陳 竹,郭巖彬,孟凡喬,邵小明,劉寶駒,吳文良,*

1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院, 北京 100000 2 貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 貴陽 550000

硝化作用介導(dǎo)銨態(tài)氮向硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化的過程, 它不僅影響氮對植物的有效性, 還與面源污染和 溫室氣體排放有關(guān)[1]。氨氧化是硝化作用的限速步驟, 也是評估土壤氮循環(huán)的重要指標(biāo)[2]。氨氧化古菌 (ammonia-oxidizing archaea, AOA) 、氨氧化細(xì)菌 (ammonia-oxidizing bacteria, AOB)[2- 4]和新近發(fā)現(xiàn)的全程氨氧化微生物 (complete ammonia oxidizer, Comammox)[5]是氨氧化的主要參與者。AOA是強(qiáng)酸性土壤中氨氧化作用的主要驅(qū)動者[6], 但AOA最高僅能耐受20 mM的銨, 這遠(yuǎn)低于多數(shù)AOB適宜的銨濃度 (50—1000 mmol/L[7]), 因此在高氮或堿性土壤中, 氨氧化過程多由AOB主導(dǎo)[8-9]。

長期定位施肥會對氨氧化微生物的活性、群落豐度和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生深刻影響[10]。大量研究表明,中性和堿性土壤上施用氮肥只改變AOB的群落組成和豐度,酸性土壤上則影響AOA[11- 14]。但楊亞東等[15]和羅培宇等[16]對水稻土和東北棕壤研究結(jié)果表明,施用氮肥后AOA和AOB的群落豐度和多樣性都顯著升高。這表明淹水、低溫和干旱等極端環(huán)境下可能產(chǎn)生獨(dú)特的氨氧化微生物種群,它們對施肥的響應(yīng)有待進(jìn)一步研究。

干旱半干旱生態(tài)系統(tǒng)占全球陸地面積的 41%, 全球約有 38% 的人口居住于此[17], 發(fā)展和可持續(xù)的矛盾在這一地區(qū)非常突出。目前, 對干旱半干旱地區(qū)農(nóng)田土壤氨氧化微生物影響的報道較少。本研究以內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院旱作實驗站的長期定位實驗為基礎(chǔ), 利用實時熒光定量PCR、末端限制性片段長度多態(tài)性(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism, T-RFLP) 和克隆文庫分析：1) 長期施用化肥、有機(jī)肥對干旱半干旱地區(qū)農(nóng)田土壤AOB 和 AOA 群落數(shù)量、結(jié)構(gòu)以及活性的影響；2) 影響 AOB、AOA 群落變化的主要環(huán)境因子。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)計與樣品采集

本研究土壤樣品采自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)武川長期定位試驗地 (40°59′N, 110°33′E), 土壤為栗鈣土[18]。該地屬于溫帶大陸性季風(fēng)氣候, 年平均氣溫2.5℃, 年降雨量343.6 mm。試驗始于2004 年, 采用馬鈴薯—油菜—莜麥一年一熟輪作制。共設(shè)置5 個處理, 肥料用量及配比根據(jù)測土配方施肥確定：對照 (CK, 不使用肥料)、氮 (N, 單施尿素, 60 N kg/hm2)、有機(jī)肥 (O, 單施羊糞, 37.5 N kg/hm2, 15 P2O5kg/hm2, 55.5 K2O kg/hm2)、氮磷鉀 (NPK, 尿素+磷酸二銨+氯化鉀, 60 N kg/hm2, 45 P2O5kg/hm2, 30 K2O kg/hm2)、氮磷鉀+有機(jī)肥 (NPK+O, 尿素+磷酸二銨+氯化鉀 (60 N kg/hm2, 45 P2O5kg/hm2, 30 K2O kg/hm2) +羊糞 (37.5 N kg/hm2, 15 P2O5kg/hm2, 55.5 K2O kg/hm2))?；驶靹蚝笤诓シN時開溝側(cè)施, 有機(jī)肥于每年作物播種前均勻撒在地表, 隨翻土施入。每個處理三個重復(fù), 隨機(jī)區(qū)組排列, 小區(qū)面積3 m2, 試驗區(qū)面積50 m2。樣品于2012年7月采集,地上部作物為莜麥。每小區(qū)用土鉆隨機(jī)采集5個土壤樣品后均勻混合。土壤樣品過 2 mm 篩后, 用于DNA提取和酶活測定的樣品保存于 -80℃, 其余樣品風(fēng)干后保存待測。

1.2 土壤理化性質(zhì)測定

土壤 pH 以水土比 1∶2.5 測定。土壤銨態(tài)氮及硝態(tài)氮用流動分析儀 (Bran-Luebbe, Germany) 測定。土壤有機(jī)質(zhì)和全氮用碳氮分析儀 (Thermo Fischer, USA) 測定。土壤磷酸鹽的測定依據(jù) Olsen等[19]的方法。土壤PNR采用氯酸鉀抑制法測定[20]。

1.3 DNA的提取及氨氧化微生物 amoA基因?qū)崟r熒光定量PCR測定

土壤DNA由 0.25 g 土壤用 PowerSoil DNA Isolation Kit (Mobio, USA) 依據(jù)說明書提取。AOB 的amoA基因?qū)崟r熒光定量 PCR 引物為amoA- 1F/amoA- 2R[21]。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性 120 s；94℃ 變性 45 s, 57℃ 退火 1 min, 72℃ 延伸 45 s, 共35個循環(huán)。AOA 的amoA基因?qū)崟r熒光定量 PCR 引物為 CrenamoA23f/CrenamoA616r[22]。反應(yīng)程序為：94℃ 預(yù)變性 2 min；94℃ 變性 45 s, 53℃ 退火 1 min, 72℃ 延伸 45 s, 共35 個循環(huán)。反應(yīng)體系均為20 μL：10 μL SYBR Premix Ex Taq (Takara, 大連), 上下游引物各1 μL, 2 μL BSA, 1 μL 的模板或標(biāo)線DNA, 6 μL 滅菌超純水。標(biāo)準(zhǔn)曲線以AOA和AOB的amoA基因克隆制備質(zhì)粒。AOA 在83℃ 收集反應(yīng)熒光信號, 氨氧化細(xì)菌在 81℃ 收集反應(yīng)熒光信號以防止引物二聚體所引起的誤差。反應(yīng)完成后設(shè)置溶解曲線用以檢驗產(chǎn)物的特異性, 其程序為 55℃ 至 99℃ 之間, 每 1℃讀數(shù)一次。qPCR擴(kuò)增反應(yīng)在 ABI 7500 Real-time PCR (ABI, USA) 上進(jìn)行。

1.4 amoA基因的T-RFLP分析

AOBamoA基因的T-RFLP 分析用amoA- 2R和6-carboxyfluorescein (FAM) 標(biāo)記的amoA- 1F 作為引物。PCR程序為 94℃ 變性 5 min；然后 94℃ 變性 30 s、57℃ 退火 30 s、72℃ 延伸 60 s, 共 35個循環(huán)；最后72℃ 延伸 10 min。電泳檢測 PCR 產(chǎn)物特異性, 用 PCR 產(chǎn)物純化試劑盒 (Axygen, USA) 純化。純化產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶MspI (NEB, UK) 酶切。AOAamoA基因的T-RFLP 分析用 CrenamoA616r 和 FAM 標(biāo)記的CrenamoA23f 作為引物。PCR程序為 94℃ 變性 5 min；然后 94℃ 變性30 s、60℃ 退火 30 s、72℃ 延伸 60 s, 共 35個循環(huán)；最后 72℃ 延伸 10 min。電泳檢測 PCR 產(chǎn)物特異性, 然后用 PCR產(chǎn)物純化試劑盒 (Axygen) 純化PCR產(chǎn)物。純化產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶MboI (NEB) 酶切。酶切產(chǎn)物與甲酰胺和 GeneScanTM- 500 Liz (ABI) 混合。酶切片段長度用 ABI-PRISM 3030XL Genetic Analyzer (ABI, UK) 軟件檢測。每個峰的相對豐度用 GeneMarker version 2.2 (http://www.softgenetics.com) 軟件進(jìn)行分析。

1.5 克隆文庫的構(gòu)建與分析

將每個處理3個重復(fù)的DNA單獨(dú)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,擴(kuò)增體系同1.4。每個處理的PCR產(chǎn)物等體積混合后用pEASY-T1 載體 (TransGen Biotech, Beijing) 進(jìn)行克隆并測序。序列由BLAST-N在線比對驗證。AOB 和 AOA 分別構(gòu)建5個文庫,每個文庫包含12 條序列。用 MEGA v.4.0以 neighbor-joining 法構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.6 統(tǒng)計分析

使用 one-way ANOVA 的 Duncan′s 檢驗在P< 0.05 水平計算各指標(biāo)在處理間的差異顯著性。用 Spearman 相關(guān)性指數(shù)計算各指標(biāo)之間的相關(guān)性。用R語言 (http://www.R-project.org) 的“Vegan”程序包進(jìn)行ANOSIM 分析以比較處理間AOB和AOA 的群落結(jié)構(gòu)的相似性, 冗余分析 (redundancy analysis, RDA) 結(jié)合BIOENV來分析環(huán)境因子對群落的影響, 控制方差膨脹因子使其小于10, 并用蒙特卡洛置換檢驗分析環(huán)境因子和群落之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 土壤理化性質(zhì)

表1 土壤理化性質(zhì)

2.2 硝化潛式和氨氧化微生物群落豐度

圖1 不同處理土壤的硝化潛式和氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌的數(shù)量Fig.1 Potential nitrification rate, bacterial and archaea amoA genes abundances in different treatment *處理：不施肥 (CK)；氮 (N)；有機(jī)肥 (O)；氮磷鉀 (NPK)；氮磷鉀+有機(jī)肥 (NPK+O);平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤 (n=3);不同字母表示不同處理間有顯著差異性 (P < 0.05)

表2 AOA、AOB豐度與PNR、土壤化學(xué)性質(zhì)的相關(guān)性

2.3 氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)

基于AOAamoA基因的T-RFLP分析得到5個末端限制性片段(圖2)。ANOSIM 分析表明各處理間土壤 AOA 群落間沒有顯著性差異 (R=0.08,P=0.202; 表3)?；贏OBamoA基因的T-RFLP分析得到4個末端限制性片段, 包括tRF 60 bp、tRF 156 bp、tRF 235 bp和tRF 256 bp (圖2)。tRF 156 bp 在CK處理土壤中的相對豐度顯著高于其他處理, N處理土壤中tRF 256 bp 的相對豐度最高。O處理土壤中tRF 60 bp 的相對豐度顯著高于其他處理。ANOSIM分析表明各處理間土壤AOB 群落都有顯著性差異 (P< 0.05; 表3)。

圖2 不同處理中土壤氨氧化古菌和氨氧化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)Fig.2 T-RFLP fingerprints of the archaea and bacterial amoA gene fragments in different treatment *平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤 (n=3)

表3 氨氧化細(xì)菌和古菌群落的ANOSIM分析

通過構(gòu)建 AOB 文庫, 檢測到 4 個 tRF 片段, 包括 tRF 256 bp、tRF 235 bp、tRF 156 bp 和tRF 62 bp (圖3)。系統(tǒng)發(fā)育樹表明所有序列都屬于亞硝化螺菌 (Nitrosospira), 主要分為NitrosospiraCluster 3a.1、Cluster 3a.2、Cluster 3b、Cluster 9和Cluster 2-related。CK土壤中主要種群為NitrosospiraCluster 3a.1 (75%),而在N、O、NPK 和NPK+O處理的土壤中NitrosospiraCluster 3a.2 的比例更高(>50%)。屬于NitrosospiraCluster 3b的序列僅在O處理的土壤中檢測到,其模擬酶切tRF片段大小為 60 bp。僅在N處理的土壤中發(fā)現(xiàn)模擬酶切tRF片段大小為 256 bp 的序列,它與Nitrosospirasp. Nsp58 (Cluster 2-related) 有很高的相似性 (97% sequence identity)。RDA 和BIOENV分析表明pH和土壤含水量可以完全解釋AOB 群落的變化 (100%),是影響 AOB 群落結(jié)構(gòu)變化的關(guān)鍵因子 (rho=0.179,Pr< 0.05) (圖4)。通過構(gòu)建 AOA 文庫, 檢測到 7個 tRF 片段, 包括 tRF75 bp、 tRF 131 bp、 tRF 324 bp、 tRF 417 bp、tRF 438 bp、tRF 441 bp 和tRF 550 bp, 系統(tǒng)發(fā)育樹表明所有序列都屬于Cluster I.1b (Nitrososphaere, 圖5)。

圖3 不同處理中氨氧化細(xì)菌 amoA 基因的遺傳進(jìn)化樹Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree of the bacterial amoA sequences in different fertilization regimess

圖4 不同土地利用方式下土壤氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)RDA分析Fig.4 RDA of soil parameters effect on ammonia-oxidizing bacterial communities using the T-RFLP data *不施肥 (CK)；氮 (N)；有機(jī)肥 (O)；氮磷鉀 (NPK)；氮磷鉀+有機(jī)肥 (NPK+O)

圖5 不同處理中氨氧化古菌 amoA 基因的遺傳進(jìn)化樹Fig.5 Neighbor-joining phylogenetic tree of the archaea amoA sequences in different fertilization regimess

3 討論

不同施肥處理土壤AOAamoA基因拷貝數(shù)在 (1.65×107—3.34×107)拷貝數(shù)/g干土之間, 高于AOBamoA的基因拷貝數(shù) (5.99×105—1.21×107) 拷貝數(shù)/g干土, 這與在潮土[13]、堿性壤土[11]、紅壤[12]上的研究結(jié)果一致。多數(shù)研究表明, 堿性土壤中施用氮肥不影響AOA群落豐度[11, 23], 但在本研究中, 無論施用化肥還是有機(jī)肥, AOA數(shù)量都有升高的趨勢,其中,單施尿素處理土壤AOA數(shù)量顯著高于CK (圖1), 這與Hu等[24]在干旱半干旱草原上的研究結(jié)果一致。在干旱環(huán)境中, 極低的土壤含水量會阻斷物質(zhì)傳遞, 受根系和微生物吸收銨時分泌氫離子影響,土壤中可能形成大量利于AOA繁殖的酸性微環(huán)境。

N、NPK和NPK+O處理土壤的AOBamoA基因拷貝數(shù)和PNR顯著高于CK (圖1), 這與Shen[11]、Cui[23]等在堿性土壤上的結(jié)果一致, 表明施用化肥后會促進(jìn)AOB的增長, 增大硝態(tài)氮淋洗的風(fēng)險。AOBamoA基因克隆文庫的結(jié)果表明, 93%以上的序列都屬于Nitrosospiracluster 3 (圖 4)。Nitrosospiriacluster 3 在農(nóng)田土壤 AOB 群落中的主導(dǎo)地位已經(jīng)被廣泛驗證[1,10]。T-RFLP分析和文庫分析均表明,Nitrosospiriacluster 3a.1是CK處理中的優(yōu)勢種群, 而施用氮肥后,優(yōu)勢種群轉(zhuǎn)變?yōu)镹itrosospiriacluster 3a.2 (圖 2, 圖 3)。這與Guo[25]和Chen[26]等的研究結(jié)論一致。與CK相比, 施用有機(jī)肥沒有增加AOBamoA基因拷貝數(shù) (圖1)。有機(jī)肥中的銨態(tài)氮礦化緩慢, 而且有機(jī)肥的施用可能促使其他土壤微生物生長并與AOB競爭無機(jī)氮[27-28]。值得注意的是,Nitrosospiriacluster 3b的比例在O處理土壤中顯著升高 (圖 2, 圖 3), 表明與Nitrosospiriacluster 3a相比,Nitrosospiriacluster 3b更適應(yīng)有機(jī)氮源[12,29]。