呂貝貝, 張麗萍, 張貴云, 劉 珍, 范巧蘭, 姚 眾, 常芳娟

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所 運(yùn)城 044000)

土壤微生物作為陸地生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵組分[1],在介導(dǎo)土壤有機(jī)質(zhì)分解和養(yǎng)分循環(huán)方面發(fā)揮著核心作用, 對決定土壤質(zhì)量、農(nóng)業(yè)和生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)性至關(guān)重要[2]。已有研究表明, 耕作方式在影響土壤參數(shù)、土壤微生物群落結(jié)構(gòu)以及微生物生物量等方面起重要作用[3-4]。真菌是土壤環(huán)境中的重要分解者,參與分解和循環(huán)土壤有機(jī)質(zhì)和礦物質(zhì)營養(yǎng)成分, 包括木質(zhì)素、纖維素、碳、氮等[5]。耕作可以通過破壞土壤團(tuán)聚體和菌絲體網(wǎng)絡(luò), 改變植物殘?bào)w降解能力, 并改變土壤微氣候, 在很大程度上影響土壤真菌群落結(jié)構(gòu)[6]。

保護(hù)性耕作是一項(xiàng)旱地耕作技術(shù), 可通過秸稈覆蓋、免耕或少耕等方式, 將作物殘茬和有機(jī)物質(zhì)留在土壤表面, 以保護(hù)土壤免受板結(jié)和侵蝕[7-8]。而傳統(tǒng)耕作會對上層土壤造成物理破壞, 從而形成物理特性和養(yǎng)分分布相對一致的均勻土層[3]。在我國北方旱作區(qū), 采用保護(hù)性耕作技術(shù)替代傳統(tǒng)耕作,能夠減少土壤擾動, 改善土壤結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性, 提高土壤肥力和持水能力, 增加土壤微生物活性和多樣性[9-12]。近年來, 有關(guān)土壤微生物對耕作方式響應(yīng)的研究受到了廣泛關(guān)注, 國內(nèi)外有關(guān)保護(hù)性耕作對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響已有諸多研究。我們在前期的研究結(jié)果[13]也表明, 長期保護(hù)性耕作,尤其是免耕與深松作業(yè)相結(jié)合的保護(hù)性耕作方式,促進(jìn)了土壤叢枝菌根真菌(AMF)向土壤深層發(fā)展,提高了土壤AMF的多樣性。但是長期采用保護(hù)性耕作措施并非總是產(chǎn)生正效應(yīng)。馬璐璐等[14]研究發(fā)現(xiàn),玉米(Zea mays)秸稈連年還田會引起小麥莖基腐病日益加重。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn), 相比傳統(tǒng)耕作, 免耕秸稈覆蓋顯著提高了土壤真菌的豐富度, 顯著增加了兩種病原菌[禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)和串珠鐮刀菌(Fusarium moniliforme)]的豐度,說明長期保護(hù)性耕作可能會增加中國東北地區(qū)玉米根腐病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。保護(hù)性耕作現(xiàn)已在全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大力推廣和應(yīng)用[16], 隨之而來的經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益也越來越顯著[17]。但是不同地區(qū)土壤真菌群落的變化并不完全一致, 對耕作方式的響應(yīng)尚有爭議[18],所產(chǎn)生的影響是正向還是負(fù)向并未明確。因此, 目前尚不清楚保護(hù)性耕作如何以及是否有助于可持續(xù)農(nóng)業(yè), 考慮到保護(hù)性耕作對于雜草和病蟲害控制的潛在負(fù)面影響[19], 為更好地了解黃土高原旱作麥田農(nóng)業(yè)實(shí)踐對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響, 以及長期保護(hù)性耕作介導(dǎo)土壤微生物群落的機(jī)制, 本研究采用高通量測序方法, 監(jiān)測黃土高原旱作麥田不同耕作方式下土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的變化, 以期為選擇并建立合理的保護(hù)性耕作制度提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

本研究于2019年在山西省臨汾市堯都區(qū)城隍村(36°01′N, 111°37′E, 海拔555 m)進(jìn)行, 所依托的保護(hù)性耕作體系長期定位試驗(yàn)始于1992年。該區(qū)域?qū)冱S土高原, 年均氣溫12.2 ℃, 0 ℃以上積溫4600 ℃, 無霜期195 d, 年均地溫13.8 ℃。年均降水量515.7 mm, 且均集中在7—9月份; 年均蒸發(fā)量1933.1 mm。試驗(yàn)區(qū)土壤為碳酸鹽褐土, 種植制度為長期單一種植冬小麥(Triticum aestivum)。試驗(yàn)區(qū)無灌溉條件, 作物生長依靠自然降水。試驗(yàn)期間平均氣溫較常年偏高1.2 ℃, 降水量偏少44.0 mm。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)依托長達(dá)27年(始于1992年)的保護(hù)性耕作試驗(yàn)平臺, 選擇傳統(tǒng)耕作(TT1)、免耕覆蓋(NTS)、連續(xù)深松覆蓋4年后免耕覆蓋(SNTS) 3種耕作處理方式(表1)。每個(gè)處理3次重復(fù), 小區(qū)面積為600 m2。供試小麥品種為‘長6359’, 播種量120 kg·hm-2, 2018年9月23日播種。試驗(yàn)田化肥使用量尿素為225 kg·hm-2, 磷酸二銨為150 kg·hm-2。

表1 不同耕作處理方式描述Table 1 Description of different tillage treatments

1.3 土樣采集與測定分析

于2019年5月6日(小麥灌漿期)采集小麥根圍土樣。每小區(qū)五點(diǎn)法取樣, 去掉表土, 用土鉆從0～20 cm土層采集小麥根部周圍0～5 cm范圍土壤,每點(diǎn)采集3份土樣, 除去砂石、根系等雜物, 混勻后裝入10 mL塑料離心管中, 低溫條件下帶回實(shí)驗(yàn)室,保存于-80 ℃冰箱中, 用于分析土壤真菌群落結(jié)構(gòu)。

土壤總DNA的提取及PCR擴(kuò)增: 土壤微生物基因組總DNA的提取采用試劑盒進(jìn)行。采用引物ITS5-1737F (5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS2-2043R (5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)對土壤真菌ITS1區(qū)rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增。30 μL PCR反應(yīng)體系: Phusion Master Mix (New England Biolabs, 2×) 15 μL, Primer (2 μmol·L-1) 3 μL, Genomic DNA (1 ng·μL-1) 10 μL, dd H2O 2 μL。PCR反應(yīng)條件為: 98 ℃ 1 min; 98 ℃ 10 s, 50 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s, 共30個(gè)循環(huán); 72 ℃ 5 min。每個(gè)樣本重復(fù)3次, PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測, 對目的條帶使用qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量, 文庫合格后, 使用Illumina公司的HiSeq 2500進(jìn)行上機(jī)測序。土壤真菌總DNA的提取及測序由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.4 生信和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

測序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過拼接、質(zhì)控、嵌合體過濾, 得到有效序列, 將相似度≥97%的有效序列進(jìn)行OTU聚類, 采用軟件RDP classifier對序列進(jìn)行分類注釋。使用R語言繪制樣品物種組成Venn圖、相對豐度柱狀圖和聚類熱圖。以Unweighted Unifrac距離矩陣構(gòu)建UPGMA(非加權(quán)組平均法, unweighted pair-group method with arithmetic means)樣品聚類樹并將聚類結(jié)果與各樣品在門水平上的物種相對豐度整合。選用LEfSe統(tǒng)計(jì)分析方法對樣本間真菌多樣性差異進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。使用QIIME軟件分析樣品的Alpha多樣性, 計(jì)算真菌的Chao1、ACE、Shannon、Simpson、PD_whole_tree、Good’s-coverage等。采用WPS表格整理數(shù)據(jù), SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析, 并用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同耕作方式土壤真菌物種組成

如圖1A所示, 不同耕作方式對土壤真菌OTU有明顯影響。3個(gè)處理共產(chǎn)生2161個(gè)OTU, 其中共有的677個(gè), 占總OTU數(shù)量的31.33%。TT1、NTS和SNTS分別具有1200、1416和1432個(gè)OTU。SNTS獨(dú)有的OTU最多, TT1獨(dú)有的OTU最少。TT1和SNTS共有的OTU最少(804個(gè)), NTS和SNTS共有的OTU最多(949個(gè))。結(jié)果表明, 3個(gè)處理真菌物種組成存在差異,免耕和深松免耕增加了土壤真菌類群。

由圖1B可知, 3個(gè)處理檢測出的真菌門主要包括子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、接合菌門(Zygomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和球囊菌門(Glomeromycota)。NTS處理檢測出了分類地位不確定真菌。其中, 子囊菌門(58.02%～71.03%)、擔(dān)子菌門(19.34%～33.02%)、接合菌門(7.64%～15.92%)為優(yōu)勢菌門, 均為常見門類。與TT1相比, NTS和SNTS子囊菌門、接合菌門、壺菌門和球囊菌門真菌相對豐度增加, 擔(dān)子菌門相對豐度減少。

屬水平上, 選取不同耕作處理豐度排名前35的真菌屬繪制熱圖(圖2)。由圖2可知, TT1中端梗孢屬(Acrophialophora, 10.46%)和被孢霉屬(Mortierella,3.88%)為優(yōu)勢屬, NTS中赤霉菌屬(Gibberella, 5.60%)和鐮刀菌屬(Fusarium, 3.38%)為優(yōu)勢屬, SNTS中漆斑菌屬(Myrothecium, 8.06%)和赤霉菌屬(7.64%)為優(yōu)勢屬。與TT1相比, NTS和SNTS導(dǎo)致漆斑菌屬、赤霉菌屬、圓盤菌屬(Orbilia)、核腔菌屬(Pyrenophora)、枝孢屬(Cladosporium)、鐮刀菌屬、花冠菌屬(Corollospora)、鏈格孢屬(Alternaria)相對豐度增加, 端梗孢屬、被孢霉屬相對豐度減少。

對3個(gè)處理的土壤真菌相似性進(jìn)行UPGMA聚類分析(圖3)。由圖3可知, 不同耕作處理真菌群落組成可分為兩大類, NTS和SNTS處理在聚類關(guān)系上具有高度趨同性, 表明NTS和SNTS群落組成最接近。

2.2 不同耕作方式土壤真菌群落的多樣性分析

LEfSe分析中, 選擇LDA Score大于3.5的差異物種進(jìn)行柱狀圖展示(圖4A), 柱狀圖的長度代表差異顯著物種的影響大小。由圖4A可知, TT1中具有顯著差異的關(guān)鍵優(yōu)勢物種(即Biomarker)分別為1個(gè)綱、1個(gè)目、1個(gè)科, 均屬擔(dān)子菌門。NTS中的Biomarker是1個(gè)種, 屬子囊菌門。SNTS中的Biomarker是1個(gè)科, 也屬子囊菌門。在圖4B進(jìn)化分支圖中, 小圓圈直徑大小與相對豐度大小呈正比,黃色代表無顯著差異的物種, 有顯著差異的物種跟隨處理進(jìn)行著色, 紅色、綠色、藍(lán)色節(jié)點(diǎn)分別代表在NTS、SNTS、TT1中起到重要作用的微生物類群。由圖4B可知, 擔(dān)子菌門的銀耳科(Tremellale)和子囊菌門的柔膜菌科(Helotiaceae)是影響各處理土壤真菌群落顯著變化的Biomarker。

不同耕作方式土壤真菌群落的Alpha多樣性指數(shù)如表2所示。其中observed_species代表觀察到的物種數(shù), Chao1和ACE代表菌群豐度, Shannon和Simpson代表菌群多樣性, PD_whole_tree代表系統(tǒng)發(fā)育多樣性, Good’s-coverage代表測序深度。由表2可知, 各處理文庫覆蓋率均在99%以上, 說明各樣本測序深度合理。NTS處理土壤真菌豐富度和系統(tǒng)發(fā)育多樣性大于TT1和SNTS, SNTS處理土壤真菌多樣性大于TT1和NTS, 各處理間差異不顯著。結(jié)果表明, 免耕和深松免耕能不同程度提高土壤真菌群落的豐富度和多樣性, 但均未產(chǎn)生顯著影響。

表2 不同耕作方式下土壤真菌群落的Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity indexes of soil fungal community under different tillage treatments

3 討論

3.1 保護(hù)性耕作對土壤真菌群落組成的影響

土壤耕作會影響微生物群落, 促進(jìn)或者抑制重要的生態(tài)過程, 影響土壤可持續(xù)性利用[20-21]。本研究結(jié)果表明, 與傳統(tǒng)耕作相比, 長期保護(hù)性耕作小麥根圍土壤真菌組成及相對豐度發(fā)生了顯著變化,出現(xiàn)一些類群相對豐度增加或減少的現(xiàn)象, NTS處理出現(xiàn)了新的真菌類群。在本研究中, 3種耕作方式土壤真菌群落中子囊菌門、擔(dān)子菌門、接合菌門均為優(yōu)勢菌門, 這與Wang等[15]的研究結(jié)果基本一致。其中相對豐度最高的真菌門為子囊菌門, 是農(nóng)業(yè)土壤中最大的真菌類群, 受植物種類和秸稈殘留降解影響較大, 其豐度隨著養(yǎng)分添加而增加[22], 許多是重要的植物病原物[23]。而擔(dān)子菌門的相對豐度隨保護(hù)性耕作制度的實(shí)施而降低的原因, 可能是擔(dān)子菌門可在厭氧環(huán)境下降解木質(zhì)素及纖維素[24], 傳統(tǒng)耕作土壤中的殘留物可能有較高的木質(zhì)素含量[5]。UPGMA結(jié)果表明, NTS和SNTS的群落結(jié)構(gòu)較為相似, 與TT1的差異較大, 表明長期進(jìn)行免耕覆蓋和深松+免耕覆蓋土壤真菌群落已基本趨為一致, 這與張貴云等[25]對該地區(qū)原核微生物群落多樣性的研究結(jié)果相一致。本研究中TT1處理中具有顯著差異的關(guān)鍵優(yōu)勢物種均屬擔(dān)子菌門, NTS和SNTS的均屬子囊菌門, 也與上述結(jié)論相吻合。馮翠娥等[26]認(rèn)為,接合菌門會引發(fā)植物病害, 破壞生物多樣性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用保護(hù)性耕作土壤中的接合菌門增加,可能是秸稈還田中未經(jīng)處理的小麥病殘?bào)w增加了土壤病原菌的數(shù)量[27]。

保護(hù)性耕作的關(guān)鍵要素之一是管理農(nóng)作物殘留物, 使作物病害最小化[28]。土壤表面殘留的作物殘茬是后續(xù)作物某些病害的潛在接種源[29]。近年來, 秸稈還田和免耕等保護(hù)性耕作措施的推廣應(yīng)用, 為病原菌的生長、繁殖和積累提供了適宜的條件, 導(dǎo)致小麥土傳病害的發(fā)生日益嚴(yán)重[30-31]。小麥赤霉病是小麥的主要病害之一, 其病原菌是一種子囊菌, 無性型是禾谷鐮孢(Fusarium graminearum), 有性型是玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)[32]。本研究結(jié)果表明, 屬水平上, 與傳統(tǒng)耕作相比, 兩種保護(hù)性耕作方式中赤霉菌屬相對豐度增加, 且均為優(yōu)勢屬。同時(shí)鐮刀菌屬相對豐度相較傳統(tǒng)耕作也有所增加。說明該地區(qū)多年的保護(hù)性耕作會加大小麥赤霉病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

3.2 保護(hù)性耕作對土壤真菌多樣性的影響

保護(hù)性耕作能夠?yàn)橥寥牢⑸锏纳L繁殖創(chuàng)造有利的環(huán)境條件。在免耕和少耕系統(tǒng)中, 土壤表面的作物殘茬比傳統(tǒng)耕作更多, 從而增加了碳底物利用率, 提高了表層土壤微生物的生物量[33]。此外, 土壤真菌是以菌絲的形式生長, 對物理干擾非常敏感,保護(hù)性耕作由于減少了土壤擾動, 因而比傳統(tǒng)耕作更有利于真菌形成能夠捕獲和運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)的完整菌絲網(wǎng)絡(luò)[31]。Li等[34]對1980—2018年間有關(guān)土壤微生物種群、群落結(jié)構(gòu)及多樣性變化對保護(hù)性耕作措施響應(yīng)的多項(xiàng)研究進(jìn)行了meta分析, 結(jié)果表明少耕加留茬覆蓋增加了土壤微生物數(shù)量和真菌多樣性,但總體而言, 耕作對微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響依賴于所處環(huán)境。Degrune等[35]研究表明, 傳統(tǒng)耕作下的土壤多樣性高于少耕, 且作物殘茬對微生物多樣性沒有影響。Li等[18]也通過meta分析認(rèn)為真菌受干擾的影響較小, 免耕對細(xì)菌多樣性有顯著影響,但對真菌群落多樣性無顯著影響。本研究發(fā)現(xiàn), NTS處理土壤真菌豐富度和系統(tǒng)發(fā)育多樣性最高, SNTS處理土壤真菌多樣性最高。可能是因?yàn)槲锓N的多樣性是由豐富度和均勻度綜合評價(jià)的, 會因二者所占比重而不同[36]。雖然本研究中長期保護(hù)性耕作較傳統(tǒng)耕作相比土壤真菌的豐富度和多樣性增加, 但均未產(chǎn)生顯著影響。一方面可能是因?yàn)辄S土高原獨(dú)特的氣候和土壤條件, 而且本研究是建立在長期避免外源物質(zhì)輸入的基礎(chǔ)上, 土壤內(nèi)部環(huán)境可能已經(jīng)穩(wěn)定下來[37]; 另一方面可能是在整個(gè)耕作層的單一深度取樣(0～20 cm)會掩蓋土壤真菌群落多樣性的差異[38]。

4 結(jié)論

本研究采用高通量測序技術(shù), 對黃土高原旱地麥田多年不同耕作土壤真菌群落進(jìn)行研究, 發(fā)現(xiàn)長期保護(hù)性耕作顯著改變了土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及組成,提高了土壤真菌的豐富度和多樣性, 但不存在顯著差異。同時(shí)該地區(qū)多年的保護(hù)性耕作會加大小麥赤霉病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。因此, 在今后的土壤管理及保護(hù)性耕作推廣中, 為緩解土壤壓實(shí)及最小化病害, 應(yīng)研究合適的秸稈還田頻率、免耕與傳統(tǒng)耕作或深耕輪作[39]以及適度的淺耕。