趙立群，田雅楠，曹玲玲，曹彩紅

（北京市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，北京 100029）

0 引言

自2008年集約化育苗成為國(guó)內(nèi)農(nóng)業(yè)主管部門主推技術(shù)以來，蔬菜集約化育苗產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，常年生產(chǎn)的蔬菜約2/3采用育苗移栽[1]，對(duì)種苗的需求量約為6800億～7300億株，而目前全國(guó)集約化育苗供苗量?jī)H約1000億株，市場(chǎng)前景仍然十分廣闊[2]。其中，黃瓜是采用育苗移栽生產(chǎn)最主要的蔬菜種類之一，以壽光為例，黃瓜種苗可占到育苗總量的20%[3]。

對(duì)于黃瓜穴盤成品苗質(zhì)量的評(píng)價(jià)，業(yè)內(nèi)生產(chǎn)者和用苗戶之間普遍采用描述性標(biāo)準(zhǔn)（如株高、莖粗、生理苗齡等）作為交貨約定，農(nóng)業(yè)主管部門在2010年之后陸續(xù)出臺(tái)的一系列穴盤育苗標(biāo)準(zhǔn)中，也主要采用了上述方法，采用目測(cè)方法，對(duì)黃瓜成苗形態(tài)（株高、莖粗、葉色、生理苗齡、盤根情況等）、病蟲害和機(jī)械損傷等指標(biāo)進(jìn)行規(guī)定，作為成苗或壯苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[4-5]。但在實(shí)際生產(chǎn)中，當(dāng)用苗戶與育苗場(chǎng)之間就種苗品種純度、壯苗比例、種苗帶病等問題發(fā)生糾紛時(shí)，由于一般采用上述經(jīng)驗(yàn)性的成苗指標(biāo)，雙方很難提供定性依據(jù)，嚴(yán)重影響菜農(nóng)經(jīng)濟(jì)效益和育苗企業(yè)的信譽(yù)[6-7]，也不利于育苗產(chǎn)業(yè)和蔬菜產(chǎn)業(yè)的優(yōu)質(zhì)安全高質(zhì)量發(fā)展。

北京和濟(jì)南地區(qū)育苗場(chǎng)的生產(chǎn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，霜霉病是黃瓜集約化育苗需要防治的最主要病害之一，由古巴假霜霉菌(Pseudoperonospora cubensis)引起，設(shè)施內(nèi)可周年發(fā)生危害[8]，在苗期和成株期均可發(fā)病，即使苗期不發(fā)病也可能由于幼苗帶病對(duì)后期栽培造成嚴(yán)重影響[9]。

筆者從北京、河北、山東的集約化育苗場(chǎng)抽樣采集肉眼所見為健壯且無病蟲害的黃瓜穴盤成苗樣品70份，測(cè)算其株高、莖粗、干/鮮質(zhì)量和壯苗指數(shù)等生理指標(biāo)，并通過PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行黃瓜霜霉病的帶菌情況檢測(cè)，旨在探索黃瓜集約化穴盤商品成苗質(zhì)量快速檢測(cè)方法，以期為商品苗成苗質(zhì)量評(píng)價(jià)及苗期病害及早隔離防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)樣品于2018年分別在北京大興、順義、通州、昌平、房山地區(qū)，河北曲周、定興地區(qū)及山東濟(jì)南共8地的14家集約化育苗場(chǎng)中采集，按照《蔬菜穴盤育苗通則》(NY/T 2119—2012)中的成品苗要求，隨機(jī)抽樣采集肉眼所見為健壯且無病蟲害的黃瓜穴盤成品苗70株，按照1～14號(hào)育苗場(chǎng)進(jìn)行順序編號(hào)，每個(gè)育苗場(chǎng)采集5份樣品，單株封于自封袋內(nèi)，按照“n號(hào)育苗場(chǎng)-第n株”進(jìn)行標(biāo)記，樣品于次日在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行各項(xiàng)生理指標(biāo)和霜霉病檢測(cè)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生理指標(biāo)檢測(cè) 株高用直尺測(cè)量基質(zhì)表面到幼苗生長(zhǎng)點(diǎn)的高度；莖粗用游標(biāo)卡尺測(cè)量幼苗莖基部上方1 cm處；將根部清洗除盡基質(zhì)后吸干水分，與地上部鮮質(zhì)量分別用1/1000天平稱量；在通風(fēng)干燥箱105℃下殺青30 min，80℃烘至恒重，再用1/1000天平分別稱量干質(zhì)量。每份樣品每個(gè)指標(biāo)測(cè)量3次重復(fù)后取平均值。

1.2.2 霜霉病檢測(cè)

（1）按照Quick DNA Isolation Kit（快速提取DNA試劑盒）說明書提取DNA，提取物為黃瓜全基因組DNA和黃瓜葉面附著菌DNA混合液。提取的DNA溶解于TE緩沖液中，測(cè)定DNA濃度并稀釋至10～20 ng/μL待用。

（2）根據(jù)黃瓜霜霉病病原菌古巴假霜霉菌病原菌DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS設(shè)計(jì)的通用引物進(jìn)行霜霉病檢測(cè)[10]，目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為650 bp，具體引物名稱及序列見表1。

表1 PCR引物名稱及序列

（3）利用高通量PCR技術(shù)擴(kuò)增目標(biāo)條帶，PCR反應(yīng)結(jié)束后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20軟件及Excel 2016軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜穴盤苗采樣情況

試驗(yàn)共抽樣采集樣品70份，品種均為當(dāng)?shù)貙?shí)際采用訂單式銷售的華北型黃瓜，其中大興20份、順義10份、通州15份、昌平5份、房山5份、曲周5份、定興5份、濟(jì)南5份。黃瓜秧苗均為集約化方式生產(chǎn)，采用50孔穴盤，生理苗齡1～4葉1心。

2.2 黃瓜穴盤苗生理指標(biāo)比較

對(duì)采集的70份樣品進(jìn)行生理苗齡、株高、莖粗、地上部鮮重、地上部干重、根鮮重、根干重、壯苗指數(shù)等指標(biāo)的測(cè)算，并按照每育苗場(chǎng)取平均值。結(jié)果（表2）表明，各育苗場(chǎng)間黃瓜成苗平均壯苗指數(shù)相差較大，最大值0.196來自通州的9號(hào)育苗場(chǎng)，最小值0.017為來自大興的2號(hào)育苗場(chǎng)，但兩者生理苗齡差別較大，前者為4葉1心，后者為1葉1心。

本試驗(yàn)對(duì)壯苗指數(shù)與表2中各項(xiàng)生理指標(biāo)的相關(guān)性分析（圖1）表明，根干重與壯苗指數(shù)的相關(guān)系數(shù)最大，達(dá)到0.995，呈顯著正相關(guān)，說明根干重是黃瓜穴盤成苗壯苗指數(shù)大小的決定因素，可用于快速評(píng)測(cè)黃瓜種苗質(zhì)量。

圖1 各項(xiàng)生理指標(biāo)相關(guān)性分析結(jié)果

表2 北京、河北、山東部分育苗場(chǎng)黃瓜穴盤苗平均生理指標(biāo)

2.3 霜霉病檢出情況

對(duì)采集的70份樣品進(jìn)行黃瓜霜霉病病原菌目標(biāo)條帶的PCR擴(kuò)增，結(jié)果（圖2）表明，3號(hào)育苗場(chǎng)的第5株、5號(hào)育苗場(chǎng)的第1株、7號(hào)育苗場(chǎng)的第5株、8號(hào)育苗場(chǎng)的第2～5株、9號(hào)育苗場(chǎng)的全部5株、10號(hào)育苗場(chǎng)的第2～5株、11號(hào)育苗場(chǎng)的第1～3株、12號(hào)育苗場(chǎng)的第1～3、5株、13號(hào)育苗場(chǎng)的第1～2、4～5株和14號(hào)育苗場(chǎng)的第4株樣品擴(kuò)增出約為650 bp的目標(biāo)條帶，提示葉片含有霜霉病病原菌。

圖2 部分樣品霜霉病PCR檢測(cè)結(jié)果

2.4 生理與病害試驗(yàn)結(jié)果匯總分析

70份樣品進(jìn)行的幼苗質(zhì)量相關(guān)生理指標(biāo)和霜霉病帶菌情況檢測(cè)結(jié)果（表3）表明，北京地區(qū)采集的55株樣品中，單株壯苗指數(shù)最大值達(dá)到0.256，最小值僅為0.005，平均壯苗指數(shù)0.078，霜霉病檢出率34.55%。河北地區(qū)采集的10份樣品中，單株壯苗指數(shù)最大值為0.132，最小值為0.053，平均壯苗指數(shù)0.079，霜霉病檢出率80.00%。山東地區(qū)采集的5份樣品中，單株壯苗指數(shù)最大值為0.117，最小值為0.086，平均壯苗指數(shù)0.101，霜霉病檢出率20.00%。

表3 北京、河北、山東部分育苗場(chǎng)黃瓜穴盤苗壯苗指數(shù)與霜霉病檢測(cè)情況

3 結(jié)論與討論

3.1 黃瓜穴盤苗壯苗指數(shù)結(jié)果評(píng)價(jià)

國(guó)內(nèi)目前育苗場(chǎng)在實(shí)際生產(chǎn)和現(xiàn)行黃瓜穴盤苗生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)中，一般通過目測(cè)外觀形態(tài)和有無病蟲害來評(píng)判黃瓜穴盤苗質(zhì)量，主要依靠經(jīng)驗(yàn)，人為誤差較大。相比之下，文獻(xiàn)報(bào)道中對(duì)黃瓜種苗的質(zhì)量評(píng)價(jià)更為量化和準(zhǔn)確，主要通過測(cè)定生理指標(biāo)對(duì)種苗質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，包括形態(tài)生理指標(biāo)（株高、莖粗、葉面積、地上部/根部干重、地上部/根部鮮重、根冠比、G值、壯苗指數(shù)等）[11-17]及代謝生理指標(biāo)（代謝酶活性、根系活力、葉綠素含量、光合速率等）[18-21]。雖然不同文獻(xiàn)的檢測(cè)指標(biāo)及側(cè)重不同，但一般均將壯苗指數(shù)作為種苗評(píng)價(jià)的基本指標(biāo)。本試驗(yàn)通過對(duì)北京、河北、山東等黃瓜主產(chǎn)區(qū)育苗場(chǎng)隨機(jī)抽取的70份穴盤商品苗進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定分析，獲得了一系列黃瓜幼苗質(zhì)量量化數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，由于生產(chǎn)習(xí)慣和供應(yīng)茬口等原因，各育苗場(chǎng)黃瓜成苗的生理苗齡從1葉1心至4葉1心不等，而且壯苗指數(shù)相差較大，但經(jīng)過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，70份黃瓜種苗的根干重與壯苗指數(shù)的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.995，且呈顯著正相關(guān)，表明根干重可以代替壯苗指數(shù)定性評(píng)價(jià)黃瓜穴盤苗質(zhì)量，用于快速評(píng)測(cè)黃瓜種苗生理質(zhì)量，提高評(píng)價(jià)效率。

3.2 黃瓜穴盤苗霜霉病檢測(cè)結(jié)果評(píng)價(jià)

隨著集約化育苗產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展壯大，大型集約化育苗企業(yè)生產(chǎn)的商品苗多銷往周邊多個(gè)省市甚至全國(guó)，這也使種苗帶病在地區(qū)間傳播成為可能，北京地區(qū)首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)番茄黃化曲葉病毒病即是由種植戶購買的山東種苗帶病[22]傳播所致。傳統(tǒng)的生物學(xué)病害檢測(cè)方法基于田間顯性癥狀觀察和病菌分離測(cè)定，若處于潛育期的霜霉病葉片不表現(xiàn)癥狀，葉片內(nèi)病原菌含量太低，則檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)，待顯癥后已造成損失，不利于病害的預(yù)測(cè)和防控[23-24]。黃瓜霜霉病屬于真菌性病害，已有研究表明，真菌rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS區(qū)段既具保守性，在科、屬、種水平上均有特異性序列，有利于低濃度或被高度降解的DNA樣品中ITS區(qū)域的擴(kuò)增，常用作分子鑒定、診斷和檢測(cè)植物病原菌的靶序列[25-26]。本試驗(yàn)建立的檢測(cè)方法，利用霜霉病核糖體基因ITS區(qū)段設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從肉眼所見不發(fā)病的健壯幼苗樣品中檢測(cè)到葉片攜帶霜霉病病菌，且在北京、河北、山東均有檢出，其中河北地區(qū)檢出率高達(dá)80%，表明霜霉病是顯著影響國(guó)內(nèi)黃瓜種苗生產(chǎn)和交易的重要病害，PCR技術(shù)可對(duì)黃瓜種苗霜霉病等苗期病害進(jìn)行快速精準(zhǔn)的早期鑒定，對(duì)進(jìn)行種苗健康質(zhì)量評(píng)價(jià)具有重要的指導(dǎo)意義。同時(shí)，通過PCR技術(shù)進(jìn)行苗期病害預(yù)測(cè)還可以及時(shí)開展病害科學(xué)防治，有效防止病害傳播和蔓延。

筆者對(duì)北京、河北、山東黃瓜穴盤商品苗進(jìn)行抽樣，結(jié)合壯苗生理指標(biāo)測(cè)量和病害PCR檢測(cè)技術(shù)，快速精準(zhǔn)評(píng)價(jià)了秧苗質(zhì)量，可為黃瓜商品苗質(zhì)量控制和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)，同時(shí)為其他蔬菜種苗質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。