn)移的能力，兩親分子指既具有親水性、又具有親脂性的分子，例如：磷脂、糖脂、類固醇、?；o酶A和脂肪酸等[4]。

nsLTPs在植物的生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用，主要參與植物種子萌發(fā)、角質(zhì)層蠟形成[5]、表皮細胞毛狀體形成[6]、細胞壁延伸過程[7]，同時參與調(diào)控根瘤共生[8]、植物激素反應和光合作用等過程[9]。隨著對nsLTPs功能研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)nsLTPs在植物生物及非生物脅迫應答中發(fā)揮重要作用，但是對于此方面的研究缺乏全面的梳理，鮮有綜述報道。本文主要闡述了植物非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白nsLTPs的結構特點、亞細胞定位及分類，并結合近年來的研究報道，重點介紹了nsLTPs基因參與植物逆境脅迫應答的最新研究進展，總結了植物不同物種中nsLTPs基因響應生物脅迫、非生物脅迫的調(diào)控途徑，以期為相關領域的科研人員提供借鑒和參考。

1 nsLTPs的結構特點、亞細胞定位及分類

1.1 nsLTPs的結構特點及亞細胞定位

nsLTPs相對分子量較小，一般為7k～10kDa[10]，等電點8.8～10，是一種小肽[11]，每個小肽中含有8個高度保守的半胱氨酸殘基骨架，其一般形式為C-Xn-C-Xn-CC-Xn-CXC-Xn-C-Xn-C[12]。除此之外，nsLTPs的N端具有疏水信號肽，是引導新合成的nsLTPs蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移的短肽鏈[13]。nsLTPs靠近C端具有鈣調(diào)素(CaM)結合位點[14]，CaM結合位點可以調(diào)節(jié)nsLTPs與 Ca2+的相互作用[15]。

nsLTPs的8個半胱氨酸殘基通過4個二硫鍵進行結合[16]，可以將nsLTPs折疊成一個非常緊湊的結構——含有內(nèi)疏水腔的三維結構[17]，賦予了nsLTPs熱穩(wěn)定性和蛋白水解抗性[18]。該疏水腔充當脂類和其他疏水分子的結合位點[19]；疏水腔能夠在脂質(zhì)雙層之間轉(zhuǎn)移各種脂質(zhì)分子，能夠容納許多不同的配體，如：脂肪酸、脂肪?；o酶A、磷脂、糖脂和羥基化脂肪酸[20]。

Anthony等[21-23]對甘藍型油菜(BrassicarapaL.)中的BrLTP2.1蛋白進行了結構預測，BrLTP2.1蛋白全長為98個氨基酸，使用i-TASSER軟件對不帶N端信號肽的BrLTP2.1成熟氨基酸序列進行三級結構建模，預測結果顯示，與大多數(shù)nsLTPs一樣，BrLTP2.1具有由8個半胱氨酸殘基形成的4個α螺旋和4個二硫鍵（圖1），紅色為4個α螺旋（從N端到C端標記為H1～H4）、黃色為4個二硫鍵；基于其三級結構，預測了BrLTP2.1與脂質(zhì)LP3（1-硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿）結合的疏水腔（圖2）[23]。

圖1 BrLTP2.1的結構建模

圖2 BrLTP2.1與脂質(zhì)LP3結合

不同nsLTPs在細胞中的亞細胞定位不同，可以定位在質(zhì)膜[23]、細胞壁或細胞質(zhì)中[24]。

1.2 nsLTPs的分類

根據(jù)分子質(zhì)量，nsLTPs分為兩種亞家族，分別是nsLTPⅠ和nsLTPⅡ亞家族[25]。LTPⅠ亞家族成員分子質(zhì)量約為9k～10kDa，N端是長約21～27個氨基酸的疏水信號肽序列。LTPⅡ亞家族成員的大小約為7 kDa，N端是27～35個氨基酸組成的疏水信號肽序列[26]。LTPⅠ與LTPⅡ的疏水腔結構不同[27]，LTPⅠ亞家族成員具有隧道狀疏水腔，LTPⅡ亞家族成員有2個相鄰的疏水腔并且可塑性更大，因此脂轉(zhuǎn)移活性更大[28]。LTPⅡ亞家族成員的結構特點使其具有更高的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運能力[29]。LTPⅠ與LTPⅡ形成二硫鍵的配對方式不同，LTPⅠ亞家族成員中半胱氨酸殘基配對組合為1-6、2-3、4-7和5-8，LTPⅡ亞家族成員中半胱氨酸殘基配對組合為1-5、2-3、4-7和6-8[25]。

2011年，Edstam等[30]基于序列相似性、糖基磷脂酰肌醇(GPI)修飾位點、內(nèi)含子位置和半胱氨酸殘基之間的間隔，又提出了一種nsLTPs的新的分類方式。該種分類方式保留了根據(jù)分子質(zhì)量建立的LTPⅠ和LTPⅡ亞家族分類方式，另外建立了C，D，E，F(xiàn)，G，H，J和K型亞家族分類方式。具體分類見表1[18]，其中C代表nsLTPs中保守的半胱氨酸，X代表任意氨基酸，X的下角標數(shù)字代表氨基酸個數(shù)。

表1 nsLTPs的I、Ⅱ亞家族及C-K亞家族分類方式

2 nsLTPs基因參與植物逆境脅迫應答研究

在植物的生長過程中，植物會受到各種逆境脅迫的影響，包括生物脅迫和非生物脅迫，這些脅迫是植物的生存與發(fā)育過程中的不利因素，進一步會衍生出糧食減產(chǎn)以及品質(zhì)下降等問題[3]。近年來，關于通過反向遺傳學技術研究nsLTPs基因參與植物逆境脅迫應答研究報道較多，本文總結了近年來在不同植物中nsLTPs基因參與植物逆境脅迫應答的相關研究[19-29]，見表2。以下分別對nsLTPs基因參與植物生物脅迫應答和非生物脅迫應答功能及調(diào)控途徑進行具體介紹。

2.1 nsLTPs基因參與植物生物脅迫應答研究

植物nsLTP基因在植物抵抗細菌和真菌侵襲的保護中起著關鍵作用[42]，目前在甘藍型油菜(Brassica rapaL.)、大麥(HordeumvulgareL.)、胡椒(Piper nigrumL)、煙草(NicotianatabacumL.)、擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)、馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)中進行了nsLTP基因參與生物脅迫應答功能研究[43]，表明nsLTP基因可以增強植物對真菌和細菌病原體的抗菌性，提高植物的抗病性[31-41]（表2）。

表2 nsLTPs基因參與植物逆境脅迫應答研究

續(xù)表2

nsLTPs具有抗菌性能[44]，是與病程相關的蛋白[32]，參與植物防御機制[45]。2018年，徐揚等[46]研究表明煙草中的NtLTPs能夠通過參與抗病信號轉(zhuǎn)導途徑進而提高植物的抗病性。NtLTPs是一種病程相關蛋白(pathogenesis related protein,PR protein)，青枯菌(Ralstoniasolanacearum)侵染煙草后，NtLTP4能夠通過增強活性氧的清除和降低氣孔開度來提高轉(zhuǎn)基因煙草對青枯菌的抗性。MAPK級聯(lián)信號通路在植物響應生物脅迫中發(fā)揮著重要的作用，創(chuàng)傷誘導蛋白激酶(Wound-induced protein kinase，WIPK)是 MAPK家族成員之一[3]。通過MAPK級聯(lián)信號通路NtNPK1-NtMEK2-NtWIPK進行信號傳遞，進一步繼續(xù)將信號傳遞給位于NtWIPK下游的NtLTP4，NtLTP4與NtWIPK存在互作關系，通過增強NtLTP4蛋白的穩(wěn)定性來參與抗病防御過程，從而提高了煙草對的青枯病的抗病性[46]（圖3A）。

2.2 nsLTPs基因參與植物非生物脅迫應答研究

nsLTPs基因參與非生物脅迫應答有助于植物適應環(huán)境條件的變化[40]。nsLTPs家族成員能夠響應一種或多種非生物脅迫[3]，包括干旱、低溫、高溫、鹽堿、滲透脅迫、過氧化氫、重金屬脅迫等。nsLTPs還顯示出對非生物脅迫相關植物激素的應答反應，包括脫落酸(ABA)，水楊酸，茉莉酸甲酯和乙烯利等。

在植物中，已經(jīng)報道nsLTPs基因受到多種非生物脅迫或植物激素的誘導表達。潘那利番茄(Lycopersiconpennellii)中的LpLtp1和LpLtp2基因受到干旱誘導表達[41]。無芒雀麥(Bromusinermis)中的BG-14基因在干旱、冷和熱等非生物脅迫下被誘導表達[39]。擬南芥中的LTP基因AtAZI1受到低溫、鹽脅迫以及乙烯誘導表達[35]。一種從冷脅迫的卷心菜葉中分離的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白同源物：冷凍保護素，可保護分離的葉綠體類囊體膜免受凍融損害[47]。目前在甘藍型油菜(BrassicarapaL.)、馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)、玉米 (ZeamaysL.)水稻(OryzasativaL.)、擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)、煙草(NicotianatabacumL.)、胡椒(PipernigrumL.)等植物中進行了nsLTP基因參與非生物脅迫應答功能研究，表明nsLTP基因可以增強植物對高溫、低溫、干旱和鹽等非生物脅迫抗逆性（表2）。

對于nsLTPs參與植物非生物脅迫應答的調(diào)控途徑只有少量相關報道；有報道顯示nsLTPs受上游蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子、激酶或磷酸酶）調(diào)節(jié)[48]。

徐揚等[46]研究發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，NtLTP4過表達煙草中，NHX1和HKT1兩個關鍵的Na+轉(zhuǎn)運體的表達量明顯高于野生型；研究表明NtLTP4能夠通過調(diào)控NHX1和HKT1促進Na+向液泡的轉(zhuǎn)運以及Na+由地上向地下運輸這2個過程，增強煙草對Na+的清除，減弱了Na+對植物細胞的毒害作用，從而提高鹽脅迫的耐受性（圖3B），并通過降低蒸騰速率和氣孔開度增強對干早脅迫的耐受性[46]。

Guo等[49]研究發(fā)現(xiàn)，原核表達體系純化的擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)AtLTP3蛋白在體外能夠與脂類結合，轉(zhuǎn)錄因子AtMYB96通過直接和AtLTP3基因啟動子的直接結合，正調(diào)節(jié)AtLTP3蛋白參與植物對低溫和干旱脅迫的耐受能力（圖3C）。AtLTP3可以結合脂質(zhì)并將其從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞膜或細胞壁上，形成角質(zhì)層蠟，從而保護植物免受和干旱脅迫的侵害。

Pitzschkea等[35]研究發(fā)現(xiàn)，AZI1是一種富含脯氨酸的nsLTPs蛋白質(zhì)，是有絲分裂活化蛋白激酶3(MAPK3)的互作蛋白。在擬南芥中過表達AtAZI1基因，能夠加強AtAZI1與AtMAPK3互作，AtMAPK3將AtAZI1磷酸化后使其激活，最終導致轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽能力明顯增強（圖3D）。

潘燕林等[23]研究發(fā)現(xiàn)，粟(SetariaitalicaL.)SiLTP基因的過表達提高了轉(zhuǎn)基因煙草和小米的抗鹽和抗旱能力。李聰?shù)萚50]研究發(fā)現(xiàn)，在非生物脅迫應答中起重要作用的SiARDP參與了ABA依賴的信號途徑，SiARDP轉(zhuǎn)錄因子可以與SiLTP基因啟動子區(qū)域的DRE元件結合并激活SiARDP的表達，進而激活SiARDP的靶基因，表達SiARDP基因可以使SiLTP基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，說明SiARDP轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)節(jié)SiLTP基因的轉(zhuǎn)錄水平提高，進而提高了轉(zhuǎn)基因植物的抗鹽和抗旱能力（圖3E）。

圖3 nsLTP基因參與生物脅迫和非生物脅迫應答的初步分子調(diào)控模式圖

3 展望

隨著研究的不斷深入，有關植物非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(nsLTPs)的研究被越來越廣泛關注，但是對于植物非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(nsLTPs)的功能研究仍存在問題。未來的研究方向：（1）在不同物種中，植物nsLTPs在響應逆境脅迫時的分子調(diào)控網(wǎng)絡仍需要進一步研究。（2）植物nsLTPs的獨特結構使其具有熱穩(wěn)定性，并且能夠結合和運輸脂質(zhì)，但此功能與植物響應逆境脅迫之間的聯(lián)系仍不明確。（3）為了深入挖掘植物nsLTPs的功能，需要深入了解植物nsLTPs蛋白修飾狀態(tài)在植物逆境應答中的作用。

綜上所述，全面闡明植物nsLTP基因在植物逆境脅迫應答過程中的調(diào)控途徑及功能仍然是一項艱巨的任務。隨著基因功能研究技術的不斷發(fā)展，將促進對nsLTP基因分子調(diào)控網(wǎng)絡的全面研究，為今后深入探究植物nsLTP基因應答逆境脅迫的分子機理奠定良好基礎。