郭飛馬 3李 明 3王小雪 3李 飛

(1.中國空間技術(shù)研究院航天神舟生物科技集團(tuán)有限公司，北京 100080；2.中國航天科技集團(tuán)有限公司空間生物工程研究中心，北京 100080；3.北京市空間生物工程技術(shù)研究中心，北京 100080)

1 引言

隨著中國航天技術(shù)的不斷發(fā)展以及載人航天、深空探測(cè)等一系列空間探索任務(wù)的成功實(shí)施，特別是空間站的落成進(jìn)入倒計(jì)時(shí)，為空間生命科學(xué)的飛速發(fā)展提供了良機(jī)?？臻g細(xì)胞生物學(xué)研究是空間生命科學(xué)的重要分支，研究空間環(huán)境下細(xì)胞的生物學(xué)過程及變化規(guī)律，對(duì)于探索空間特殊環(huán)境對(duì)人體系統(tǒng)的影響具有重要意義，并可為利用空間環(huán)境進(jìn)行生物醫(yī)藥創(chuàng)新提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)手段。

由于空間環(huán)境的特殊性，常規(guī)的地面細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備不能滿足在空間飛行條件下開展細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的需求，因此，需要研制特殊的、適合空間使用的細(xì)胞培養(yǎng)裝置。

目前國際空間站中的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)主要有BioServe、GAP-FPA、Kubik和Bioculture等細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。BCA(BioServe Culture Apparatus)主要用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，它實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)氣體交換、定時(shí)取樣、手動(dòng)換液和固定功能。TGAP-FPA(The Group Activation Pack-Fluid Processing Apparatus)在國際空間站中用于抗生素生產(chǎn)和細(xì)胞培養(yǎng)，由外殼、玻璃管、橡膠塞組成，利用橡膠塞的推進(jìn)實(shí)現(xiàn)空間液體混合。Kubik在空間站中主要用于免疫細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)和干細(xì)胞分化，在空間實(shí)現(xiàn)溫控和樣品冷凍。Bioculture是自動(dòng)化的、在軌可操控的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。該系統(tǒng)采用獨(dú)立灌注和計(jì)算機(jī)控制液體流速體系的組合技術(shù)，完成多種細(xì)胞培養(yǎng)基輸送及維持，并實(shí)現(xiàn)了溫度控制和氣體交換。

近年來，中國科研人員在細(xì)胞空間搭載方面取得了一些研究成果:王紅暉等通過神舟六號(hào)搭載心肌細(xì)胞和原代成骨細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了小載荷、多細(xì)胞搭載；劉紅菊等通過神舟十號(hào)搭載小鼠成肌細(xì)胞，證實(shí)空間飛行期間骨骼肌成肌細(xì)胞增殖分化的可塑性顯著降低；陳鈺等研制的空間微流控芯片生物培養(yǎng)和分析載荷由天舟一號(hào)貨運(yùn)飛船送入太空，用于研究空間微重力環(huán)境下神經(jīng)細(xì)胞與免疫細(xì)胞的相互作用。

本文研制一種適合在空間進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)?zāi)K，并開展地面實(shí)驗(yàn)進(jìn)行性能測(cè)試。

2 模塊研制

空間細(xì)胞培養(yǎng)模塊的設(shè)計(jì)需要考慮以下幾個(gè)方面:①在空間微重力條件下，氣體和液體不會(huì)自然分離，培養(yǎng)容器中的氣體將會(huì)以氣泡的形式長期存在于培養(yǎng)液中，并對(duì)細(xì)胞的生長及活性產(chǎn)生嚴(yán)重影響。因此，在空間開展細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，必需使用密閉的培養(yǎng)容器，并且在其中充滿培養(yǎng)液，不能留存空氣。在這種情況下，如何在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，維持培養(yǎng)液中氧氣和二氧化碳含量的穩(wěn)定是一個(gè)關(guān)鍵問題。②在太空艙內(nèi)各種資源都非常有限，因此，在模塊設(shè)計(jì)上需采用小型化、集成化設(shè)計(jì)，盡可能降低模塊的重量、體積、功耗及對(duì)其他資源的需求。③為便于在軌使用，空間細(xì)胞培養(yǎng)模塊除了需滿足空間飛行對(duì)安全性、可靠性等要求外，還需盡量采用簡(jiǎn)單可靠的培養(yǎng)方法和自動(dòng)化、模塊化設(shè)計(jì)，減少對(duì)航天員操作的需求，并保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

空間細(xì)胞培養(yǎng)模塊要求培養(yǎng)面積大、培養(yǎng)液體積小、密封性好，并能濕熱滅菌。本模塊采用無源設(shè)計(jì)，最大外形尺寸為130 mm×90 mm×14 mm。整體由蓋板、疏水透氣膜、主體框架、O圈、緊固件、直通魯爾接頭等部分組成(圖1)。用兩側(cè)緊固件和密封O圈對(duì)培養(yǎng)室進(jìn)行密封，組裝后即可進(jìn)行貼壁細(xì)胞培養(yǎng)(圖2)。其中疏水透氣膜為透明薄膜，方便進(jìn)行內(nèi)外氣體交換，并可進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察。

圖1 空間細(xì)胞培養(yǎng)模塊設(shè)計(jì)圖Fig.1 Design chart of space cell culture device

圖2 細(xì)胞培養(yǎng)模塊實(shí)物圖Fig.2 Physical picture of cell culture device

2.1 培養(yǎng)室設(shè)計(jì)

主體框架由聚碳酸酯(PC)制成，內(nèi)部中空尺寸為80 mm×50 mm×8 mm，主體框架兩側(cè)具有凹槽可放置O圈，結(jié)合疏水透氣膜形成內(nèi)部細(xì)胞培養(yǎng)室，容積約為30 mL。培養(yǎng)室單側(cè)培養(yǎng)表面積約為40 cm，可以進(jìn)行雙側(cè)細(xì)胞培養(yǎng)，顯著增加單位面積的細(xì)胞培養(yǎng)量。當(dāng)細(xì)胞在疏水透氣膜上貼壁培養(yǎng)時(shí)，可與外界進(jìn)行氣體交換。疏水透氣膜具有較好的生物相容性，可以耐受濕熱滅菌條件，并可重復(fù)使用。

2.2 密封設(shè)計(jì)

培養(yǎng)室采用O圈密封，結(jié)合蓋板與緊固件加強(qiáng)密封效果與強(qiáng)度。O圈由醫(yī)用硅膠制成，具有良好的生物相容性，能耐受120℃(20 min)的滅菌條件，且密封效果好。蓋板由鋁合金制成，內(nèi)側(cè)中空透氣。為實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)液注入與交換，培養(yǎng)室通過主體框架內(nèi)部管路與直通魯爾接頭連接，魯爾接頭即插即用，具有很好的密封效果。

3 性能測(cè)試

3.1 材料

骨肉瘤細(xì)胞(Human Osteosarcoma Cells，MG63)購買于美國模式培養(yǎng)物集存中心ATCC；DMEM培養(yǎng)基(Gibco，cat.11995-065)；10%胎牛血清(Hyclone)；CCK8試劑盒(日本同仁CK04)；Caspase-3分光光度法檢測(cè)試劑盒(凱基KGA202-KGA204)。

3.2 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞活性檢測(cè)

MG63細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為4×10個(gè)/mL，接種于6孔板中，2 mL/孔，即8×10個(gè)/孔。培養(yǎng)過夜待細(xì)胞貼壁后，換用10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，再加入高壓滅菌后的不同材料與MG63細(xì)胞共培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組。作用72 h、144 h后除去培養(yǎng)液和材料，用Dulbecco’s磷酸鹽緩沖液(Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline，DPBS)清洗細(xì)胞，加入200μL含10%的CCK-8的無血清培養(yǎng)基，37℃溫浴1 h左右，取200μL上清于96孔板中，使用酶標(biāo)儀450 nm波長檢測(cè)上清液OD值。

3.3 細(xì)胞裂解和總蛋白濃度測(cè)定

細(xì)胞培養(yǎng)方法同上，作用6 h、24 h、48 h、72 h、144 h后除去培養(yǎng)液和材料，用DPBS洗滌細(xì)胞2次，胰酶消化后，2000 rpm離心5 min，收集細(xì)胞，盡量去除DPBS上清，在收集的沉淀細(xì)胞中加入200μL預(yù)冷的Lysis Buffer，冰上裂解60 min，期間每20 min渦旋振蕩1次，每次10 s，裂解結(jié)束后在4℃下10 000 rpm離心1 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移到新管中，并于冰上放置。

BCA試劑A與BCA試劑B按50∶1的比例配制成工作液，用移液管反復(fù)吹打，充分混勻。將標(biāo)準(zhǔn)品0，1，2，4，8，12，16，20μL加入96孔板的標(biāo)準(zhǔn)孔中，所有標(biāo)準(zhǔn)孔用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20μL。樣品孔加入2μL樣品后，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足至20μL。每孔加入200μL BCA工作液，37℃孵育30 min。利用562 nm的波長檢測(cè)OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的蛋白濃度。

3.4 Caspase-3活性檢測(cè)

吸取50μL含100μg蛋白的細(xì)胞或組織裂解上清，體積不足50μL用10 mmol/L PBS補(bǔ)足至總體積50μL(各組均采用同樣的蛋白定量進(jìn)行測(cè)定和比較)，加入50μL的2×Reaction Buffer，再加入5μL Caspase-3底物，并于37℃避光孵育4 h，用酶標(biāo)儀在波長405 nm測(cè)定其吸光值。

3.5 裝置細(xì)胞培養(yǎng)和總蛋白測(cè)定

MG63細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10個(gè)/mL，將1 mL細(xì)胞液與15 mL新鮮培養(yǎng)基混勻，從培養(yǎng)室邊框的管路中接種于細(xì)胞培養(yǎng)裝置一側(cè)的透氣膜上，靜置4 h。再將另外1 mL細(xì)胞液與15 mL新鮮培養(yǎng)基混勻，從培養(yǎng)室邊框的管路中接種于細(xì)胞培養(yǎng)模塊另一側(cè)的透氣膜上，并使培養(yǎng)液充滿整個(gè)培養(yǎng)裝置。設(shè)立細(xì)胞培養(yǎng)瓶組作為陰性對(duì)照。靜置培養(yǎng)3天后，從培養(yǎng)室邊框的管路中吸取培養(yǎng)基，并用DPBS洗滌細(xì)胞2次，胰酶消化后，2000 rpm離心5 min，收集細(xì)胞，盡量去除DPBS上清，在收集的沉淀細(xì)胞中加入200μL預(yù)冷的Lysis Buffer，冰上靜置60 min，在靜置過程中渦旋振蕩3次，每次10 s，靜置結(jié)束后4℃10 000 rpm離心1 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的管中，放置在冰上待用。

蛋白裂解方法同上，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的蛋白濃度。利用3.2和3.4的方法測(cè)定模塊內(nèi)的細(xì)胞活性和Caspase-3活性。

3.6 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，進(jìn)行

t

檢驗(yàn)和方差分析，

P

＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 材料對(duì)細(xì)胞活性的影響

在組裝模塊前所有與細(xì)胞接觸的材料都應(yīng)進(jìn)行生物相容性檢測(cè)。測(cè)試的材料包括主體框架材料、公魯爾接頭、母魯爾接頭和O圈。其中O圈選擇常用的硅膠、氟膠、丁晴3種材料。這些材料通過高壓滅菌與MG63細(xì)胞共培養(yǎng)72 h后，利用CCK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性，結(jié)果如圖3、圖4所示。結(jié)果可見，硅膠O圈與細(xì)胞共培養(yǎng)72 h和144 h后，對(duì)細(xì)胞活力的影響與對(duì)照組相比無顯著性差異(

P

＞0.05)。而丁腈和氟膠材料的O圈與細(xì)胞共培養(yǎng)72 h和144 h后，與對(duì)照組相比顯著降低細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞生長(

P

＜0.01，

P

＜0.05)。魯爾接頭和主體框架材料(PC)與細(xì)胞共培養(yǎng)72 h和144 h后，對(duì)細(xì)胞活力的影響與對(duì)照組相比無顯著性差異(

P

＞0.05)。因此組裝模塊選用了硅膠材料的O圈。

圖3 O圈材料對(duì)細(xì)胞活力的影響Fig.3 Effects of O ring materials on cell viability

圖4 魯爾接頭和主體框架材料對(duì)細(xì)胞活力的影響Fig.4 Influence of Luer junction and main frame materials on cell viability

4.2 材料對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

在組裝模塊前所有與細(xì)胞接觸的材料進(jìn)行生物相容性檢查除細(xì)胞活力檢測(cè)外，還應(yīng)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，以期進(jìn)一步觀察材料對(duì)細(xì)胞生長情況的影響。測(cè)試的材料包括主體框架材料、公魯爾接頭、母魯爾接頭和O圈。這些材料通過高壓滅菌與MG63細(xì)胞共培養(yǎng)6 h、24 h、48 h、72 h、144 h后檢測(cè)Caspase-3活性。Caspase家族與真核細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，其中Caspase-3是其中最重要的分子之一。它是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，在細(xì)胞正常生長過程中，它以酶原形式存在于胞漿中，無表達(dá)活性。在細(xì)胞發(fā)生程序性死亡的早期，caspase-3分子被激活，裂解相應(yīng)的底物。因此Caspase-3的活性可以作為判斷細(xì)胞凋亡的指標(biāo)。

結(jié)果如圖5、圖6所示。結(jié)果可見，硅膠O圈6 h、24 h、48 h、72 h、144 h共培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響與對(duì)照組相比無顯著性差異(

P

＞0.05)。魯爾接頭和主體框架材料(PC)在6 h、24 h、48 h、72 h、144 h共培養(yǎng)后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響與對(duì)照組相比，無顯著性差異(

P

＞0.05)。說明組裝模塊選用了所有材料與細(xì)胞生物相容性好，可以用于后續(xù)組裝。

圖5 魯爾接頭對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effect of Luer junction on apoptosis

圖6 硅膠O圈和主體框架材料對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Effects of silicone O ring and host frame materials on apoptosis

4.3 培養(yǎng)模塊細(xì)胞測(cè)試

在組裝模塊前，所有與細(xì)胞接觸的材料進(jìn)行生物相容性測(cè)試后，選擇適合的材料進(jìn)行整機(jī)的適應(yīng)性測(cè)試。采用T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶和自主設(shè)計(jì)的空間細(xì)胞培養(yǎng)模塊培養(yǎng)MG63細(xì)胞72 h，觀察細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果顯示細(xì)胞培養(yǎng)瓶和空間細(xì)胞培養(yǎng)模塊培養(yǎng)細(xì)胞的生長狀態(tài)一致，細(xì)胞鋪展?fàn)顟B(tài)良好，如圖7、圖8所示。

圖7 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞形態(tài)Fig.7 Cell morphology in cell culture flask

圖8 空間培養(yǎng)模塊中的細(xì)胞形態(tài)Fig.8 Cell morphology in a space culture device

采用蛋白定量測(cè)定培養(yǎng)72 h后，1個(gè)空間培養(yǎng)模塊的細(xì)胞總蛋白量為5.7 mg，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示空間細(xì)胞培養(yǎng)模塊培養(yǎng)MG63細(xì)胞的總蛋白量相當(dāng)于4個(gè)T25的細(xì)胞培養(yǎng)瓶收集的蛋白總量。這一結(jié)果有利于在空間環(huán)境中在同樣體積的培養(yǎng)模塊中獲得更大量的細(xì)胞樣品。

采用CCK8檢測(cè)試劑盒檢測(cè)MG63細(xì)胞在不同培養(yǎng)模塊培養(yǎng)72 h后的細(xì)胞活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示如圖9所示，表明自主設(shè)計(jì)的空間細(xì)胞培養(yǎng)模塊培養(yǎng)的細(xì)胞活性與細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)細(xì)胞活性無顯著性差異(

P

＞0.05)。

圖9 不同培養(yǎng)裝置對(duì)細(xì)胞活力的影響Fig.9 Effects of different culture devices on cell viability

檢測(cè)MG63細(xì)胞在不同培養(yǎng)模塊培養(yǎng)72 h后的Caspase-3活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10所示，結(jié)果表明空間細(xì)胞培養(yǎng)模塊培養(yǎng)的細(xì)胞凋亡與細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)細(xì)胞無顯著性差異(

P

＞0.05)。細(xì)胞活力和凋亡的結(jié)果同時(shí)說明空間細(xì)胞培養(yǎng)模塊在短期的細(xì)胞培養(yǎng)中可以替代細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行空間環(huán)境的細(xì)胞培養(yǎng)。

圖10 不同培養(yǎng)裝置對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Fig.10 Effects of different culture devices on apoptosis

5 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)了一種空間細(xì)胞培養(yǎng)模塊，該模塊操作簡(jiǎn)單，密封效果好，生物相容性佳。培養(yǎng)膜疏水透氣便于細(xì)胞生長和觀察。利用此模塊培養(yǎng)MG63細(xì)胞72 h后，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)和鋪展性良好，細(xì)胞活性和凋亡與傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶相比無顯著性差異。該模塊為空間體外培養(yǎng)細(xì)胞提供了便利的工具，可應(yīng)用于空間飛行和空間站的細(xì)胞培養(yǎng)研究。