吳新文，陳 愷，馬 凱，張世芹，謝元貴，謝 鋒▲

(1貴州省檢測技術研究應用中心，貴州 貴陽 550002；2貴州省分析測試研究院，貴州 貴陽 550002；3貴州省山地資源研究有限公司，貴州 貴陽 550002)

0 引言

馬桑用途很多，枝葉可做燃料、肥料、飼料、養(yǎng)蠶等，目前馬桑相關產(chǎn)業(yè)中就有利用馬桑養(yǎng)蠶的產(chǎn)業(yè)，隨著科學技術的進步和綜合利用的開發(fā)，馬桑蠶的利用逐步走向繭、蛹、成蟲、幼蟲、卵及蠶沙的全面開發(fā)路線，從而馬桑蠶沙的開發(fā)利用也成了馬桑相關產(chǎn)業(yè)中的一個重要產(chǎn)業(yè)[1-2]。蠶沙進一步富集了葉綠素[3]，風干的蠶沙葉綠素含量高達0.8%～1.0%，是優(yōu)良的天然綠色素資源。由于純天然的葉綠素性質(zhì)很不穩(wěn)定，而且不容于水，難以廣泛應用在實際應用中。而葉綠素的衍生物葉綠素銅鈉鹽為天然綠色色素，易溶于水，又比較穩(wěn)定，而且染色能力強[4]，可作為食品和日化加工中的染色劑、脫色劑，廣泛應用于口香糖、硬糖、果汁、汽水、洗手液、除臭劑中[5]。目前葉綠素銅鈉鹽的制備多以各類物質(zhì)為原料提取葉綠素后，再以銅離子取代葉綠素中的鎂離子制成葉綠素銅鈉鹽。這篇論文選擇馬桑蠶沙為原料，對制備葉綠素銅鈉鹽粗品的工藝進行了研究，所得產(chǎn)品可作為進一步提純?nèi)~綠素銅鈉鹽的原材料。為充分利用資源，更好地發(fā)展馬桑相關產(chǎn)業(yè)提供技術支撐。

1 實驗部分

1.1 原料、儀器設備和試劑

主要原料：馬桑蠶沙(收集于貴州某馬桑蠶養(yǎng)殖基地)。

主要儀器設備：721型分光光度計、減壓過濾裝置、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、回流裝置、電子天平、恒溫磁力攪拌水浴鍋、酸度計及常用玻璃儀器。

主要試劑：95%乙醇溶液、NaOH溶液、6 mol/L鹽酸溶液、丙酮、石油醚、10%CuSO4溶液、蒸餾水、30%乙醇溶液、5%NaOH-乙醇溶液、葉綠素銅鈉鹽對照品(純度98.0%)。

1.2 原理與方法

1.2.1 原理

葉綠素是一種天然色素，葉綠素有a和b兩種，在葉綠素的結(jié)構中，含有一個由四個吡咯環(huán)和四個次甲基交替相聯(lián)形成的卟吩環(huán)，卟吩環(huán)閉合的共軛體系提供了包圍鎂離子的剛性平面，葉綠素與蛋白質(zhì)結(jié)合存在于植物的綠葉和綠色的莖中，是植物進行光合作用所必需的催化劑，葉綠素難溶于水，而易溶于極性有機溶劑。

利用馬桑飼養(yǎng)的馬桑蠶排出的蠶糞(馬桑蠶沙)中富集了豐富的葉綠素，居所有天然色素之首，故可用馬桑蠶沙來提取葉綠素。由于葉綠素易溶于丙酮、乙醇的脂性溶劑，故可用乙醇、丙酮溶液來提取。把提取出來的葉綠素制備成葉綠素銅鈉鹽，其性質(zhì)更穩(wěn)定，溶解性也更好。葉綠素分子中的鎂原子和四個吡咯上的氮原子相結(jié)合，環(huán)上是雙羧酸的酯，故可以發(fā)生皂化反應生成鈉鹽：

C55H72O5N4Mg+2NaOH→C34H30O5N4MgNa2+CH3OH+C20H39OH

C55H70O6N4Mg+2NaOH→C34H28O6N4MgNa2+CH3OH+C20H39OH

在酸性條件下，葉綠素鈉鹽分子中的鎂極易被氫原子取代生成褐色的葉綠酸：

C34H30O5N4MgNa2+4H+=C34H34O5N4+Mg2++2Na+

C34H28O6N4MgNa2+4H+=C34H32O6N4+Mg2++2Na+

葉綠酸可與銅鹽在加熱條件下生成葉綠素銅酸析出，將葉綠素銅酸溶于丙酮，再與堿反應生成葉綠素銅鈉鹽：

C34H34O5N4+Cu2+=C34H32O5N4Cu+2H+

C34H32O6N4+Cu2+=C34H30O6N4Cu+2H+

C34H32O5N4Cu+2NaOH=C34H30O5N4CuNa2+2H2O

C34H30O6N4Cu+2NaOH=C34H28O6N4CuNa2+2H2O

1.2.2 方法

1.2.2.1 葉綠素的提取

在500 mL圓底燒瓶中，先加入50 g馬桑蠶沙，加入攪拌子，再加入95%乙醇300 mL。

圓底燒瓶放在恒溫磁力攪拌水浴鍋中加熱，水浴溫度75 ℃，回流提取3 h，濾出提取液。

提取液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在55 ℃下蒸出乙醇，收集150 mL乙醇后停止旋蒸，剩余液體為葉綠素提取溶液。

1.2.2.2 皂化

向葉綠素提取溶液中加入5%NaOH-乙醇溶液25 mL，放入恒溫磁力攪拌水浴鍋中，在60 ℃下皂化回流90 min。

1.2.2.3 萃取

將皂化液冷卻后轉(zhuǎn)入500 mL分液漏斗加入100 mL石油醚萃取除去雜質(zhì)，靜置分層，下層為可溶性葉綠酸鹽，取下層溶液，上層溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)回收石油醚，平行萃取3次。

1.2.2.4 調(diào)酸銅代

將下層溶液裝入三口燒瓶中，先加入一定量的水(加水量∶皂化液=1∶7)，然后往其中慢慢加入6 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值為7，加入10%的硫酸銅2 mL，攪拌均勻后，再用鹽酸將溶液調(diào)節(jié)pH為2～3，在60 ℃水浴中保溫攪拌1 h。

趁熱過濾，濾渣先用水洗去，再用95%乙醇洗滌3次后抽干。合并濾液和洗液，加入等量的蒸餾水，析出葉綠素銅，靜置4 h后過濾，濾餅依次用適量的純水、30%乙醇及石油醚洗滌3次至石油醚層變?yōu)闇\綠色，以除去其中的H+及殘留的葉黃素和其他有機雜質(zhì)。

1.2.2.5 成鹽

洗滌結(jié)束后濾干，濾餅用丙酮溶解，攪拌，成鹽(用濾紙法檢驗成鹽情況：用玻棒點少許溶液放在濾紙上，濾紙不顯綠色則說明完全成鹽)，將其在60 ℃下加熱蒸發(fā)以除去水分得墨綠色結(jié)晶物，然后再在60 ℃下烘箱中烘干結(jié)晶物，即制得墨綠色光澤的成品(略有胺味)。

2 結(jié)果與討論

2.1 葉綠素提取工藝條件篩選

2.1.1 提取溶劑類別

葉綠素的提取溶劑大多數(shù)采用丙酮和乙醇進行提取[4-19]，選擇100%丙酮、95%丙酮、90%丙酮、100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇進行試驗，結(jié)果如圖1所示，95%乙醇為提取溶劑時，提取效果最佳，從經(jīng)濟效益角度考慮，乙醇的價格比丙酮低，選擇95%乙醇為提取溶液成本更低，從對人體的危害方面考慮，乙醇的毒性比丙酮小，所以最終選擇95%乙醇為提取馬桑蠶沙中葉綠素的提取溶劑。

圖1 不同溶劑對葉綠素提取率的影響Fig.1 Effect of different solvents on the extraction rate of chlorophyll

2.1.2 提取溶劑用量

稱取50 g蠶沙，分別加入95%乙醇150 mL、200 mL、250 mL、300 mL、350 mL、400 mL進行試驗，并計算出葉綠素的提取率，結(jié)果如圖2所示。當加入提取溶劑在300 mL以下時，葉綠素的提取率隨著提取溶劑加入體積的增加而不斷增加，當提取溶劑達到300 mL以后，葉綠素的提取率基本保持不變。說明此時馬桑蠶沙中的葉綠素與溶劑中的葉綠素含量達到了平衡，繼續(xù)增加提取溶液也不會再增加葉綠素的提取率。因此，提取溶劑選擇加入300 mL為最佳。

圖2 不同體積的提取溶劑對葉綠素提取率的影響Fig.2 Effect of different extraction solvent volume on the extraction rate of chlorophyll

2.1.3 提取溫度

提取溫度對葉綠素提取率的影響如圖3所示，在60～75 ℃時，隨著溫度的不斷升高，葉綠素的含量不斷增加；當溫度超過75 ℃后，隨著溫度的提高，葉綠素的含量開始逐漸下降，這個可能是因為葉綠素熱敏感性導致的，溫度太高加快了葉綠素的分解，使提取率逐漸下降。因此，選擇75 ℃為最佳提取溫度。

圖3 提取溫度的選擇Fig.3 Selection of extraction temperature

2.1.4 提取時間

提取時間對葉綠素提取率的影響如圖4所示，在1～3 h時，隨著時間的不斷增加，葉綠素的含量也不斷的增加；當提取時間超過3 h后，葉綠素的含量又開始逐漸下降，這是因為提取時間太長葉綠素分解導致的。因此，選擇3 h為最佳提取時間。

圖4 提取時間的選擇Fig.4 Selection of extraction time

2.2 葉綠素皂化工藝條件選擇

葉綠素在蠶沙中，大部分與蛋白質(zhì)形成復合的葉綠素體，通過皂化，使葉綠素轉(zhuǎn)化成水溶性的葉綠素鈉鹽。皂化過程中，堿的用量太少或皂化時間太短會造成葉綠素皂化不完全，影響產(chǎn)率；堿用量太多或皂化時間太長又會造成資源浪費，增加生產(chǎn)成本。選擇不同的加堿量和不同的皂化時間進行試驗，通過加入石油醚觀察，醚層顏色呈黃色，分界面清晰，表明皂化完全。表1表明，從節(jié)約成本和時間的角度出發(fā)，選擇加入5%氫氧化鈉乙醇溶液至25 mL，在60 ℃的水浴鍋中皂化90 min，即可皂化完全。

表1 皂化條件的選擇Tab.1 Selection of saponification conditions

2.3 銅代反應工藝條件選擇

2.3.1 銅代反應加水比例優(yōu)選

銅代時皂化液中乙醇濃度太高或太低都會影響產(chǎn)率，濃度太高硫酸銅不易溶解，銅代不完全；濃度太低，銅代生成的葉綠素銅酸會被析出，造成損失。乙醇濃度可通過加水量來控制，通過試驗，結(jié)果如圖5所示，加水量與皂化液體積比在1∶4到1∶7之間時，葉綠素銅鈉鹽的產(chǎn)率不斷提高；加水量與皂化液體積比在1∶7到1∶8之間時，葉綠素銅鈉鹽的產(chǎn)率基本保持不變；加水量與皂化液體積比在1∶8到1∶10之間時，葉綠素銅鈉鹽的產(chǎn)率又開始下降，從節(jié)約成本的角度出發(fā)，最后選擇加水量與皂化液體積比為1∶7時為最佳加水量。

圖5 加水量的選擇Fig.5 Selection of amount of water added

2.3.2 銅代反應pH值優(yōu)選

銅代反應前先將皂化液pH值調(diào)至7，防止加入硫酸銅溶液后產(chǎn)生Cu(OH)2和 Mg(OH)2沉淀，加入硫酸銅溶液后再調(diào)節(jié)pH值進行銅代反應。pH值會直接影響銅代反應的進行，銅代反應是否完全決定著葉綠素銅鈉鹽的產(chǎn)率。pH值太高，不能生成葉綠素酸，無法進行銅代反應，pH值太低生成的葉綠素酮酸會再次轉(zhuǎn)化成油狀的葉綠素酸，造成損失。選擇不同的pH值條件進行試驗，結(jié)果如圖6所示，選擇pH為2～3時葉綠素銅鈉鹽的產(chǎn)率最高。

圖6 pH值的選擇Fig.6 Selection of pH value

2.4 工藝分析方法

2.4.1 用前述已經(jīng)優(yōu)化的各個工藝條件，進行全優(yōu)化條件試驗，得到產(chǎn)品，產(chǎn)品均為墨綠色帶金屬光澤的物質(zhì)，略帶氨味，易溶于水，微溶于乙醇、氯仿、甲醇，不溶于石油醚、丙酮、正己烷，其水溶液鮮綠翠亮。

2.4.2 對產(chǎn)品采用下列方法進行分析，分析該工藝條件下葉綠素銅鈉鹽粗產(chǎn)品的光譜特征、純度以及產(chǎn)出率(相對于蠶沙原料重量)。

2.4.2.1 光譜特征

分別稱取 0.0300 g葉綠素銅鈉鹽對照品和0.1200 g產(chǎn)品，用蒸餾水溶解在50 mL的容量瓶中，取出0.10 mL稀釋至10 mL，用分光光度計在320～1100 nm波長下進行光譜掃描，得到如圖7所示的光譜圖。葉綠素對銅鈉鹽對照品和產(chǎn)品均在405 nm和627 nm左右有吸收峰，可判斷所制得的產(chǎn)品均含有葉綠素銅鈉鹽。通過光譜圖可以看出產(chǎn)品在350 nm處有吸收，區(qū)別于葉綠素銅鈉鹽對照品，這可能是因為產(chǎn)品含有雜質(zhì)干擾的原因。

圖7 葉綠素銅鈉鹽對照品(上)和產(chǎn)品(下)光譜圖Fig.7 Spectra of sodium copper chlorophyll reference substance(top) and product(bottom)

2.4.2.2 產(chǎn)品純度

分別稱取0.0300 g左右的葉綠素銅鈉鹽對照品和產(chǎn)品，用蒸餾水溶解在50 mL的容量瓶中，取出0.10 mL稀釋至10 mL，用分光光度計在405 nm處測其吸光度。通過比較葉綠素銅鈉鹽對照品和產(chǎn)品的吸光度，計算出產(chǎn)品的純度。

可知葉綠素銅鈉鹽對照品的純度為98.0%，取0.0302 g配制成溶液，其吸光度A405=0.3842，所以可以得到公式：

y=0.1298mx

其中，y為吸光度，A；x為葉綠素銅鈉鹽的純度，%；m為稱取樣品質(zhì)量，g；0.1298為換算系數(shù)。

產(chǎn)品純度如表2所示，產(chǎn)品平均純度為24.3%。

2.4.2.3 產(chǎn)品產(chǎn)出率

將采用全優(yōu)化條件試驗所得的產(chǎn)品進行稱量，根據(jù)計算公式：

計算出產(chǎn)品的產(chǎn)出率，結(jié)果如表2所示，產(chǎn)品的平均產(chǎn)出率為2.10%。

表2 葉綠素銅鈉鹽對照品和產(chǎn)品的吸光度、純度及產(chǎn)出率Tab.2 Absorbance，purity and yield of sodium copper chlorophyll reference substance and product

續(xù)表2

3 結(jié)論

這篇論文針對馬桑蠶沙中富含葉綠素的這一特性，進一步開發(fā)利用，用于制備葉綠素銅鈉鹽粗品。用前述已經(jīng)優(yōu)化的各個工藝條件，進行10次全優(yōu)化條件試驗所得到的產(chǎn)品均為墨綠色帶金屬光澤的物質(zhì)，略帶氨味，易溶于水，微溶于乙醇、氯仿、甲醇，不溶于石油醚、丙酮、正己烷，其水溶液鮮綠翠亮，產(chǎn)品純度在23.5%～24.8%之間，產(chǎn)出率在1.96%～2.26%之間。該工藝可適用于采用馬桑蠶沙為原料制備葉綠素銅鈉鹽粗產(chǎn)品中，為發(fā)展馬桑相關產(chǎn)業(yè)提供技術支撐。