徐 睿，劉 闖，張瀟月，周國英，劉君昂

（1.河南林業(yè)職業(yè)學(xué)院 森林保護系，河南 洛陽 471002；2.中南林業(yè)科技大學(xué)a.南方人工林病蟲害防控國家林業(yè)局重點實驗室；b.森林有害生物防控湖南省重點實驗室；c.經(jīng)濟林培育與保護教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004）

油茶Camellia oleifera是山茶科Theaceae 山茶屬Camellia常綠小喬木，為中國南方重要的木本油料樹種，擁有重要的經(jīng)濟價值、食用價值和藥用價值[1]。目前，中國的油茶種植面積約為367 萬hm2，種質(zhì)資源極為豐富，主要產(chǎn)區(qū)包括湖南、福建、江西、廣東、廣西、浙江等18 個省（區(qū)）。以油茶籽制備的山茶油含有豐富的油酸等不飽和脂肪酸，是一種理想的健康食用植物油，非常適于患有心臟病、血管硬化、高血壓等病癥的人群食用[2]。近年來油茶種植面積持續(xù)增長，在各大油茶產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生各種病害，炭疽病是較為重要的病害之一，嚴(yán)重影響了油茶的產(chǎn)量及品質(zhì)[3]。炭疽屬真菌是一類在全世界分布極其廣泛的重要病原菌，屬于半活體營養(yǎng)型真菌。油茶炭疽病的病原菌涵蓋了炭疽屬的多個種，由于不同種的形態(tài)特征十分相似，僅靠菌落、分生孢子和附著胞等的形態(tài)學(xué)特征難以區(qū)分炭疽屬真菌的種類，因此，目前主要是采用綜合形態(tài)學(xué)特征和多基因分子序列信息的方法來鑒定。根據(jù)研究報道，油茶炭疽病原菌有8 種，分別是油茶果生炭疽菌Colletotrichum fructicola、膠孢炭疽菌C.gloeosporioides、山茶炭疽菌C.camelliae、暹羅炭疽菌C.siamense、喀斯特炭疽菌C.karstii、哈銳炭疽菌C.horii、君子蘭炭疽菌C.cliνiae和博寧炭疽菌C.boninense，其中油茶果生炭疽菌在我國多地油茶炭疽病的病原菌中均有發(fā)現(xiàn)，且分離率高，為油茶炭疽病的優(yōu)勢致病菌[4-8]。

目前，對于油茶病害的主要防治措施是化學(xué)防治。使用化學(xué)農(nóng)藥防治油茶炭疽病，雖然能快速降低損失，但由于油茶炭疽病病原菌具有較強的適應(yīng)能力，容易引起油茶炭疽病病原菌抗藥性的產(chǎn)生[9]。大劑量使用化學(xué)農(nóng)藥不僅會嚴(yán)重污染生態(tài)環(huán)境，還使茶油內(nèi)的農(nóng)藥殘留量增加，降低茶油的品質(zhì)，影響油茶產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[10]。隨著人們綠色環(huán)保意識越來越強烈，世界各國對生物防治越來越關(guān)注，生物防治藥劑的市場需求與日俱增，研究者不斷開展研發(fā)工作，試圖生產(chǎn)出安全環(huán)保、高效、可持續(xù)發(fā)展的生防制品。尋求安全、低毒、高效的油茶病害防治手段也受到普遍關(guān)注[11]。近年來，我國研究人員開始考慮從微生物或植物中尋找對油茶炭疽病有防治功能的生物農(nóng)藥，篩選和利用拮抗微生物可以成為防治油茶炭疽病研究的新方向[12]。周盈等[13]報道了1 種對胡蘿卜軟腐歐文氏菌具有抑菌活性的枯草芽孢桿菌BSn5 及其產(chǎn)生的抑菌蛋白APn5，但該菌僅能拮抗胡蘿卜軟腐歐文氏菌亞種，其生防范圍較窄。宋光桃[14]發(fā)現(xiàn)短芽孢桿菌Z26 能有效抑制油茶炭疽病病菌、根腐病病菌、半邊瘋病菌等病原菌的生長，該生防菌劑對油茶炭疽病的最大抑制率達(dá)到83.4%。

為給油茶炭疽病防治提供更加準(zhǔn)確的解決途徑，本研究中分析了2 株生防菌對5 種油茶炭疽菌的抑菌活性。

1 材料與方法

1.1 材 料

生防菌：枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisYL13，由油茶內(nèi)生菌誘變獲得，保存于微生物菌種保藏中心。球孢鏈霉菌球孢亞種St.globisporussubsp.globisporusF10，分離自攸縣油茶示范基地土壤，保存于河南林業(yè)職業(yè)學(xué)院微生物菌種保藏中心。

病原菌：膠孢炭疽菌、果生炭疽菌、暹羅炭疽菌、山茶炭疽菌、哈銳炭疽菌由河南林業(yè)職業(yè)學(xué)院微生物菌種保藏中心提供。

培養(yǎng)基：NA 培養(yǎng)基配方為蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、NaCl 5 g、瓊脂18 g、水1 000 mL；NB 培養(yǎng)液配方為蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、NaCl 5 g、水1 000 mL；PDA 培養(yǎng)基配方為土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g；高氏1 號培養(yǎng)基配方為可溶性淀粉20 g、KNO31 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂20 g、水1 000 mL；YL13 培養(yǎng)基配方為蔗糖11 g、牛肉膏16 g、NaCl 4 g；F10 培養(yǎng)液配方為酵母粉5 g、葡萄糖10 g、KH2PO41 g、NaCl 1 g、CaCO33 g、水1 000 mL。

1.2 方 法

1.2.1 拮抗菌發(fā)酵濾液制作

YL13 發(fā)酵液：采用發(fā)酵法，將實驗室保藏的YL13 菌種在NA 培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)2 d 后，用接菌環(huán)移取1 環(huán)，置入裝有20 mL NB 培養(yǎng)液的50 mL 三角瓶中，在搖床（30 ℃、160 r/min）上振蕩培養(yǎng)36 h 制成種子液，按6%的接種量接種至裝有50 mL YL13 培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，在搖床（30 ℃、170 r/min）上振蕩培養(yǎng)36 h，制成發(fā)酵液。

F10 發(fā)酵液：采用發(fā)酵法，將實驗室保藏的F10 菌種在高氏1 號培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)7 d 后，用接菌環(huán)移取直徑為6 mm 的F10 菌餅，置入裝有100 mL 高氏1 號培養(yǎng)液的300 mL 三角瓶中，在搖床（30 ℃、160 r/min）上振蕩培養(yǎng)5 d制成種子液，按10%的接種量接種至裝有100 mL F10 培養(yǎng)基的300 mL 三角瓶中，在搖床（30 ℃、140 r/min）上振蕩培養(yǎng)7 d，制成發(fā)酵液[15]。

將2 種拮抗菌發(fā)酵液分別用0.22 μm 細(xì)菌過濾器過濾，得到拮抗菌發(fā)酵濾液。

1.2.2 拮抗菌發(fā)酵濾液對油茶炭疽菌的抑菌活性測定

將拮抗菌發(fā)酵濾液和約50 ℃的PDA 培養(yǎng)基按體積比1∶19 混勻后倒入培養(yǎng)皿中，冷卻后在平板中央分別放入直徑為6 mm 的5 種炭疽菌（膠孢炭疽菌、果生炭疽菌、暹羅炭疽菌、山茶炭疽菌、哈銳炭疽菌）菌餅。5 d 后測量病菌菌落直徑，每處理3 個重復(fù)，以無菌水為空白對照。抑菌效果用抑菌率（R抑）表示。

R抑=[(d0-d)/(d0-6)]×100%。

式中：d0為對照菌落直徑，d為處理菌落直徑。

1.2.3 拮抗菌發(fā)酵濾液對油茶炭疽菌優(yōu)勢種的效價測定

將拮抗菌發(fā)酵濾液與約50 ℃的PDA 培養(yǎng)基按1∶19、1∶39、1∶99、1∶399、1∶999 的體積比混勻，倒入培養(yǎng)皿中，冷卻后備用。用6 mm 的打孔器在已經(jīng)培養(yǎng)好的果生炭疽菌、膠孢炭疽菌培養(yǎng)基上打取菌絲塊，接種于放置1 d 的培養(yǎng)基上，5 d 后測量病菌菌落直徑，每處理3 個重復(fù)，以無菌水為空白對照。抑菌效果用抑菌率（R抑）表示。

1.2.4 拮抗菌對離體葉片油茶炭疽菌的防治效果測定

選取健康且大小一致的2年生‘湘林1 號’油茶葉片作為接種對象，用75%酒精將葉片消毒30 s，再用無菌水將葉片清洗3 次后晾干，使用一次性注射器針頭將葉片背面表皮挑破但不刺穿，每葉片挑破1處，置于鋪有滅菌吸水紙的培養(yǎng)皿中。預(yù)防試驗處理（處理1～5）為先噴葉接種拮抗菌，然后分別于接種1、2、3、4、5 d 后將果生炭疽菌的菌絲塊接于葉片剌傷處；治療試驗處理（處理6～8）為先將果生炭疽菌的菌絲塊接于葉片剌傷處，然后分別于接種2、3、4 d 后噴葉接種拮抗菌。

2 種拮抗菌各進行8 組處理，以僅接種果生炭疽菌菌絲的葉片作為對照（CK），每處理接種10片，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)保濕培養(yǎng)，光照周期為12 h 光照、12 h 黑暗，逐天連續(xù)觀察并記錄葉片發(fā)病情況。

R病=[(N病-N總)/N總]×100%。

式中：R病為發(fā)病率，N病為發(fā)病葉片數(shù)，N總為總?cè)~片數(shù)。

R防=[(R0-R1)/R0]×100%。

式中：R防表示防治效果，R0為對照發(fā)病率，R1為處理發(fā)病率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Excel 2003 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌發(fā)酵濾液對油茶炭疽菌的抑制效果

拮抗菌發(fā)酵濾液處理下5 種油茶炭疽菌的菌落生長情況如圖1所示。由圖1可以看出，2 種拮抗菌發(fā)酵濾液對5 種炭疽菌的菌絲生長均有不同程度的抑制作用。拮抗菌發(fā)酵濾液對5 種油茶炭疽菌的具體抑制效果見表1。由表1可知，2 種拮抗菌發(fā)酵濾液對膠孢炭疽菌的抑制效果均為最好，抑制率分別為83.46%、62.20%，對山茶炭疽菌的抑制率均為最低，分別為49.15%、30.99%。經(jīng)比較得出，在稀釋20 倍時，YL13 發(fā)酵濾液對5 種炭疽菌的抑制效果由強到弱依次為膠孢炭疽菌、暹羅炭疽菌、果生炭疽菌、哈銳炭疽菌、山茶炭疽菌，F(xiàn)10 發(fā)酵濾液對5 種炭疽菌的抑制效果由強到弱依次為膠孢炭疽菌、果生炭疽菌、哈銳炭疽菌、暹羅炭疽菌、山茶炭疽菌。

圖1 拮抗菌發(fā)酵濾液處理下5 種油茶炭疽菌菌落的生長情況Fig.1 The growth of five species of C.oleifera anthracis colonies under the treatment of antagonistic antibacterial fermentation filtrate

表1 拮抗菌發(fā)酵濾液對5 種油茶炭疽菌的抑制效果Table 1 Inhibitory effect of antagonistic antibacterial fermentation filtrate on five species of C.oleifera anthracis

2.2 拮抗菌發(fā)酵濾液對油茶炭疽菌優(yōu)勢種的效價

不同濃度拮抗菌發(fā)酵濾液對油茶炭疽菌優(yōu)勢種的抑菌率見表2。由表2可知，2 種拮抗菌對2種油茶炭疽菌優(yōu)勢種膠孢炭疽菌和果生炭疽菌的抑菌率均隨著拮抗菌發(fā)酵濾液稀釋倍數(shù)的增加而降低。

表2 不同濃度拮抗菌發(fā)酵濾液對油茶炭疽菌優(yōu)勢種的抑菌率Table 2 Inhibition rate of different concentrations of antagonistic antibacterial fermentation filtrate on dominant species of C. anthracis

當(dāng)YL13 發(fā)酵濾液稀釋至20 倍時，其對膠孢炭疽菌的抑菌率高達(dá)83.46%，對果生炭疽菌的抑菌率相對較低（66.33%），但當(dāng)稀釋倍數(shù)增大，YL13 對膠孢炭疽菌的拮抗效果下降速度要快于對果生炭疽菌的拮抗效果，當(dāng)YL13 發(fā)酵濾液稀釋至40 倍時，YL13 發(fā)酵濾液對果生炭疽菌的抑菌率便超過了其對膠孢炭疽菌的抑菌率。當(dāng)YL13 發(fā)酵濾液稀釋至100 倍時，其對膠孢炭疽菌的抑制率降低至49.21%。因此可推測YL13 發(fā)酵濾液對膠孢炭疽菌的效價約為100 倍。當(dāng)YL13 發(fā)酵濾液稀釋至400 倍時，其對果生炭疽菌的抑菌率為52.86%，當(dāng)稀釋至1 000 倍時，其對果生炭疽菌的抑菌率下降至49.07%。因此可推測，YL13 發(fā)酵濾液對果生炭疽菌的效價約為400 倍。不同濃度YL13 發(fā)酵濾液處理下油茶炭疽菌優(yōu)勢種菌落的生長情況如圖2所示。

圖2 不同濃度YL13 發(fā)酵濾液處理下油茶炭疽菌優(yōu)勢種菌落的生長情況Fig.2 Growth of dominant species of C.anthracis in different concentrations of YL13 fermentation filtrate

F10 發(fā)酵濾液對膠孢炭疽菌和果生炭疽菌的抑制率相差不大。當(dāng)F10 發(fā)酵濾液稀釋至20 倍時，其對膠孢炭疽菌、果生炭疽菌的抑菌率分別為62.20%、61.28%。當(dāng)F10 發(fā)酵濾液稀釋至40 倍時，對膠孢炭疽菌、果生炭疽菌的抑菌率下降幅度相似，抑菌率分別為52.76%、55.39%，同樣當(dāng)F10 發(fā)酵濾液稀釋至100 倍時，其對膠孢炭疽菌、果生炭疽菌的抑菌率分別為39.76%、38.97%。因此可以得出，F(xiàn)10 發(fā)酵濾液對膠孢炭疽菌、果生炭疽菌的效價均約為40 倍。不同濃度F10 發(fā)酵濾液處理下油茶炭疽菌優(yōu)勢種菌落的生長情況如圖3所示。

圖3 不同濃度F10 發(fā)酵濾液處理下油茶炭疽菌優(yōu)勢種菌落的生長情況Fig.3 Growth of dominant species of C.anthracis in different concentrations of F10 fermentation filtrate

2.3 拮抗菌對離體葉片上油茶炭疽菌的防治效果

拮抗菌離體接種對油茶炭疽病的防治效果見表3。由表3可知，在離體葉片上拮抗菌株對油茶炭疽病均有一定的防治效果。在接種YL13 菌株2 d 后再接種病原菌的預(yù)防效果最好，達(dá)到了60%，F(xiàn)10 菌株對油茶炭疽病的預(yù)防和治療均是拮抗菌與病原菌相隔1 d 接種效果最佳，防治效果均達(dá)到了70%。

表3 拮抗菌離體接種對油茶炭疽病的防治效果Table 3 Prevention and control of anthracnose of C.oleifera by inoculation of YL13/F10 %

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌YL13 的發(fā)酵濾液對5 種炭疽菌的抑制效果由強到弱依次為膠孢炭疽菌、暹羅炭疽菌、果生炭疽菌、哈銳炭疽菌、山茶炭疽菌，鏈霉菌F10 的發(fā)酵濾液對5 種炭疽菌的抑制效果由強到弱依次為膠孢炭疽菌、果生炭疽菌、哈銳炭疽菌、暹羅炭疽菌、山茶炭疽菌，YL13 和F10 對膠孢炭疽菌的抑制效果均為最佳，抑制率分別為83.46%、62.20%，對山茶炭疽菌抑制率均最低，分別為49.15%、30.99%。YL13 發(fā)酵濾液對膠孢炭疽菌的效價約為100 倍，對果生炭疽菌的效價約為400 倍，F(xiàn)10 發(fā)酵液對膠孢炭疽菌和果生炭疽菌的效價均約為40 倍。2 株拮抗菌對5 種炭疽菌均具有較為明顯的抑制作用，其中YL13 表現(xiàn)出抑菌活性最高，其發(fā)酵濾液稀釋20 倍后對膠孢炭疽菌的抑制率高達(dá)83.46%，當(dāng)2種拮抗菌的發(fā)酵濾液稀釋至一定濃度后，抑菌率均發(fā)生了不同程度的降低。隨著稀釋倍數(shù)的增大，YL13 的抑菌活性降低速率遠(yuǎn)超過F10。在離體葉片上拮抗菌株對油茶炭疽病均有一定的防治效果，在接種YL13 菌株2 d 后再接種病原菌的預(yù)防效果最好，達(dá)到了60%，F(xiàn)10 菌株對油茶炭疽病的預(yù)防和治療均是拮抗菌與病原菌相隔1 d 接種效果最佳，防治效果均達(dá)到了70%。

自人類發(fā)現(xiàn)可以用微生物來防治植物病害，已有許多高效拮抗菌株被報道[16-17]，各類生防菌劑也不斷被開發(fā)。微生物主要通過產(chǎn)生拮抗物質(zhì)及競爭、溶菌作用，在寄主植物上對病原菌作用，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性及促進植物生長。通過對拮抗菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物進行深入分析，結(jié)果表明芽孢桿菌產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)主要有細(xì)菌素、酶類、活性蛋白類、脂肽類及多肽類物質(zhì)等[18]，鏈霉菌可以產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，還產(chǎn)生許多其他生物活性物質(zhì)，如免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)、酶制劑、藥理活性物質(zhì)、植物生長調(diào)節(jié)劑等[19]。本研究中使用的2 株炭疽病拮抗菌分別為枯草芽孢桿菌YL13 和球孢鏈霉菌球孢亞種F10，YL13 是由健康油茶葉中分離出的拮抗菌Y13 誘變而來，F(xiàn)10 是從油茶根際土壤分離得到的，2 種菌均由中南林業(yè)科技大學(xué)森林保護和微生物研究團隊進行過初步的拮抗試驗，均具有良好的抑菌效果[20-23]。前期研究結(jié)果表明：枯草芽孢桿菌YL13 是通過分泌蛋白酶、脂肽類物質(zhì)來影響病原菌菌絲的生長，還可通過分泌相關(guān)防御酶誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性來防治油茶炭疽??；鏈霉菌F10 是通過分泌蛋白酶和纖維素酶來影響油茶炭疽菌細(xì)胞壁的形成，從而抑制其菌絲的生長[24]。此研究結(jié)果為開展2 株拮抗生防菌對油茶炭疽病多種病原的抑菌活性及防效研究提供了良好的理論基礎(chǔ)。

除了從自然界分離篩選得到生防菌，還可通過與化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配、與其他拮抗微生物相互協(xié)同使用、誘變或利用基因工程技術(shù)改良生防菌等方式，得到更為高效且穩(wěn)定的菌株。其中，基因工程改良菌種主要通過誘變、DNA 重組、原生質(zhì)體融合及準(zhǔn)性生殖來實現(xiàn)，是目前研究的熱點。張霞等[25]通過轉(zhuǎn)座子Tn917 的轉(zhuǎn)座誘變，構(gòu)建了枯草芽孢桿菌B931 的突變體庫，篩選得到了6 個對小麥全蝕病菌抑制能力喪失且產(chǎn)生生長素、赤霉素、細(xì)胞分裂素能力增加的突變體。朱海霞等[26]以對野麥有強致病力的菌株Fusarium oatroseGD-2和TrichodermaHZ-31 作為親本，進行原生質(zhì)體融合，得到融合子，盆栽致病力測定結(jié)果顯示，融合子R1 對野燕麥的防效值高于親本。將生防菌與其他互融的拮抗微生物共同施用，使之發(fā)揮相互協(xié)同作用，增強混合菌株的競爭力，也是目前改進生防菌劑效果的常用方式。此外，生防菌不僅可用于防治植物病害，還可在醫(yī)藥、環(huán)境保護等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，具有廣闊的開發(fā)前景。

本研究中得出了2 種拮抗菌對2 種炭疽菌優(yōu)勢種的效價及其對5 種炭疽菌的拮抗能力，但是由于目前尚未深入了解2 種拮抗菌的具體抑菌機制，且不同炭疽菌的菌絲生長速率相差較大，在一定程度上影響了其相對抑菌率，因此，應(yīng)更加深入地對其產(chǎn)生拮抗作用的抑菌物質(zhì)、抑菌機制等進行探究。另外，可以對不同地區(qū)的炭疽菌優(yōu)勢種進行調(diào)查，有針對性地施用菌劑，達(dá)到精準(zhǔn)施藥的目的。目前，微生物防治在實際應(yīng)用中仍存在許多問題。在田間施用時，由于受到生存環(huán)境如溫度、濕度、光照、pH 等因素的影響，大多生防菌的效用不穩(wěn)定，因此目前多數(shù)生防菌處于無法推廣使用的狀態(tài)，因此應(yīng)進一步探究微生物菌劑的田間施用效果。