溫 煒，黃達(dá)錠，鮑勁霄，張?jiān)鲚x，2，3

（1.華東師范大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院,上海綠色化學(xué)與化工過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海分子治療與新藥開發(fā)工程研究中心,上海200062；2.上海紐約大學(xué)計(jì)算化學(xué)聯(lián)合研究中心,上海200062；3.美國紐約大學(xué)化學(xué)系,紐約10003）

程序性細(xì)胞死亡蛋白（PD-1）及其配體程序性死亡配體1（PD-L1）或程序性死亡配體2（PD-L2）是一種重要的免疫檢查點(diǎn)［1，2］，其在T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)可誘導(dǎo)免疫抑制［3，4］.其中在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)就是癌細(xì)胞免疫逃逸的機(jī)制［5～7］.基于阻斷PD-1/PD-L1的單克隆抗體（mAb）免疫療法顯示出其能恢復(fù)病人的抗腫瘤免疫應(yīng)答的作用［3，8，9］.最近，2種靶向PD-1的單克隆抗體（Pembrolizumab和Nivolumab）已被美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)用于治療黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和頸部鱗狀細(xì)胞癌［10］.這些單抗在多發(fā)性腫瘤的臨床應(yīng)用中具有顯著的腫瘤活性抑制作用［11～14］.

雖然PD-1/Pembrolizumab和PD-1/Nivolumab的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)分別由Lee等［15］和Tan等［16］確定，但是，關(guān)于有助于設(shè)計(jì)基于結(jié)構(gòu)的單抗或小分子抑制劑的PD-1熱點(diǎn)的詳細(xì)信息仍然不清楚.因此，全面分析和了解這些單抗與PD-1的結(jié)合機(jī)制非常重要.再結(jié)合最近研究的PD-1與PD-L1在殘基水平上的結(jié)合機(jī)制［17］，將有助于下一代單抗的開發(fā)［18，19］.

本文利用分子動(dòng)力學(xué)研究了2個(gè)單抗（Pembrolizumab和Nivolumab）與PD-1結(jié)合的機(jī)制.使用計(jì)算丙氨酸掃描方法識(shí)別了PD-1/mAb復(fù)合物中的結(jié)合熱點(diǎn)，對(duì)mAb和PD-1的結(jié)合熱點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并對(duì)兩個(gè)體系熱點(diǎn)的異同進(jìn)行了分析和討論.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 分子動(dòng)力學(xué)模擬

從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB）［20］中下載了人源PD-1與抗體復(fù)合物（Pembrolizumab和Nivolumab）的2種晶體結(jié)構(gòu)，其PDB編碼分別為5GGS［15］和5WT9［16］.用SWISS-MODEL服務(wù)器［21］對(duì)5GGS（PD-1上的殘基25～30）和5WT9（PD-1上的殘基85～93和重鏈上的殘基128～133）中的缺失殘基進(jìn)行建模補(bǔ)全.所有動(dòng)力學(xué)模擬均用AMBER14軟件包［21］中的tleap模塊對(duì)復(fù)合物進(jìn)行氫原子的添加［22］.Na+和Cl-被溶解在TIP3P水盒中以保持電中性，離子和蛋白的緩沖距離為1.2 nm［22，23］.溶劑化后的系統(tǒng)用AMBER的ff14SB力場(chǎng)進(jìn)行立場(chǎng)參數(shù)設(shè)置［23，24］.為了消除邊界效應(yīng)，采用周期邊界條件（PBC）.采用Particle Mesh Ewald（PME）處理長(zhǎng)距離靜電相互作用，非鍵相互作用的截距為1 nm［25］.步長(zhǎng)時(shí)間設(shè)置為2 fs，用SHAKE約束包含氫原子的共價(jià)鍵［26］.溫度由Langevin恒溫器控制，碰撞頻率5.0 ps-1，壓力由Berendsen氣壓表控制至1.01325×105Pa［27～30］.

在能量最小化過程中，首先用2.09 kJ·mol-1·nm-2的力常數(shù)約束除氫原子以外的蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后用0.42 kJ·mol-1·nm-2的力常數(shù)約束復(fù)合物骨架，最后不用任何約束對(duì)整個(gè)體系進(jìn)行優(yōu)化.在加熱步驟中，將每個(gè)系統(tǒng)從0 K加熱到300 K，并以0.42 kJ·mol-1·nm-2的力常數(shù)限制在蛋白質(zhì)主鏈原子上200 ps，300 K下在恒溫恒容（NVT）和恒溫恒壓（NPT）系綜中平衡22 ns.對(duì)蛋白質(zhì)骨架重原子的均方根偏差（RMSD）進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，使其在平衡階段達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài).最后，進(jìn)行了5次獨(dú)立的22 ns動(dòng)力學(xué)采樣（軌跡），總模擬時(shí)間為110 ns，并選擇最后2 ns軌跡進(jìn)行能量分析.

1.2 MM/GBSA-IE-AS計(jì)算

對(duì)于每個(gè)復(fù)合物體系，丙氨酸掃描計(jì)算法［30～33］都用來計(jì)算殘基特異性蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合自由能.本文掃描0.6 nm內(nèi)的分子間殘基對(duì)并將其突變?yōu)楸彼嵋杂?jì)算PD-1/mAb復(fù)合物的野生型和突變型之間的結(jié)合自由能差在這項(xiàng)工作中，丙氨酸掃描（MM/GB/ASIE）方法［17，30～33］被用來計(jì)算單個(gè)殘基對(duì)PD-1/mAb結(jié)合的自由能貢獻(xiàn).利用這種方法，相對(duì)結(jié)合自由能可以計(jì)算為

式中：A和B分別代表配體和受體；a和x分別代表突變后的丙氨酸和突變前的殘基，殘基的氣相自由能貢獻(xiàn)被近似處理成突變后殘基和配體的氣相結(jié)合能與野生型的殘基與配體的氣相結(jié)合能之差.在分子力學(xué)廣義波恩表面積（MM/GBSA）方法［21］中，氣相相互作用能定義為分子力相互作用焓和熵貢獻(xiàn)之和，其中野生型的殘基與配體之間的能量按下式計(jì)算［31］：

類似的，突變后的殘基與配體之間的能量為

式中：γ和β值分別為2.26556 kJ·mol-1·nm-2和3.8456 kJ/mol的標(biāo)準(zhǔn)值［34］.

對(duì)于每個(gè)PD-1/mAb復(fù)合物，運(yùn)行5條MD軌跡，最終能量計(jì)算的結(jié)果是在5條獨(dú)立軌跡上的取得的平均值ΔΔG（表1），這顯示出單個(gè)殘基對(duì)復(fù)合物結(jié)合的貢獻(xiàn).計(jì)算每個(gè)殘基中的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）以檢驗(yàn)?zāi)M誤差（表1）.在一條軌跡的GBSA/IE計(jì)算中，最后的2 ns軌道用于丙氨酸掃描計(jì)算.從軌跡中提取了10000幀，間隔為0.2 ps，用于MM/GB/ASIE計(jì)算.在AMBER14軟件包中實(shí)現(xiàn)的MM/PB（GB）SA方法用于MM/GBSA計(jì)算［22］.采用Yan等［32］使用的介電常數(shù)值，即非極性殘基為1，極性殘基為3，帶電殘基為5.在丙氨酸掃描法計(jì)算很多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用中，計(jì)算的范德華能量通常比實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)高.因此，將芳香環(huán)殘基的氫原子和碳原子的經(jīng)驗(yàn)常數(shù)ε調(diào)整為AMBER14中PHE值的75%，TYP值的30%，TRY值的45%.MM/GB/ASIE計(jì)算的其它詳細(xì)參數(shù)設(shè)置與文獻(xiàn)［32］中相同.

Table 1 Computational alanine scanning result for the PD-1/pembrolizumab system

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)合復(fù)合物的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性

通過原子位置的RMSD來測(cè)量PD-1/Pembrolizumab和PD-1/Nivolumab的5個(gè)系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定性分別如圖1（A）和（B）所示.彩色線表示骨架中所有重原子（非氫原子）相對(duì)于初始晶體結(jié)構(gòu)的RMSD與模擬時(shí)間的函數(shù)關(guān)系.結(jié)果表明，復(fù)雜體系是穩(wěn)定的，可用于計(jì)算丙氨酸掃描和其它分析.

Fig.1 RMSDs of the heavy atoms in backbone of the PD-1/pembrolizumab(A)and PD-1/nivolumab(B)complexes relative to the initial crystal structures

計(jì)算并繪制了PD-1/mAb體系中殘基的均方根波動(dòng)（RMSF），結(jié)果如圖2所示.5WT9中PD-1缺失的殘基85～93是PD-1/Nivolumab體系中最靈活的區(qū)域［圖2（B1）］，這些殘基在晶體結(jié)構(gòu)中沒有確定坐標(biāo)，是由SWISS-MODEL服務(wù)器模擬的.對(duì)于配合物中的PD-1，2種PD1/mAb體系中共有的最靈活的區(qū)域是殘基71～74所在的loop區(qū)域［圖2（A1）和（B1）］.

Fig.2 RMSFs of the Cαatoms calculated from the 22 ns trajectory of PD-1/pembrolizumab(A1—A3)and PD-1/nivolumab(B1—B3)trajectories

因此，用SWISS-MODEL服務(wù)器模擬的PD-1/mAb復(fù)合物結(jié)構(gòu)（5GGS和5WT9）在MD模擬過程中是穩(wěn)定的，軌跡用于進(jìn)一步分析是可靠的.

2.2 PD-1上預(yù)測(cè)到的熱點(diǎn)殘基

MM/GB/ASIE法［31，32］用于計(jì)算2個(gè)體系（PD-1/Pembrolizumab和PD-1/Nivolumab）的殘基特異結(jié)合能貢獻(xiàn)，這2個(gè)體系在丙氨酸突變前后的離解速率常數(shù)實(shí)驗(yàn)值均不可用.在PD-1/Nivolumab復(fù)合物中，雖然Tan等［16］測(cè)量了4個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)（PD-1N49，PD-1N58，PD-1N74和PD-1N116）的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，但PD-1在晶體結(jié)構(gòu)中僅呈現(xiàn)出PD-1N58位點(diǎn)的糖基化信息，而在表面等離子共振（SPR）分析（用于測(cè)丙氨酸突變前后的離解速率常數(shù)）中包含4個(gè)糖基化位點(diǎn)，由于糖基化量的不同，SPR測(cè)到的丙氨酸突變前后的離解速率常數(shù)換算成的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，不適合與只有1個(gè)糖基化位點(diǎn)的MM/GB/ASIE計(jì)算結(jié)果進(jìn)行比較.圖3（A）繪制了2個(gè)系統(tǒng)中PD-1的預(yù)測(cè)結(jié)果以用于對(duì)比.在2個(gè)系統(tǒng)中任意一個(gè)被預(yù)測(cè)為熱點(diǎn)的PD-1上的殘基被列在圖3（A）中.共發(fā)現(xiàn)了9個(gè)此類殘基，并將它們對(duì)結(jié)合配合物的相對(duì)能量貢獻(xiàn)進(jìn)行了比較.

Fig.3 Hot spots predicted on PD-1 in two PD-1/mAb systems compared and arranged according to the sequence of residues on PD-1(A)and the superposition diagram of two PD-1/mAb complexes(PD-1/pembrolizumab and PD-1/nivolumab)(B)

2.3 2個(gè)PD-1/mAb體系中PD-1的特定分析

2.3.1 PD-1/Pembrolizumab 如圖3（A）所示，PD-1D85是PD-1上最重要的熱點(diǎn).由表1數(shù)據(jù)可知，PD-1D85的自由能貢獻(xiàn)主要來自靜電能（ΔΔEele）.PD-1D85和mAb-LR96之間形成強(qiáng)烈的靜電相互作用［圖4（A）］.第2個(gè)和第3個(gè)重要的熱點(diǎn)分別是PD-1R86和PD-1L128，范德華能量（ΔΔEvdW）占主導(dǎo)作用.

Fig.4 Details of the interaction of hotspots and warm spots at the PD-1/pembrolizumab(A)and PD-1/nivolumab(B)interfaces

2.3.2 PD-1/Nilvolumab 對(duì)于該體系，主要的相互作用來自帶正電的PD-1K131，其與mAb-LY49形成了強(qiáng)烈的陽離子-π相互作用［圖4（B）］.此外，PD-1P28和PD-1P130也是重要的熱點(diǎn).如表2所示，vdW相互作用在所有3個(gè)熱點(diǎn)中起著最重要的作用.

Table 2 Computational alanine scanning result for the PD-1/nivolumab system

綜合來看這2個(gè)體系的最重要貢獻(xiàn)是強(qiáng)疏水相互作用（圖5），特別是陽離子-π、π-π或者methionine-π相互作用.唯一的例外是PD-1D85，其是PD-1/Pembrolizumab中最重要的熱點(diǎn)，但PD-1D85的vdW能量為輕微的負(fù)值，靜電能是主要貢獻(xiàn).這2個(gè)體系其它帶電的熱點(diǎn)殘基都通過陽離子-π相互作用與抗體顯示出強(qiáng)烈的vdW相互作用.從PD-1與單抗的結(jié)合區(qū)域來看，這兩個(gè)系統(tǒng)中的差異較大［圖3（B）］.如圖3（A）所示，2個(gè)系統(tǒng)中重疊的熱點(diǎn)僅有PD-1K131.此外，如圖3（A）和圖4所示，Pembrolizumab主要與PD-1上的C′sheet（殘基75～82）、C′D-loop（殘基83～94）和重疊結(jié)合壓（FG-loop）（殘基127～134）結(jié)合［圖3（B）］，這與PD-L1和PD-1的結(jié)合模式［17］相似.然而，Nivolumab從不同的方向結(jié)合PD-1，結(jié)合區(qū)域包括PD-1上的FG-loop和N-loop［殘基25～35，圖3（B）］［16］.與此同時(shí)，N-loop在PD-1/Pembrolizumb的晶體結(jié)構(gòu)中大部分是缺失的（晶體結(jié)構(gòu)中該區(qū)域的缺失說明該處擺動(dòng)特別大，基本沒有結(jié)合位點(diǎn)）.因此，從Pembrolizumab和Nivolumab與PD-1結(jié)合熱點(diǎn)重疊少的結(jié)果可見，Pembrolizumab和Nivolumab之間存在不同的阻礙PD-1/PD-L1結(jié)合的模式，從FG-loop的角度來看，兩者之間還可能存在一定的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系［16］.

Fig.5 Composition of free energy contribution for hotspots and warm spots predicted by MM/GB/ASIE method

2.4 單抗上預(yù)測(cè)的熱點(diǎn)殘基

因?yàn)樵谙嗷プ饔媒缑鎯蓚?cè)進(jìn)行了MM/GB/ASIE計(jì)算，所以除了分析PD-1的熱點(diǎn)殘基，還可以分析單抗中的關(guān)鍵殘基.如圖4和圖6所示，對(duì)于PembrolizumabHF101是主要熱點(diǎn)，其與PD-1K131和PD-1K78形成強(qiáng)烈的陽離子-π相互作用.HY33也是與PD-1K78形成陽離子-π相互作用的重要?dú)埢?在PD-1/Nivolumab復(fù)合物中，熱點(diǎn)數(shù)量明顯少于Pembrolizumab上的熱點(diǎn)，這與PD-1/mAb系統(tǒng)中PD-1上的趨勢(shì)一致.有趣的是，Nivolumab上的熱點(diǎn)都是酪氨酸，Pembrolizumab上的熱點(diǎn)酪氨酸所占比例最多，它們都是由vdW能量占主導(dǎo)的（圖5）.

Fig.6 Hot and warm spots predicted on the PD-1/pembrolizumab(A)and PD-1/nivolumab(B)

由于PD-1K131是前面對(duì)PD-1的分析中兩個(gè)體系唯一共享的熱點(diǎn)殘基，因此研究了與PD-1K131相互作用的單抗殘基之間的關(guān)系.如表3所示，與PD-1K131相互作用的殘基幾乎都有芳香側(cè)鏈，它們的相互作用來自穩(wěn)定的陽離子-π（PD-1K131的胺基離子與單抗的酚基）.表3中與PD-1K131結(jié)合的殘基包括4個(gè)酪氨酸殘基，它們與PD-1K131的相互作用都相似地受vdW相互作用的支配.事實(shí)上，不只是與PD-1K131結(jié)合的殘基，Pembrolizumab和Nivolumab上熱點(diǎn)和溫點(diǎn)的自由能貢獻(xiàn)幾乎均由vdW能量控制（圖5）.這說明提高抗體殘基的靜電相互作用的貢獻(xiàn)，有助于進(jìn)一步優(yōu)化PD-1抗體的結(jié)合活性.

Table 3 Residues on the mAbs interacting with the only overlapping hotspots PD-1K131 and their main interaction types and the spot types of themselves

3 結(jié) 論

本文檢測(cè)了2種PD-1單克隆抗體（mAb），并利用高效的計(jì)算丙氨酸掃描方法研究了它們與PD-1的結(jié)合機(jī)制.對(duì)PD-1/mAb結(jié)合起重要作用的熱點(diǎn)殘基進(jìn)行了定量分析.對(duì)兩種單抗與PD-1的結(jié)合方式進(jìn)行了比較分析，同時(shí)對(duì)比了它們與PD-1/PD-L1結(jié)合方式的差別，發(fā)現(xiàn)PD-1和PD-L1與Pembrolizumab的結(jié)合方式類似，與Nivolumab的結(jié)合方式差異較大.PD-1K131是2個(gè)PD-1/mAb復(fù)合物中唯一有交集的相對(duì)重要的熱點(diǎn).在單抗方面，發(fā)現(xiàn)單抗與PD-1K131結(jié)合的關(guān)鍵殘基以vdW相互作用為主，這也是整個(gè)抗體中最重要的相互作用貢獻(xiàn)類型，本研究為設(shè)計(jì)以PD-1為靶點(diǎn)的新型單抗以及小分子藥物提供了重要的啟示.

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