路旭平, 李芳蘭, 馬曉娟, 景盼盼, 羅成科, 田 蕾, 李培富

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院/寧夏優(yōu)勢(shì)特色作物現(xiàn)代分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 銀川 750021)

土壤鹽堿化是限制土地利用率的一個(gè)全球性問(wèn)題, 我國(guó)鹽堿地總面積達(dá)9913萬(wàn)hm2, 約占全國(guó)土地面積的10%[1-2]。鹽堿土壤中主要致害鹽分包括NaCl、Na2SO4、Na2CO3和NaHCO3[3]。通常由中性鹽NaCl和Na2SO4引起的脅迫稱(chēng)為鹽脅迫, 由堿性鹽Na2CO3和NaHCO3引起的脅迫稱(chēng)為堿脅迫, 而混合鹽堿脅迫則是由中性鹽和堿性鹽同時(shí)引起的脅迫;危害程度大小依次是混合鹽堿脅迫、堿脅迫、鹽脅迫[4]。水稻(Oryza sativaL.)是重要的糧食作物之一,在我國(guó)約1/5的稻田受鹽堿脅迫侵害, 嚴(yán)重制約著水稻的正常生長(zhǎng)[5]。水稻處于多種環(huán)境因子脅迫時(shí),很難確定脅迫的關(guān)鍵因子, 因此有必要研究水稻應(yīng)答單一環(huán)境因子脅迫時(shí)的機(jī)理, 有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)水稻對(duì)逆境的響應(yīng)機(jī)制。

根系作為土壤-植株-大氣水循環(huán)過(guò)程中的關(guān)鍵一環(huán), 最先感知土壤環(huán)境的改變并遭受脅迫。堿脅迫不僅具有與鹽脅迫相同的滲透脅迫和離子毒害, 同時(shí)其較高和造成土壤pH升高, 使土壤中營(yíng)養(yǎng)元素固化, 嚴(yán)重干擾植物根系對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收,導(dǎo)致植物體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)失衡, 新陳代謝紊亂[6-7]。離子脅迫和滲透脅迫可破壞離子穩(wěn)態(tài), 減少根系對(duì)礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收, 造成細(xì)胞膜系統(tǒng)上酶活性降低, 膜結(jié)構(gòu)受損, 選擇通透性發(fā)生改變, 抑制N、P、K+、Ca2+和Mg2+等營(yíng)養(yǎng)元素的吸收, 并引起細(xì)胞內(nèi)Na+/K+、Cl-/NO3-、Na+/Ca2+動(dòng)態(tài)失衡, 破壞原有的離子平衡[8-9]。高pH會(huì)嚴(yán)重影響植物根系細(xì)胞內(nèi)的電荷平衡和pH內(nèi)穩(wěn)態(tài),阻礙根系對(duì)水和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收, 造成滲透脅迫, 誘導(dǎo)根系細(xì)胞產(chǎn)生活性氧, 破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性, 最終破壞根的結(jié)構(gòu)和功能, 抑制根發(fā)育[10]。Niu等[11]研究發(fā)現(xiàn)堿性脅迫下, 野生大豆(Glycine sojaSieb.et Zucc)根系維管柱發(fā)生了顯著變化, 由四原型變?yōu)槿?根部維管束數(shù)量減少, 根系直徑降低。郭瑞等[12]研究表明堿脅迫對(duì)小麥(Triticum aestivumL.)根系生長(zhǎng)的影響表現(xiàn)為低促高抑, 小麥根系在低濃度堿脅迫下仍能維持一定的生長(zhǎng), 但在高濃度堿脅迫下根系生長(zhǎng)受到抑制, 且根系中Na+含量劇增, 加上高pH危害, 導(dǎo)致根系生長(zhǎng)率降低。Zhang等[13]研究結(jié)果顯示鹽堿脅迫顯著降低了小麥生物量積累、葉綠素含量、光合能力和氮素吸收, 并且發(fā)現(xiàn)根系比葉片更能反映小麥的抗逆性。于天一等[14]研究發(fā)現(xiàn)堿脅迫下,隨土壤pH升高, 花生(Arachis hypogaeaL.)根系總根長(zhǎng)、根體積及根表面積均有不同程度的降低, 在高pH堿處理下葉面積下降、各器官干物質(zhì)重及根冠比顯著降低。Zhang等[15]研究表明堿脅迫顯著降低了水稻幼苗的成活率和根系生長(zhǎng), 且過(guò)氧化氫(H2O2)和超氧自由基大量積累, 導(dǎo)致根系細(xì)胞氧化損傷[15]; 并使得水稻老葉中Na+、有機(jī)酸和可溶性糖含量增加, 進(jìn)而加速老葉的衰老[16]; 同時(shí)堿脅迫導(dǎo)致水稻根系銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsAMT2和OsAMT3兩個(gè)家族的基因表達(dá)量增加, 脯氨酸和含量降低[17]。

長(zhǎng)期以來(lái), 前人針對(duì)水稻響應(yīng)鹽脅迫的生理機(jī)制進(jìn)行了廣泛的研究[18-19], 對(duì)堿脅迫的生理特性分析主要集中在地上部分[20-21], 有關(guān)堿脅迫對(duì)不同水稻品種根系生長(zhǎng)特征、生理特性和適應(yīng)策略的研究較少, 而研究水稻根系響應(yīng)堿脅迫的潛在機(jī)理能更好地揭示水稻耐堿性的本質(zhì)。因此, 本研究通過(guò)比較分析不同堿脅迫條件下供試水稻品種苗期的根系生長(zhǎng)特征、活性氧代謝、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累和抗氧化防御等生理指標(biāo), 進(jìn)一步明確耐堿性不同水稻品種根系在堿脅迫下的生長(zhǎng)和生理差異, 提出水稻根系對(duì)堿脅迫的適應(yīng)策略, 為闡明水稻耐堿生理機(jī)制,利用“以稻治堿”改土增糧提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用2個(gè)不同耐堿性的水稻品種為供試材料,即堿敏感品種‘中花11’(ZH11)和耐堿品種‘寧粳52’(NG52), 供試水稻種子由寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取大小一致、籽粒飽滿(mǎn)的水稻種子, 蒸餾水浸泡1 h, 75%的乙醇浸泡15 s, 15%的NaClO消毒30 min, 蒸餾水沖洗6次后用濾紙吸干水分。將消毒后的水稻種子置于育苗盤(pán)中(長(zhǎng)100 cm、寬50 cm、高10 cm, 共32孔, 每孔規(guī)格: 直徑10 cm、高10 cm),待幼苗生長(zhǎng)4 d后轉(zhuǎn)移到剪去管底的96孔PCR板上,每板48株, 將各材料置于長(zhǎng)×寬×高為21 cm×15 cm×5.2 cm水培盒并放置于人工氣候箱(HP1000GS)中培養(yǎng), 培養(yǎng)條件為 16 h/8 h(光照/黑暗), 溫度28 ℃/20 ℃(白天/夜間)。水稻移栽2 d后加入1/2國(guó)際水稻研究所(IRRI)標(biāo)準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)液, 5 d后加入全營(yíng)養(yǎng)液, 營(yíng)養(yǎng)液組成采用IRRI配方。幼苗生長(zhǎng)28 d后進(jìn)行堿脅迫處理。

根據(jù)堿化土壤中堿性成分的組成特點(diǎn), 試驗(yàn)設(shè)3個(gè)濃度梯度(10 mmol·L-1、20 mmol·L-1、30 mmol·L-1); 每個(gè)濃度梯度下, 將兩種堿按照NaHCO3∶Na2CO3分別為9∶1、1∶1、1∶9的摩爾比混合, 依次記為A、B、C處理; 共模擬出9種堿脅迫環(huán)境(表 1)。在每組堿濃度梯度下, 隨著NaHCO3比例的降低和Na2CO3比例的增大, 溶液的pH隨之增大, 分別為pH 8.65、pH 9.55和pH 10.50。為了便于描述和分析, 本試驗(yàn)用pH的變化代替混合堿比例的變化。處理液為700 mL含NaHCO3和Na2CO3的營(yíng)養(yǎng)液, 以單純營(yíng)養(yǎng)液(總堿濃度0 mmol·L-1)的處理為對(duì)照(CK), 每個(gè)處理3次重復(fù),每個(gè)重復(fù)48株。連續(xù)脅迫處理3 d后采集根系測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

表1 各處理堿組成和pHTable 1 Alkali composition and pH of each treatment

1.3 指標(biāo)及測(cè)定方法

1.3.1 根系生長(zhǎng)特征的測(cè)定

采用隨機(jī)抽樣的方法, 選取各處理每個(gè)重復(fù)中水稻10株, 用蒸餾水將根系沖洗干凈, 置于含有5～10 mm深蒸餾水的透明托盤(pán)內(nèi), 采用臺(tái)式掃描儀(EPSON Experssion 11000XL)對(duì)根系進(jìn)行掃描, 分辨率為800 dpi。采用WinRHIZO根系分析系統(tǒng)對(duì)根系圖像進(jìn)行分析。測(cè)定后的根系用于后續(xù)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3.2 根系活力和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的測(cè)定

根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法測(cè)定[22],以TTC還原量[μg·g-1·h-1(FW)]表示根系活力; 游離脯氨酸(Pro)含量采用酸性茚三酮比色法測(cè)定[22]; 采用苯酚法測(cè)定可溶性糖含量(SS)[22]; 可溶性蛋白含量(SP)采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[22]。

1.3.3 脂質(zhì)過(guò)氧化檢測(cè)和活性氧含量的測(cè)定

通過(guò)丙二醛(MDA)含量和脂氧合酶(LOX)活性反映細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化程度。MDA含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定[15]; LOX活性的測(cè)定參考Huang等[23]的方法, 超氧陰離子()產(chǎn)生速率采用對(duì)氨基苯磺酸法測(cè)定[15], H2O2含量采用碘化鉀法測(cè)定[15]。

1.3.4 抗氧化酶活性的測(cè)定

粗酶液的制備參考Niu等[24]的方法。超氧化物歧化酶(SOD)采用氮藍(lán)四唑顯色法測(cè)定[24], 過(guò)氧化氫酶(CAT)活性采用紫外比色法測(cè)定[24], 過(guò)氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[25]。

1.3.5 非酶類(lèi)抗氧化劑含量的測(cè)定

還原型抗壞血酸(ASA)和還原型谷胱甘肽(GSH)測(cè)定參照Wang等[25]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Microsoft Excel 2010軟件整理數(shù)據(jù), SPSS 24.0軟件對(duì)同一材料不同處理進(jìn)行單因素方差(ANOVA)統(tǒng)計(jì)分析, 對(duì)同一處理不同材料進(jìn)行t檢驗(yàn), 因?yàn)樵贜a2CO3單獨(dú)處理液中水稻僅存活1 d,所以未進(jìn)行NaHCO3和Na2CO3單因素效應(yīng)和二因素互作效應(yīng)分析。差異顯著性定義為P＜0.05, 用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示3次重復(fù)測(cè)定結(jié)果, 采用GraphPad Prism 8作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿脅迫對(duì)水稻根系生長(zhǎng)的影響

隨著脅迫程度的增加, 兩種水稻的根系總長(zhǎng)度呈下降趨勢(shì)(圖1A); ZH11和NG52的根系總長(zhǎng)度在10B處理下開(kāi)始顯著降低, 至30C處理下降到最低值, 分別比CK下降47.73%和45.07% (P＜0.05)。在同一堿濃度處理下從A到C, ZH11和NG52的根系總長(zhǎng)度逐漸降低, 10C處理較10A處理分別降低16.07%和11.86% (P＜0.05), 20C處理較20A處理分別降低27.53%和13.48% (P＜0.05), 30C處理較30A處理分別降低11.31%和21.85% (P＜0.05)。另外, 各處理均表現(xiàn)為ZH11的根系總長(zhǎng)度顯著大于NG52 (P＜0.05),但是ZH11根系總長(zhǎng)度的降幅(11.49%～47.73%)大于NG52的降幅(4.74%～45.07%)。

ZH11和NG52的根系總表面積隨著堿脅迫程度的增加而呈降低趨勢(shì)(圖1B), ZH11的根系總表面積在10A處理時(shí)開(kāi)始顯著降低, 在30C處理時(shí)降到最低值, 降幅為55.58%; 而NG52的根系總表面積在20A處理時(shí)開(kāi)始顯著降低, 在30C處理時(shí)降到最低值, 降幅為38.49%。在相同堿濃度處理下從A到C,ZH11和NG52根系總表面積僅在堿濃度為30 mmol·L-1時(shí)顯著降低(P＜0.05), 30C處理較30A處理分別降低16.74%和18.29%。ZH11的根系總表面積在各處理下均顯著高于NG52 (P＜0.05), ZH11根系總表面積的降幅(27.42%～55.58%)大于NG52的降幅(4.33%～38.49%)。

在各脅迫處理下, ZH11的根系平均直徑較CK均顯著降低(圖1C), 在20C處理時(shí)降至最低值, 比CK下降31.77%; 而NG52的根系平均直徑在10B處理下開(kāi)始顯著降低, 在30C處理時(shí)降至最低值,較CK下降28.95%。在同一堿濃度處理下從A到C, NG52根系平均直徑僅在堿濃度為30 mmol·L-1時(shí)顯著降低(P＜0.05), 30C處理較 30A處理降低17.60%。ZH11和NG52根系平均直徑在CK、30A和30C處理下差異不顯著, 其他處理下NG52根系平均直徑顯著高于ZH11 (P＜0.05)。整體而言, ZH11根系平均直徑的降幅(14.07%～31.77%)大于NG52的降幅(5.79%～28.95%)。

隨著脅迫程度的增加, ZH11和NG52的根體積較CK均顯著降低(圖1D), 且在30C處理時(shí)降至最低, 降幅分別為63.41%和54.05%。在同一堿濃度處理下從A到C, NG52的根體積在堿濃度為10 mmol·L-1、30 mmol·L-1時(shí)顯著降低(P＜0.05), 10C較10A降幅為13.64%, 30C較30A降幅為17.74%;而ZH11在堿濃度為10 mmol·L-1、30 mmol·L-1時(shí)從A到C呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(P＞0.05), 但在堿濃度為20 mmol·L-1時(shí)呈現(xiàn)升高趨勢(shì)(P＞0.05)。ZH11的根體積在CK、10B和20C處理下顯著高于NG52 (P＜0.05),在其他處理下兩個(gè)品種間差異不顯著, 但ZH11根體積的降幅(38.92%～63.41%)大于NG52的降幅(20.72%～54.05%)。

2.2 堿脅迫對(duì)水稻根系活力和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

ZH11和NG52的根系活力在10A處理時(shí)分別較CK增加4.14%和9.19% (P＜0.05) (圖2A); 其他處理下較CK均有不同程度的降低, 其中在30C處理時(shí)降至最低點(diǎn), 與CK相比降幅分別為40.89%和21.89% (P＜0.05)。在同一堿濃度處理下從A到C,ZH11和NG52的根系活力呈顯著降低的趨勢(shì); 10C較10A處理分別降低8.18%和10.02% (P＜0.05), 20C較20A處理分別降低28.04%和12.27% (P＜0.05), 30C較30A處理分別降低31.37%和10.98% (P＜0.05)。另外,各處理均表現(xiàn)為NG52的根系活力顯著大于ZH11(P＜0.05), 并且ZH11根系活力的降幅(0.73%～40.89%)大于NG52的降幅(1.75%～21.89%)。

隨著脅迫程度的增加, ZH11和NG52的根系游離脯氨酸(Pro)含量較CK均不同程度地顯著增加(圖2B), ZH11根系Pro含量在30B處理時(shí)增幅最大, 較CK增加852.17% (P＜0.05); NG52在30C處理時(shí)增幅最大, 較CK增加1461.54% (P＜0.05)。在堿濃度為10 mmol·L-1、20 mmol·L-1時(shí), ZH11和NG52的根系Pro含量從A到C顯著升高, 其中, 10C較10A處理分別升高132.31%和125.49% (P＜0.05), 20C較20A處理分別升高213.56%和50.49% (P＜0.05); 堿濃度30 mmol·L-1時(shí), ZH11的根系Pro含量從A到C呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì), 最高點(diǎn)出現(xiàn)在30B處理, 較30A處理增加67.18% (P＜0.05), 而NG52的根系Pro含量呈現(xiàn)增加的趨勢(shì), 且最大值出現(xiàn)在30C, 增幅為50.37% (P＜0.05)。ZH11和NG52根系Pro含量在CK、10A和30A處理時(shí)差異不顯著, 但20A、20B、30C處理下NG52根系Pro含量顯著高于ZH11 (P＜0.05), 且NG52根系Pro含量的增幅(292.31%～1461.54%)大于ZH11的增幅(156.52%～852.17%)。

ZH11和NG52的根系可溶性糖(SS)含量隨脅迫程度的增加呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)(圖2C), ZH11在30B處理升高至最大, 較CK增加77.77% (P＜0.05); NG52在30C處理時(shí)達(dá)最大值, 較CK增加228.01%(P＜0.05)。在堿濃度為10 mmol·L-1、20 mmol·L-1時(shí),從A到C, ZH11和NG52的根系SS含量呈現(xiàn)增加趨勢(shì); 10C較10A處理分別升高22.38%和18.29%(P＜0.05), 20C較20A處理分別升高15.76%和6.34%(P＜0.05)。堿濃度30 mmol·L-1時(shí), ZH11的根系SS含量從A到C呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì), 最高點(diǎn)出現(xiàn)在30B處理, 并顯著高于處理30C (P＜0.05); 而NG52的根系SS含量呈現(xiàn)增加的趨勢(shì), 且最大值出現(xiàn)在30C, 增幅為6.44% (P＜0.05)。各處理下, ZH11的根系SS含量顯著大于NG52 (P＜0.05), 但是ZH11根系SS含量的增幅(28.84%～77.77%)小于NG52的增幅(115.70%～228.01%)。

隨著脅迫程度的增加, ZH11和NG52的根系可溶性蛋白(SP)含量較CK均有顯著增加(圖2D), ZH11在處理20C和30C時(shí)增幅最大, 分別為140.18%和141.82% (P＜0.05); 而NG52在30C處理時(shí)達(dá)最大值,較CK增加799.32% (P＜0.05)。在同一堿濃度處理下從A到C, ZH11和NG52的根系SP含量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì); 其中, 堿濃度10 mmol·L-1時(shí), 10C較10A處理分別增加14.76%和110.23% (P＜0.05); 堿濃度20 mmol·L-1時(shí), 20C較20A處理分別升高19.73%和15.94% (P＜0.05); 堿濃度30 mmol·L-1時(shí), 30C較30A處理分別增加18.60%和10.19% (P＜0.05)。CK、10 mmol·L-1、20 mmol·L-1處理下ZH11的根系SP含量顯著大于NG52 (P＜0.05), 但30 mmol·L-1處理下ZH11和NG52的根系SP含量差異不顯著, NG52根系SP含量的增幅(172.65%～799.32%)大于ZH11的增幅(67.61%～141.82%)。

2.3 堿脅迫對(duì)水稻根系脂質(zhì)過(guò)氧化和活性氧含量的影響

隨著脅迫程度的增加, ZH11根系丙二醛(MDA)含量較CK均顯著增加(圖3A), 在處理30B和30C時(shí)增幅最大, 分別為95.31%和105.26%(P＜0.05); 而NG52的根系MDA含量在10C處理時(shí)開(kāi)始呈顯著增加的趨勢(shì), 在30C處理時(shí)達(dá)最大值, 較CK增加63.65% (P＜0.05)。在相同堿濃度處理下從A到C,ZH11和NG52的根系MDA含量均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì);其中, 堿濃度10 mmol·L-1時(shí), 10C較10A處理分別增加8.97% (P＞0.05)和13.74% (P＜0.05); 堿濃度20 mmol·L-1時(shí), 20C較20A處理分別升高25.13%和14.12% (P＜0.05); 堿濃度30 mmol·L-1時(shí), 30C較30A處理分別增加20.41%和10.14% (P＜0.05)。在CK、20A和30A處理下ZH11和NG52的根系MDA含量差異不顯著, 但其他處理下ZH11顯著大于NG52 (P＜0.05),ZH11根系MDA含量的增幅(49.04%～105.26%)大于NG52的增幅(5.46%～63.65%)。

供試水稻的根系脂氧合酶(LOX)活性隨著脅迫程度的增加呈上升趨勢(shì)(圖3B), 且ZH11和NG52的根系LOX活性在30C處理達(dá)最大值, 增幅分別為578.95%和400.00% (P＜0.05)。在同一堿濃度處理下從A到C, ZH11和NG52的根系LOX活性均呈上升趨勢(shì); 其中10C較10A處理分別增加107.79%和123.91% (P＜0.05), 20C較20A處理分別升高23.63%和27.03% (P＜0.05), 30C較30A處理分別增加24.64%和19.57% (P＜0.05)。在CK和10A處理下, ZH11和NG52的根系LOX活性差異不顯著, 但隨著脅迫程度增加, ZH11的根系LOX活性顯著大于NG52 (P＜0.05),其中20C、30B和30C差異極顯著(P＜0.01), ZH11根系LOX活性的增幅(102.63%～578.95%)大于NG52的增幅(39.39%～400.00%)。

隨著脅迫程度的增加, ZH11和NG52的根系過(guò)氧化氫(H2O2)含量呈升高趨勢(shì)(圖3D), 且最大值均出現(xiàn)在30C處理, 增幅分別為396.14%和190.66%(P＜0.05)。在同一堿濃度處理下, 從A到C ZH11和NG52的根系H2O2含量均呈上升趨勢(shì); 其中10C較10A處理分別增加46.51%和27.71% (P＜0.05), 20C較20A處理分別升高56.34%和27.25% (P＜0.05), 30C較30A處理分別增加45.26%和23.06% (P＜0.05)。ZH11和NG52的根系H2O2含量在20B處理下差異顯著(P＜0.05), 在20C、30B和30C處理下差異極顯著(P＜0.01), 在其他處理下兩個(gè)品種之間無(wú)顯著差異,ZH11根系H2O2含量的增幅(86.96%～396.14%)大于NG52的增幅(54.47%～190.66%)。

2.4 堿脅迫對(duì)水稻根系抗氧化酶活性的影響

隨著脅迫程度的增加, 供試水稻的根系SOD活性較CK均有顯著增加(圖4A), 其中ZH11在20C處理增幅最大, 為142.72% (P＜0.05); NG52根系SOD活性最大值出現(xiàn)在30C處理, 較CK增加240.53%(P＜0.05)。在相同堿濃度處理下, 從A到C ZH11和NG52根系SOD活性均呈現(xiàn)上升趨勢(shì); 其中, 10C較10A處理分別增加20.39%和56.55% (P＜0.05), 20C較20A處理分別升高34.56%和55.16% (P＜0.05), 30C較30A處理分別增加21.72%和39.60% (P＜0.05)。在CK、10A、10B和10C處理下ZH11的根系SOD活性顯著高于NG52 (P＜0.05), 但20C、30A、30B和30C處理下NG52根系SOD活性顯著大于ZH11 (P＜0.05), 其中20C和30C處理下達(dá)極顯著水平(P＜0.01)?？傮w而言, NG52根系SOD活性的增幅(27.27%～24.53%)大于ZH11的增幅(61.71%～142.72%)。

ZH11和NG52的根系POD活性除10A和10B外, 在其他處理?xiàng)l件下均高于CK (圖4B)。ZH11在20A處理最高, 較CK增加26.54% (P＜0.05); 而NG52在30B處理時(shí)增幅最大, 為42.50% (P＜0.05)。在10 mmol·L-1和20 mmol·L-1堿濃度處理下從A到C, NG52的根系POD活性呈上升趨勢(shì), 10C較10A處理增加16.43% (P＜0.05), 20C較20A處理升高3.83% (P＞0.05), 30 mmol·L-1堿濃度處理下, 30B SOD活性最高, 較30A處理增加3.72% (P＞0.05)。而ZH11僅在堿濃度為10 mmol·L-1時(shí)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì), 在堿濃度為20 mmol·L-1、30 mmol·L-1時(shí)呈下降的趨勢(shì); 10C較10A處理增加12.78% (P＜0.05), 20C較20A處理降低8.44% (P＜0.05); 30B較30A處理降低13.93% (P＜0.05)。從CK到20B處理ZH11和NG52的根系POD活性差異不顯著, 但20C、30A、30B和30C處理下NG52根系POD活性顯著大于ZH11(P＜0.05), 其中20C和30B處理下差異達(dá)極顯著水平(P＜0.01)。NG52根系POD活性的增幅(5.27%～42.50%)大于ZH11的增幅(2.59%～26.54%)。

隨著脅迫程度的增加, ZH11和NG52的根系CAT活性較CK均顯著增加(圖4C), ZH11在20A處理時(shí)增幅最大, 較CK增加345.45% (P＜0.05); 而NG52在30B和30C處理時(shí)增幅最大, 分別為400.00%和430.00% (P＜0.05)。在同一堿濃度處理下從A到C,ZH11的根系CAT活性具有與根系POD活性相同的趨勢(shì), 均在20A處理最高, 10C處理較10A處理增加61.90% (P＜0.05), 20C較20A處理降低26.53%(P＜0.05), 30B較30A處理降低42.86% (P＜0.05); NG52的根系CAT活性在堿濃度為10 mmol·L-1、30 mmol·L-1時(shí)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì), 10C較10A處理增加37.50%(P＜0.05), 30B較30A處理增加11.11%, 30C較30A處理增加17.78% (P＜0.05)。20B處理下ZH11的根系CAT活性顯著高于NG52 (P＜0.05), 但30B和30C處理下NG52根系CAT活性極顯著大于ZH11 (P＜0.01), 其他處理下兩個(gè)品種間差異不顯著。NG52根系CAT活性的 增 幅(140.00%～430.00%)大 于 ZH11的增幅(90.90%～345.45%)。

2.5 堿脅迫對(duì)水稻根系還原型抗壞血酸(ASA)和還原型谷胱甘肽(GSH)含量的影響

供試水稻的根系還原型抗壞血酸(ASA)含量隨著脅迫程度的增加呈上升趨勢(shì)(圖5A), 其中ZH11最大值出現(xiàn)30B處理, 較CK增加690.48% (P＜0.05);NG52在30C時(shí)增幅最大, 為1795.46% (P＜0.05)。在同一堿濃度處理下從A到C, ZH11和NG52的根系A(chǔ)SA含量呈上升趨勢(shì); 其中10C較10A處理分別增加102.94%和32.79% (P＜0.05), 20C較20A處理分別升高84.30%和65.99% (P＜0.05); NG52的根系A(chǔ)SA含量30C較30A處理增加12.05% (P＜0.05)。20A、30B和30C處理下NG52根系A(chǔ)SA含量顯著大于ZH11 (P＜0.05), 10C處理下NG25顯著小于ZH11(P＜0.05), 其他處理下兩個(gè)品種間差異不顯著。NG52根系A(chǔ)SA含量的增幅(454.55%～1795.46%)大于ZH11的增幅(142.86%～690.48%)。

ZH11和NG52的根系還原型谷胱甘肽(GSH)含量隨著脅迫程度的增加而呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)(圖5B),ZH11最大值出現(xiàn)在20C處理, 較CK增加153.42%(P＜0.05); NG52在30C時(shí)增幅最大, 為184.93%(P＜0.05)。在相同堿濃度下從A到C, ZH11和NG52根系GSH含量均呈上升趨勢(shì), 10C較10A處理分別增加46.99%和68.21% (P＜0.05), 20C較20A處理分別升高26.50%和21.07% (P＜0.05); ZH11的根系GSH含量在堿濃度為30 mmol·L-1時(shí)從A到C處理之間差異不顯著, 而NG52的根系GSH含量30C較30A處理增加7.35% (P＜0.05)。20A、20B、30A、30B和30C處理下NG52根系GSH含量顯著大于ZH11 (P＜0.05), 其中30A和30C處理下達(dá)極顯著水平(P＜0.01), 其他處理下兩品種間差異不顯著。NG52根系GSH含量的增幅 (29.28%～184.93%)大于ZH11的增幅(46.50%～153.42%)。

2.6 不同水稻品種根系生長(zhǎng)及生理指標(biāo)與脅迫因子的相關(guān)性分析

對(duì)根系生長(zhǎng)和抗逆生理指標(biāo)與脅迫因子(Na+和pH)進(jìn)行冗余(RDA)分析。結(jié)果表明, ZH11第1、2排序軸特征值分別為0.6919和0.0520, 第1、2排序軸解釋率分別為69.19%和74.39% (圖6A); NG52第1、2排序軸特征值分別為0.085 25和0.0208, 第1、2排序軸解釋率分別為85.25%和87.32% (圖6B), 具有生物統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中, ZH11和NG52的根系總長(zhǎng)度、根系總表面積、根系平均直徑、根體積、根系活力與脅迫因子呈負(fù)相關(guān), 且Na+抑制作用大于pH; 脅迫因子與Pro、SS、SP、MDA、LOX、H2O2、SOD、POD、CAT、ASA、GSH呈正相關(guān)。

2.7 不同水稻品種根系生長(zhǎng)及抗逆生理指標(biāo)與脅迫程度的逐步回歸分析

綜合分析水稻根系響應(yīng)堿脅迫的生長(zhǎng)和生理指標(biāo)變化, 將堿脅迫程度劃分為3種類(lèi)型(輕度脅迫、中度脅迫和重度脅迫)。以影響供試水稻品種耐堿性較為顯著的根系生長(zhǎng)和生理指標(biāo)為自變量, 不同脅迫程度為因變量進(jìn)行逐步回歸分析, 結(jié)果如表2所示, 輕度脅迫下, ASA是影響ZH11耐堿性較顯著的指標(biāo)(R2=0.963), Pro、根系平均直徑和POD是影響NG52耐堿性較顯著的指標(biāo)(R2=0.995)。中度脅迫下,SS是影響ZH11耐堿性較顯著的指標(biāo)(R2=0.922), 根系平均直徑、SOD、根系總表面積、SS和根系活力是影響NG52耐堿性較顯著的指標(biāo)(R2=1.000)。重度脅迫下, H2O2和ASA是影響ZH11耐堿性較顯著的指標(biāo)(R2=0.925), GSH、H2O2和根系活力是影響NG52耐堿性較顯著的指標(biāo)(R2=0.995)。

表2 不同耐堿性水稻品種生長(zhǎng)及生理指標(biāo)與脅迫程度的逐步回歸分析Table 2 Stepwise regression analysis of growth and physiological indexes of different rice varieties with degree of alkali stress

3 討論

3.1 堿脅迫對(duì)水稻根系生長(zhǎng)特性的影響

根系是連接植株地上部分和土壤的唯一樞紐,根的發(fā)育與植株對(duì)鹽堿脅迫的耐受性密切相關(guān)。根系逆境信號(hào)感受器感受到脅迫信號(hào)后, 通過(guò)信號(hào)分子的轉(zhuǎn)導(dǎo), 調(diào)控逆境相關(guān)基因的表達(dá), 進(jìn)而調(diào)節(jié)自身生理狀態(tài)和代謝產(chǎn)物在不同器官中的分配, 最終影響根系總長(zhǎng)、根表面積、根直徑、根體積和根系活力等根系形態(tài)結(jié)構(gòu)[26-27]。于天一等[14]研究發(fā)現(xiàn)兩種不同類(lèi)型的花生品種總根長(zhǎng)、根體積及根表面積隨著pH的升高而降低。Abbas等[28]研究表明‘Janz’(耐鹽小麥品種)和‘Jandaroi’(鹽敏感小麥品種)在鹽脅迫下根系長(zhǎng)度和根總數(shù)均顯著降低, 且‘Jandaroi’下降幅度大于‘Janz’。劉建新等[29]研究發(fā)現(xiàn)堿脅迫下黑麥草(Lolium perenneL.)根長(zhǎng)、根表面積和根體積隨堿濃度升高下降幅度增大, 但根直徑隨堿濃度的增加而升高。本研究結(jié)果表明, 隨著堿脅迫程度的增加, 堿敏感水稻品種ZH11根系總長(zhǎng)度、根系總表面積、根系平均直徑和根體積均顯著降低,而耐堿品種NG52的根系總長(zhǎng)度、根系平均直徑和根系總表面積在低堿濃度和低pH處理下均未發(fā)生顯著變化, 說(shuō)明維持根系總長(zhǎng)度和表面積是水稻適應(yīng)低堿脅迫的一種重要的根系分子機(jī)制, 這與Zhang等[15]研究得出的結(jié)果類(lèi)似。ZH11和NG52在10A處理下根系活力顯著增加, ZH11在10B處理下與CK差異不顯著, NG52在10B和10C處理下與CK差異不顯著, 說(shuō)明在低堿濃度低pH條件下堿脅迫可能會(huì)通過(guò)提高水稻根系活力, 來(lái)彌補(bǔ)根體積減少帶來(lái)的損傷, 從而維持根系形態(tài)特征的穩(wěn)定, Lü等[30]的研究得出了相似的結(jié)論。在高堿脅迫下,ZH11和NG52的根系總長(zhǎng)度、根系總表面積、根系平均直徑、根體積和根系活力均顯著降低, 且ZH11降幅大于NG52, 說(shuō)明NG52耐堿的重要原因可能是通過(guò)增加根系活力, 維持根系總長(zhǎng)度、根系總表面積和根系平均直徑的穩(wěn)定來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

3.2 堿脅迫對(duì)水稻根系生理特性的影響

植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中, 逐漸進(jìn)化出一套精密的生理機(jī)制來(lái)抵御逆境脅迫[31]。植物對(duì)鹽脅迫響應(yīng)機(jī)制主要包括滲透調(diào)節(jié)、離子平衡調(diào)節(jié)、抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)的合成與積累及活性氧清除等。植物根系代謝調(diào)控在植物抗逆過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,根作為應(yīng)對(duì)鹽堿脅迫的第一道屏障, 積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)是緩解鹽堿脅迫的主要途徑[5,20], 脯氨酸(Pro)、可溶性蛋白質(zhì)(SP)和可溶性糖(SS)等作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)中的有機(jī)溶質(zhì), 可保護(hù)大分子結(jié)構(gòu)免受非生物脅迫引起的損害, 并在植物氧化還原過(guò)程中起關(guān)鍵作用[32]。Ye等[33]研究結(jié)果顯示狗牙根(Cynodon dactylonPers.)中度和重度堿脅迫處理后Pro、SS和蔗糖含量顯著增加, 但是輕度堿脅迫對(duì)Pro、SS和蔗糖含量沒(méi)有顯著影響。Sun等[34]研究表明鹽堿(NaCl、Na2SO4、NaHCO3)混合脅迫下, 高粱(Sorghum bicolorL.) Pro含量隨著鹽堿濃度的增加而增加, SP含量隨著鹽堿濃度的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)。Hu等[35]研究發(fā)現(xiàn)NaCl和Na2CO3脅迫下兩個(gè)大麻(Cannabis sativaL.)品種的Pro含量均顯著高于對(duì)照組, 且在200 mmol·L-1時(shí)Na2CO3脅迫下Pro含量大于NaCl。本研究發(fā)現(xiàn), 堿脅迫下供試水稻根系Pro、SS和SP含量均顯著增加, 說(shuō)明水稻根系通過(guò)積累有機(jī)溶質(zhì), 以維持原生質(zhì)與外界環(huán)境滲透平衡, 進(jìn)而保證細(xì)胞生理代謝活動(dòng)的正常進(jìn)行[36]。在重度脅迫下, ZH11根系Pro和SS含量有降低趨勢(shì); 而NG52根系Pro和SS含量則逐步增加, 且增幅顯著大于ZH11, 說(shuō)明重度堿脅迫對(duì)堿敏感品種Pro和SS的合成有抑制作用。在CK處理中ZH11和NG52根系Pro含量差異不顯著, 而在20A和30C處理中NG52根系Pro含量顯著大于ZH11; 在CK處理下根系SP含量ZH11極顯著大于NG52, 但重度脅迫下(30A、30B、30C)兩者差異不顯著; 各處理中ZH11根系SS含量均大于NG52, 增幅卻小于NG52。以上結(jié)果表明, 不同水稻品種的滲透調(diào)節(jié)能力因品種而異,耐堿品種NG52能夠積累更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì), 以抵御堿脅迫引起的滲透脅迫, 說(shuō)明較強(qiáng)的滲透調(diào)節(jié)能力是水稻根系適應(yīng)堿脅迫的一種重要的生理機(jī)制。

植物正常條件下產(chǎn)生的活性氧(ROS)是重要的信號(hào)分子, 參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫應(yīng)答和部分生理過(guò)程[37]; 然而, 在脅迫下, 植物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生包括過(guò)氧化氫(H2O2)、羥基自由基(OH-)、超氧自由基(O2·-)和單線(xiàn)性氧(1O2)在內(nèi)的ROS, 并對(duì)不同細(xì)胞組分如核酸、蛋白質(zhì)、膜質(zhì)和糖類(lèi)等均造成氧化損傷[33]。脂氧合酶(LOX)催化膜上多聚不飽和脂肪酸(PUFAs)的氧化反應(yīng), 導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化, 丙二醛(MDA)是PUFAs過(guò)氧化的產(chǎn)物[38]。因此, MDA含量和LOX活性反映了細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的程度。劉建新等[39]研究結(jié)果顯示, 隨著NaHCO3濃度增大, 燕麥(Avena sativaL.)葉片產(chǎn)生速率、H2O2和MDA含量明顯增大。郭慧娟等[40]研究顯示, 多年生黑麥草中MDA含量隨pH的升高而增加。本研究結(jié)果表明,供試材料根系MDA含量、LOX活性、產(chǎn)生速率和H2O2含量隨著脅迫程度的增加而升高; 其中,ZH11增加幅度大于NG52, 說(shuō)明耐堿性水稻品種NG52通過(guò)降低細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化和產(chǎn)生更少的ROS來(lái)提高植株的耐堿性, 這與Kumar等[41]的研究結(jié)果一致。此外, ZH11和NG52根系LOX活性和H2O2含量在CK時(shí)差異不顯著, 但隨著脅迫程度增加, 差異逐漸增大, 在30C處理時(shí)NG52與ZH11間差異達(dá)極顯著水平, 說(shuō)明較高堿性環(huán)境對(duì)NG52根系膜系統(tǒng)的受傷害較小, 反映出NG52較好的耐堿性。

為了保持有機(jī)體ROS的穩(wěn)態(tài), 植物已經(jīng)進(jìn)化出酶促和非酶促抗氧化系統(tǒng), 以保護(hù)自己免受氧化損傷和保持較低水平ROS信號(hào)。酶促抗氧化系統(tǒng)主要有SOD、CAT、POD、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽還原酶(GR)等[42]; 非酶抗氧化系統(tǒng)包括ASA、GSH、類(lèi)胡蘿卜素(Car)等, 對(duì)于植物體內(nèi)ROS穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[43]。Jia等[44]研究鹽、堿和鹽堿混合脅迫對(duì)海棠(Malus pumilaMill.)的影響發(fā)現(xiàn), 鹽脅迫和鹽堿脅迫下SOD和POD的活性顯著增加, 而堿脅迫下SOD和POD的活性降低。Qin等[45]研究表明堿和鹽處理增加了燕麥SOD和POD的活性以及MDA含量, 但降低了CAT的活性。Chen等[46]研究結(jié)果顯示川蔓藻(Ruppia maritimaL.)幼苗SOD、POD、CAT活性在較低的鹽堿濃度下呈增加趨勢(shì), 但在較高濃度下呈降低趨勢(shì)。本研究結(jié)果表明供試水稻根系抗氧化酶的活性因品種和脅迫程度不同而異。堿脅迫顯著增加了供試水稻根系SOD、POD和CAT活性以及ASA和GSH含量; ZH11根系SOD活性、CAT活性和POD活性均呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì), 而NG52根系SOD、POD和CAT活性不斷增加。在同一堿濃度不同pH處理下, ZH11和NG52根系A(chǔ)SA含量、GSH含量和SOD活性均不斷升高; ZH11根系CAT活性和POD活性在堿濃度為10 mmol·L-1時(shí)隨pH升高而升高,但在20 mmol·L-1和30 mmol·L-1時(shí)隨pH升高而降低, 而NG52則保持較高的活性。以上結(jié)果表明, 在中度和重度脅迫下, ZH11根系抗氧化系統(tǒng)清除體內(nèi)多余活性氧的能力減弱, 而根系內(nèi)O2·-產(chǎn)生速率和H2O2含量隨著脅迫程度的增加而升高, 導(dǎo)致ROS的動(dòng)態(tài)平衡被破壞, 膜質(zhì)過(guò)氧化程度增加, 進(jìn)而影響ZH11的耐堿性, 這與前人的研究結(jié)論相似[44,47]; 而NG52仍能維持較高的抗氧化酶活性和較低增幅的ROS含量。整個(gè)脅迫期間, NG52的根系抗氧化酶活性(SOD、POD和CAT)和抗氧化劑(ASA和GSH)含量增幅均大于ZH11, 說(shuō)明耐堿性水稻NG52具有較強(qiáng)酶促和非酶促抗氧化系統(tǒng), 能夠有效控制機(jī)體內(nèi)活性氧水平。

3.3 各脅迫因子對(duì)不同水稻品種的影響及水稻應(yīng)答堿脅迫的階段性響應(yīng)策略

堿脅迫對(duì)植物的危害之所以大于鹽脅迫, 是因?yàn)槠漭^高的pH導(dǎo)致根系周?chē)鸂I(yíng)養(yǎng)元素固化、破壞跨膜電位、抑制了大多數(shù)離子的吸收, 從而改變養(yǎng)分的利用率, 并破壞離子平衡, 導(dǎo)致根系生長(zhǎng)異常[48]。Zhang等[49]認(rèn)為在鹽漬化土壤中種植桑樹(shù)(Morus albaL.)應(yīng)該考慮總的鹽堿含量以及高pH對(duì)桑樹(shù)生長(zhǎng)的影響。本試驗(yàn)采用冗余分析(RDA)研究脅迫因子(Na+和pH)與水稻各生長(zhǎng)及生理指標(biāo)間的相關(guān)性,得出Na+和pH與水稻各生長(zhǎng)指標(biāo)呈負(fù)相關(guān), 與生理指標(biāo)呈正相關(guān), 說(shuō)明Na+和pH均影響水稻根系生長(zhǎng)特征和生理特性。分析各生長(zhǎng)指標(biāo)、脂質(zhì)過(guò)氧化和活性氧含量發(fā)現(xiàn), 在ZH11中, 20C (堿濃度為20 mmol·L-1, pH 10.50)處理時(shí)根系平均直徑和根系活力低于30A (堿濃度為30 mmol·L-1, pH8.65)處理,MDA含量、LOX活性、產(chǎn)生速率和H2O2含量顯著高于30A處理。10C和20A相比, 也存在類(lèi)似的情況。以上結(jié)果可能是高pH和Na+協(xié)同作用的結(jié)果[50-51], 說(shuō)明在一定程度的堿脅迫下, 高pH是影響植物生長(zhǎng)的主要因素。

安玉艷等[52]和張翠梅等[26]提出植物因脅迫時(shí)間和脅迫程度會(huì)出現(xiàn)階段性響應(yīng)特點(diǎn), 認(rèn)為不同階段中植物抗逆機(jī)制的核心任務(wù)不同。本研究發(fā)現(xiàn), 在輕度脅迫下(10A、10B和10C), 堿敏感水稻品種ZH11通過(guò)啟動(dòng)非酶促系統(tǒng)中的關(guān)鍵指標(biāo)(ASA)來(lái)適應(yīng)輕度堿脅迫; 而耐堿性品種NG52則通過(guò)維持根系平均直徑、增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(Pro)和抗氧化酶活性(POD)提高耐堿性。在中度脅迫下(20A、20B和30A), ZH11主要通過(guò)增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(SS)抵御堿脅迫; 而NG52主要通過(guò)改變根系生長(zhǎng)特性(根系平均直徑、根系總表面積和根系活力)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(SS)和抗氧化酶活性(SOD)來(lái)適應(yīng)堿脅迫。在重度脅迫下(20C、30B和30C), ZH11通過(guò)增加H2O2和ASA含量來(lái)響應(yīng)堿脅迫, NG52通過(guò)改變H2O2、GSH和根系活力來(lái)響應(yīng)堿脅迫。說(shuō)明活性氧(H2O2)是影響重度脅迫下水稻生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素, 而抗氧化劑(ASA和GSH)則是抵御脅迫傷害的關(guān)鍵指標(biāo)。以上試驗(yàn)結(jié)果表明, 不同程度堿脅迫下, 水稻耐堿策略的著重點(diǎn)不同, 兩種水稻品種在不同脅迫程度下會(huì)啟動(dòng)不同的防御機(jī)制以響應(yīng)堿脅迫, 這些不同防御機(jī)制的啟動(dòng)可能是由于品種本身遺傳背景差異造成的。

4 結(jié)論

本研究中, 堿濃度和pH脅迫均影響了供試水稻根系生長(zhǎng)特征及生理特性, 因此在鹽堿地種植水稻不僅要考慮鹽堿濃度, 同時(shí)還應(yīng)關(guān)注不同堿分組成引起的pH變化對(duì)水稻的影響。不同堿敏感水稻品種在形態(tài)特征和生理特性上抵御不同程度的堿脅迫時(shí)存在不同的防御策略。在輕度和中度脅迫下, 堿敏感水稻品種‘中花11’通過(guò)增加抗氧化劑(ASA)含量和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(SS)來(lái)適應(yīng)堿脅迫; 耐堿性水稻品種‘寧粳52’主要通過(guò)改變根系生長(zhǎng)特征(根系平均直徑、根系總表面積和根系活力)、增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(SS)和啟動(dòng)抗氧化酶防御系統(tǒng)來(lái)抵御堿脅迫。在重度脅迫下, ‘中花11’和‘寧粳52’均通過(guò)降低活性氧(H2O2)和提高抗氧化劑含量來(lái)響應(yīng)堿脅迫。