余冰潔, 程 鈞, 宋 珊, 楊玲玲

0引言

眼部堿燒傷是一種常見又非常難治的眼外傷，可嚴重影響患者的視力。對于堿燒傷急性期的治療，應主要關(guān)注于促進角膜和結(jié)膜上皮修復、減輕眼表炎癥反應、抑制新生血管生成等方面。但是堿燒傷后眼表環(huán)境復雜，涉及多種反應，多種炎癥因子的參與，角膜上皮往往難以修復。有研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性小體介導的NLRP3-ASC-Caspase-1-IL-1β焦亡通路參與無菌性角膜損傷，抑制該通路可以減輕炎癥反應，降低角膜的混濁程度，可作為提高眼部堿燒傷預后的一種新治療方法[1]。左旋肉堿(L-carnitine，LC)又名左卡尼汀，是一種氨基酸衍生物，具有抗氧化，抗凋亡，抑制炎癥反應[2]及滲透保護等作用，目前LC已廣泛應用于干眼、青光眼、白內(nèi)障等眼部疾病的治療。LC可通過抑制信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)通路減少活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，從而抑制炎癥反應[3]，改善氧化應激所破壞的微環(huán)境[4]。我們猜想LC在堿燒傷中可能起到一定的作用。我們通過觀察眼部堿燒傷后應用LC角膜上皮修復的情況，焦亡相關(guān)蛋白表達的變化，以確定LC在角膜上皮細胞修復及調(diào)節(jié)細胞焦亡的作用，尋找治療眼部堿燒傷的新方法。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1主要實驗試劑L-carnitine試劑(美國Selleck公司)；RIPA裂解液(北京索萊寶公司)；磷酸酶抑制劑(上海碧云天公司)；NLRP3抗體(MAB7578，美國R&D公司)；Caspase-1抗體(sc-56036，美國Santa Cruz公司)；Ki-67(ab16667)、p-STAT3抗體(ab2105，美國Abcam公司)；IL-1β(A1192)、STAT3抗體(A1192，武漢愛博泰克公司)；P63抗體(618901，美國BioLegend公司)；GAPDH抗體(T0004-HRP，美國Affinity公司)；HRP偶連山羊抗大鼠(S0009)、山羊抗兔(S0001)二抗(美國Affinity公司)；HRP偶連山羊抗小鼠二抗(AB0102，上海泊灣公司)；熒光偶連抗兔二抗(A-11034，美國Invitrogen公司)；鹽酸丙美卡因滴眼液(比利時ALCINE公司)；O.C.T.冷凍切片包埋劑(美國櫻花公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)。

1.1.2主要實驗儀器光學顯微鏡(德國Zeiss公司)；裂隙燈顯微鏡(瑞士Haag-Streit公司)；熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；手術(shù)顯微器械(蘇州明仁醫(yī)械公司)。

1.1.3實驗動物及分組健康雄性C57/6J小鼠96只，6～8周齡，體質(zhì)量18～20g，經(jīng)裂隙燈顯微鏡檢查無眼部疾患，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。小鼠經(jīng)隨機數(shù)字表法分為PBS組、LC治療組，每組各35只，其余為空白對照組。整個實驗過程，小鼠飼養(yǎng)條件為正常晝夜交替采光，溫度(25±1)℃，相對濕度(60±10)%。實驗動物的使用遵循國家科學技術(shù)委員會頒布的《實驗動物管理條例》。本實驗經(jīng)山東省眼科研究所倫理審批會審查，符合倫理學要求。

1.2方法

1.2.1溶液的配制LC滴眼液：將LC粉劑溶解于PBS緩沖液中，配制成濃度為150mmol/L的保存液，置于-80℃冰箱保存。使用時用PBS緩沖液稀釋至60mmol/L。

1.2.2角膜堿燒傷模型制作及分組處理隨機選小鼠取右眼制作堿燒傷模型。造模方法為：按(40～70)mg/kg使用0.6%戊巴比妥鈉溶液行腹腔注射麻醉，術(shù)前0.01%鹽酸丙美卡因滴眼液眼表麻醉，無菌棉簽拭去多余液體。吸取2μL 1mol/L氫氧化鈉溶液于直徑2.0mm的單層圓形濾紙上，然后迅速貼在小鼠角膜中央40s，0.9% NaCl溶液沖洗40s。術(shù)后小鼠角膜中央均可見一直徑約2.0mm圓形白色混濁，與濾紙片接觸位置對應；熒光素鈉染色可見直徑約2.0mm綠色著色的角膜破損區(qū)域，即眼部堿化學燒傷建模成功。造模后立即常規(guī)給予氧氟沙星眼膏1次預防感染?？瞻讓φ战M不作任何處理，PBS組、LC組分別給予PBS溶液、60mmol/L LC溶液點眼，自建模前1d開始給藥，所有滴眼藥物用量均為每次5μL，每天固定時間滴眼6次，連續(xù)給藥至取材。

1.2.3角膜上皮缺損面積的統(tǒng)計每組隨機選取12只，連續(xù)給藥至建模后第7d，每日裂隙燈顯微鏡觀察各組小鼠眼表情況，并在0h，3、7d用0.25%熒光素鈉觀察角膜上皮缺損面積，并在鈷藍燈光下拍照。經(jīng)Image J軟件分析熒光素鈉染色面積，計算殘余角膜上皮缺損占原始缺損面積百分比，即角膜上皮缺損面積比=各時間點角膜上皮缺損面積/0h缺損面積×100%。

1.2.4角膜上皮組織蛋白提取每組隨機選取18只小鼠，給藥至建模后第3d，每次實驗6只，重復3次。用頸椎脫臼法處死小鼠，摘取完整的眼球，在顯微鏡下分離角膜組織，使用上皮刮刀刮取角膜上皮，同組樣本混合置于RIPA裂解液中(PMSF 1∶100、磷酸酶抑制劑1∶50混入)，冰上裂解30min，經(jīng)勻漿、超聲、離心取上清，使用BCA法測各組蛋白濃度。上清與Loading buffer混均后95℃金屬浴，10min；-80℃保存。

1.2.5 Western blot 配制12.5%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，每孔取15μg總蛋白上樣；電泳完畢后剝離SDS-PAGE膠，蛋白經(jīng)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜；室溫下使用5% BSA封閉1h，TBST溶液洗滌，分別加入NLRP3(1∶400)、Caspase-1(1∶400)、p-STAT3(1∶1 000)、STAT3(1∶1 000)、P63(1∶1 000)、GAPDH(1∶6 000)一抗，4℃孵育過夜；經(jīng)PVDF膜TBST溶液洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的對應二抗(均為1∶6 000)，室溫下孵育1h；TBST溶液洗滌；ECL顯影并拍照。以GAPDH為內(nèi)參，使用Image Lab圖像分析軟件分析各個蛋白的灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH表達灰度值的比值為目的蛋白相對表達量，并計算p-STAT3/STAT3的值。實驗需重復3次取平均值。

1.2.6免疫熒光染色隨機選取小鼠建立堿燒傷模型，每組5只，給藥至建模后第3d，頸椎脫臼法處死小鼠，將眼球完整取下，浸入O.C.T.膠中包埋，立即放入-80℃，冰凍切片機7μm連續(xù)切片。切片室溫放置30min，PBS清洗，4%多聚甲醛溶液固定10min，PBS清洗，0.1% Triton透化5min，PBS清洗，室溫下5% BSA封閉1h，一抗IL-1β(1∶100)、Ki-67(1∶100)4℃孵育過夜，PBS清洗。室溫下孵育二抗(1∶200)1h，PBS清洗，DAPI染核5min，PBS沖洗后封片，共焦顯微鏡下觀察拍攝。

2結(jié)果

2.1堿燒傷后PBS組及LC組角膜上皮修復情況的比較PBS組和LC組眼部堿燒傷后即刻可見圓形全角膜熒光素鈉染色。在堿燒傷后3d，LC組小鼠角膜熒光素鈉染色面積明顯縮小，在第7d僅見角膜中央較小面積熒光素鈉著色。同時間點PBS組小鼠的染色面積均大于LC組，且在第7d角膜中央?yún)^(qū)仍可見較大面積熒光素鈉染色(圖1A)。在堿燒傷后3、7d時PBS組與LC組比，殘留角膜上皮缺損面積占原始缺損面積的百分比分別為(29.38±6.83)%vs(17.78±4.11)%、(14.23±4.51)%vs(4.10±2.10)%，組別和時間點存在交互作用，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.0001，圖1B，表1)。在各自時間點LC組比PBS組上皮缺損面積更小(P<0.01)。結(jié)果表明與PBS組比，LC組的角膜上皮修復速度更快。

圖1 PBS組及LC組堿燒傷后不同時間點角膜上皮損傷面積變化的比較 A：堿燒傷后不同時間點各組小鼠角膜熒光素鈉染色；B：堿燒傷后不同時間點各組小鼠角膜熒光素鈉染色面積結(jié)果。bP<0.01 vs LC組。

表1 堿燒傷后不同時間點各組小鼠角膜熒光素鈉染色的廣義估計方程分析

2.2各組角膜上皮中NLRP3和Caspase-1蛋白相對表達量的比較Western blot檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比，堿燒傷3d后，PBS組與LC組角膜上皮內(nèi)的焦亡通路被激活，組織中NLRP3和Caspase-1蛋白的前體及成熟體表達條帶均明顯增強。與PBS組比，LC組NLRP3、pro Caspase-1、cleaved Caspase-1蛋白表達條帶量均降低?？瞻讓φ战M、PBS組和LC組細胞中NLRP3表達量相對值分別為0.741±0.106、2.579±0.218、0.987±0.100；pro Caspase-1相對表達量分別為5.374±1.604、12.589±2.515、8.119±0.138；cleaved Caspase-1相對表達量分別為0.907±0.312、1.667±0.199、1.164±0.118。各蛋白三組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(NLRP3：F=23.22，P<0.01；pro Caspase-1：F=13.39，P<0.01；cleaved Caspase-1：F=8.910，P<0.01)。各組間兩兩比較，除cleaved Caspase-1空白對照組與LC組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)外，其余各組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。小鼠角膜免疫熒光染色結(jié)果顯示，與空白對照組比較，PBS組和LC組全角膜IL-1β熒光強度均增強；與PBS組比較，LC組全角膜包括角膜上皮中IL-1β熒光強度顯著減弱，見圖2。

圖2 堿燒傷后3d各組角膜上皮中NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達 A：堿燒傷后3d各組角膜上皮NLRP3、Caspase-1、GAPDH蛋白表達電泳圖；B、C、D：分別為堿燒傷后3d各組角膜上皮中NLRP3、pro Caspase-1、cleaved Caspase-1蛋白表達量比較。aP<0.05 vs空白對照組；cP<0.05, dP<0.01 vs PBS組；E：免疫熒光染色(IF)顯示堿燒傷后3d各組角膜上皮中IL-1β蛋白表達。綠色熒光為IL-1β陽性，藍色熒光為細胞核。

2.3各組小鼠角膜上皮干/祖細胞增生情況Western blot檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比，堿燒傷后各組小鼠角膜上皮中的P63表達水平顯著下降；與PBS組比，LC組角膜上皮中有更高的P63蛋白表達?？瞻讓φ战M、PBS組和LC組細胞中P63的相對表達量分別為1.713±0.307、0.528±0.185和1.003±0.095，三組之間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=23.22，P<0.01)；與空白對照組比，PBS組、LC組的P63蛋白表達均降低(P<0.05)；LC組細胞中P63蛋白表達條帶強于PBS組(P<0.05)。免疫熒光染色結(jié)果顯示，與空白對照組比較，PBS組與LC組小鼠角鞏膜緣Ki-67熒光強度明顯升高，陽性細胞數(shù)均增加；與PBS組比較，LC組Ki-67蛋白熒光強度更高，陽性細胞數(shù)增加，見圖3。

圖3 堿燒傷后3d各組角膜上皮中P63、Ki-67蛋白表達情況 A：堿燒傷后3d各組角膜上皮P63、GAPDH蛋白表達電泳圖；B：堿燒傷后3d各組角膜上皮中P63蛋白表達量比較結(jié)果。aP<0.05 vs LC組; dP<0.01 vs 空白對照組；C：免疫熒光染色(IF)顯示堿燒傷后3d各組角膜上皮中Ki-67蛋白表達。綠色熒光為Ki-67陽性細胞，藍色熒光為細胞核。

2.4各組角膜上皮中p-STAT3/STAT3的相對表達量變化Western blot檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比，堿燒傷后各組小鼠角膜上皮中的STAT3活化水平顯著上調(diào)；與PBS組比，LC組STAT3活化水平更高。空白對照組、PBS組和LC組細胞中p-STAT3與STAT3蛋白的比值分別為0.391±0.301、2.836±0.724、4.299±0.278，差異有統(tǒng)計學意義(F=50.68，P<0.01)；用LSD-t檢驗兩兩比較，與空白對照組比較，堿燒傷后第3d，PBS組與LC組角膜上皮中STAT3蛋白磷酸化水平明顯升高(P<0.01)；與PBS組比，LC組STAT3磷酸化水平更高(P<0.05)，見圖4。

圖4 堿燒傷后3d各組角膜上皮中p-STAT3與STAT3蛋白的比值 A：堿燒傷后3d各組角膜上皮p-STAT3、STAT3蛋白表達電泳圖；B：堿燒傷后3d各組角膜上皮中NLRP3蛋白表達量比較。aP<0.05 vs PBS組，dP<0.01 vs空白對照組。

3討論

眼部堿化學燒傷是一種復雜的眼外傷，堿性物質(zhì)與組織發(fā)生皂化反應，溶解組織中的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，受損的組織細胞可以釋放蛋白水解酶，并逐漸向眼內(nèi)滲透，對眼球造成進一步損害。重癥堿燒傷可致角膜穿孔、瞼球黏連、干眼、繼發(fā)性青光眼、并發(fā)白內(nèi)障或眼球萎縮等，造成嚴重的視力損害。

堿燒傷后炎癥細胞浸潤并產(chǎn)生大量炎癥因子,如白介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-1β、IL-10、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)，炎癥反應劇烈，加劇眼部損害[5]。此時眼表處于高滲、重度炎癥反應的微環(huán)境，極不利于角膜上皮的修復。因此抑制炎癥反應、細胞凋亡及血管新生對減輕堿燒傷所致角膜損傷程度、改善角膜透明度具有重要價值。

細胞焦亡是一種介導無菌性炎癥的程序性死亡程序。在各種信號刺激下，細胞內(nèi)的模式識別受體識別這些信號，以凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)為接頭蛋白與半胱天冬酶-1(Caspase-1)的前體結(jié)合，形成炎性小體，使Caspase-1活化?；罨腃aspase-1一方面切割Gasdermin D，形成含有Gasdermin D氮端活性域的肽段，氮端同源集聚形成貫穿于質(zhì)膜的親水性孔道，膜的完整性被破壞，無機小分子選擇性通過使細胞逐漸膨脹至破裂，釋放出內(nèi)容物如IL-1β、IL-18，引起炎癥反應；另一方面，活化的Caspase-1切割I(lǐng)L-1β和IL-18的前體，形成并釋放有活性的IL-1β和IL-18至胞外，募集炎癥細胞，擴大炎癥反應。

ATP[6]、自噬[7]、ROS[8]及某些金屬離子[9]均可引起炎性小體的活化及細胞焦亡。有研究表明在小鼠堿燒傷模型中NLRP3-ASC-Caspase-1-IL-1β通路介導的細胞焦亡被激活，應用NLRP3抑制劑阻斷該通路可抑制NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表達，減輕炎癥反應，促進角膜上皮修復，改善角膜的透明度[9]。IL-1β是參與堿燒傷后炎癥反應的一個重要的前炎癥因子，且IL-1β的表達量與堿燒傷后炎癥反應正相關(guān)[5]。IL-1β和TNF-α可以促進基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的表達，進而降解角膜膠原纖維，導致角膜變薄甚至引起穿孔[10]。還有研究表明受IL-1β、TNF-α刺激時，角膜緣干細胞的增殖能力下降。因此降低IL-1β的表達，有利于堿燒傷后角膜的恢復[11]。

有研究表明，在激活NLRP3炎性小體和IL-1β分泌中，ROS有決定性作用[12-13]，還有研究表明高滲應激誘導的干眼與人角膜上皮細胞(human corneal epithelial cells，HCECs)中ROS激活的NLRP3炎性小體介導誘導的ROS-NLRP3-IL-1β軸的激活相關(guān)，ROS水平升高對NLRP3表達有相應的影響，而NLRP3表達可觸發(fā)先天免疫反應，NLRP3表達量也與干眼疾病的嚴重程度相關(guān)[14]。堿燒傷時，組織釋放出大量ROS[15]。LC已被證實可降低ROS水平，減少氧化應激來提高體外胚胎的存活能力[16]。另外LC可以激活高血糖條件下的抗氧化信號通路，增加抗氧化蛋白SOD2的表達，防止ROS的形成，促進STAT3活化，來保護心肌細胞免受氧化應激相關(guān)損傷[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，LC通過抑制抗氧化酶的下降和抑制ROS的產(chǎn)生來保護HCECs免受氧化應激[17]。有研究表明LC的酯化物乙酰左旋肉堿可降低非酒精性脂肪肝小鼠的肝細胞焦亡水平[18]；LC可降低慢性他克莫司腎病大鼠腎組織的焦亡水平，促進細胞的存活[19]。我們猜想LC可以通過抑制ROS生成進一步影響細胞焦亡的水平。有研究表明，在小鼠堿燒傷模型中細胞焦亡在建模后第2d升高，第5d降低[9]，為了證明LC對細胞的焦亡作用，我們檢測了堿燒傷后3d時與焦亡相關(guān)蛋白的表達水平。與Zheng等[19]的結(jié)果一致，我們的實驗結(jié)果表明，與PBS組比，LC組NLRP3、Caspase-1、IL-1β水平均有所下降，可以證實在堿燒傷模型中，LC可降低細胞焦亡水平，從而減輕炎癥反應對角膜的損害。

有研究表明，外源性給予LC可顯著促進肝部分切除大鼠的肝細胞再生[20]、促進新生豬小腸上皮細胞的增殖[21]。與他們的結(jié)果一致，在本研究中，我們對堿燒傷后0h，3、7d角膜上皮缺損面積進行分析，結(jié)果表明，各時間點LC組角膜上皮恢復均早于PBS組。因角膜上皮修復在建模后前3d更為顯著，我們在建模后第3d取材。角膜上皮組織中Ki-67的免疫熒光與P63 Western blot結(jié)果表明，與PBS組比，LC組角膜上皮中干細胞增殖能力的Ki-67蛋白與角膜緣干細胞干性標志物P63蛋白的表達水平均上調(diào)，說明LC可促進角膜緣干細胞的存活與增殖，有助于角膜上皮的修復。

STAT3是一種轉(zhuǎn)錄因子，STAT3磷酸化被激活，進入細胞核，引起細胞核內(nèi)凋亡、增殖、遷移相關(guān)基因的表達[22]，實現(xiàn)促進干細胞存活、增殖、遷移、活化，抑制干細胞調(diào)亡，維持干細胞的自我更新等作用[23-24]。最近的研究表明睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子對角膜上皮干細胞/祖細胞活化和創(chuàng)面愈合的促進作用是通過STAT3的活化介導的[25]。IL-6參與正常和糖尿病小鼠角膜上皮修復的過程，這一作用通過激活STAT3信號通路促進角膜緣干細胞的活化和增生來實現(xiàn)[26]。另有研究表明JAK/STAT3信號通路參與調(diào)節(jié)了細胞增殖、凋亡、分化等多種生理過程，當該通路被激活時，可進一步調(diào)控其下游相關(guān)基因如Ki-67、p53等的表達[27-28]。另外在角膜緣處的STAT3的磷酸化水平和核轉(zhuǎn)位水平高于角膜中央，可通過調(diào)節(jié)ΔNp63的表達水平來調(diào)控角膜緣干細胞的增殖及分化狀態(tài)[29]。在眼部堿燒傷模型中，角膜損傷部位的角膜上皮缺損及其再生是重要的病理生理反應。我們的研究發(fā)現(xiàn)，堿燒傷后的前3d小鼠角膜上皮快速修復，此時角膜上皮細胞的增生最為顯著，因此我們給藥至第3d取材，檢測STAT3的磷酸化水平。與Vacante等[4]的結(jié)論一致，結(jié)果表明，與PBS組比，LC組STAT3磷酸化水平升高，我們推測LC可通過激活STAT3來促進角膜上皮修復。

綜上所述，堿燒傷后給予左旋肉堿滴眼液可通過抑制細胞焦亡來減輕炎癥反應，通過STAT3信號通路的活化來促進堿燒傷后角膜上皮的修復。