謝文佳 孫曉霞 王前 陳蕾 李軻

（1.河南省產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗院，河南鄭州 450047；2.鄭州海關技術中心，河南鄭州 450003）

隨著人類社會的進步，醫(yī)藥科技的不斷發(fā)展，國內(nèi)抗生素濫用問題已經(jīng)相當嚴峻，而水體環(huán)境中的抗生素殘留污染狀況也不容樂觀，特別是地下水、水源水中也有檢出，直接影響到生活飲用水中的抗生素污染殘留。目前抗生素的檢測方法多為食品中的獸藥殘留檢測，生活飲用水中的檢測方法則較為少見。已有的抗生素殘留的檢測方法有光譜[1]、色譜、免疫[2,3]、電化學[4]、毛細管電泳[5]、微生物法[6]以及其他新型檢測技術[7]等。目前應用相對比較多的是色譜法，該類方法靈敏度高，檢出限低，重復性好[8]，其又可細分為液相色譜-高分辨質譜聯(lián)用技術[9,10]、液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用技術（HPLC/MS/MS）[11,12]、超高效液相色譜串聯(lián)質譜（UPLC/MS/MS）[13,14]、高效液相色譜[15,16]等。研究表明，進入水環(huán)境中的各種抗生素種類較為繁多，并且以ng/L（ppt級別）甚至更低的濃度存在[17]。另外不同水體其基質不同，含有的干擾物也不同，因此，選用合適的方法對于水中抗生素的檢測就顯得格外重要。液相色譜法適合于含量比較高的抗生素的測定，液相色譜-高分辨質譜法雖定性功能強大，但定量準確度上稍差些，因此本研究采用超高效液相色譜串聯(lián)質譜（UPLC/MS/MS）法，其檢測限度相對較低，定量準確，經(jīng)前處理進化濃縮后，可達到ng/L（ppt級別）的檢測水平，能準確有效的檢測出低含量的抗生素。

本文選擇了用量大、易進入水體造成污染的4類抗生素[18,19]（磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類），利用固相萃取富集前處理，建立了水中14種抗生素同時定量檢測的分析方法，可在25 min內(nèi)完成14種目標抗生素的分析，并成功在多種生活飲用水的水體內(nèi)進行目標抗生素的測定。因此本方法可應用于對生活飲用水的抗生素殘留的檢測監(jiān)控。

1 實驗部分

1.1 儀器

TQS三重四極桿串聯(lián)質譜儀（美國Waters公司）、默克supelco固相萃取儀（德國默克）、N-EVAP-24氮吹儀（美國organomation）。

1.2 試劑、耗材

標準品：磺胺甲基嘧啶（99.7%）、磺胺甲噁唑（99.5%）、磺胺二甲嘧啶（99.4%）、磺胺間甲氧嘧啶（94.2%）、甲氧芐氨嘧啶（99.1%）、磺胺間二甲氧嘧啶（99.4%）、四環(huán)素（純度94.2%）、土霉素（96%）、金霉素（92.5%）、恩諾沙星（99.9%）、環(huán)丙沙星（92.3%）、諾氟沙星（97.2%）、氧氟沙星（95.7%）、羅紅霉素（96.2%），所購標準品均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。實驗中所用到的試劑甲醇（色譜純）、甲酸（色譜純）、鹽酸（分析純）等均購自天津市科密歐化學試劑有限公司。

耗材：Waters Oasis PRIME HLB SPE固相萃取柱（美國Waters公司）。

1.3 標準溶液的配制

標準儲備液：分別準確稱取各標準品10.00 mg各置于100 mL容量瓶中，用純甲醇溶解后定容至刻度，單標標準溶液濃度為100.0 μg/mL，于4℃密封保存。

混合標準中間液：分別移取上述五種磺胺類化合物標準儲備液1.00 mL，分別準確移取四環(huán)素類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類標準儲備液5.00 mL置于100 mL容量瓶中，用10%甲醇水定容。其中，磺胺甲基嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、甲氧芐氨嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶單標化合物濃度均為1000 ng/mL；四環(huán)素、土霉素、金霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、羅紅霉素單標化合物濃度均為5000 ng/mL。

混合標準工作液：移取混合標準中間液5.00 mL置于50 mL容量瓶中,用10%甲醇水定容。該溶液磺胺類單標濃度為100 ng/mL,四環(huán)素類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類單標濃度為500 ng/mL。

1.4 儀器工作條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：UPLC BEH C18 Column（1.7 μm，2.1 mm×100 mm），柱溫：40℃，流速：0.2 mL/min，進樣量：5 μL，運行時間：25 min，流動相：A（甲醇）+B（體積分數(shù)0.1%甲酸水溶液），梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相的梯度洗脫程序

1.4.2 質譜條件電離方式

質譜測試參考條件：

a)離子源：電噴霧離子源；

b)掃描方式：正離子模式（ESI+）；

c)檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）；

d)毛細管電壓：2.5 kv；

e)離子源溫度：150℃；

f)脫溶劑溫度：400℃；

g)脫溶劑氣流速：900 L /hr，碰撞氣流速為0.15 mL /min。

表2 各目標分析物的質譜參數(shù)

1.5 樣品前處理方法

室溫下取生活飲用水樣100 mL，加入0.02 g EDTA，加鹽酸調節(jié)pH=3。用Qasis PRIME HLB SPE小柱（500 mg/6 ml）預先用甲醇和水活化后，將上述水樣過柱。5 mL水淋洗后用6 mL～8 mL甲醇洗脫目標組分。將洗脫液氮氣吹干后加1 mL 10%甲醇水溶液復溶，待上機測定。

2 結果與討論

2.1 色譜和質譜條件優(yōu)化

2.1.1 色譜條件優(yōu)化

分別考察了Waters BEH C18和Waters HSS T3兩款液相色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）對抗生素的分離效果，結果顯示當A相采用乙腈作為流動相時，HSS T3色譜柱分離效果更好，而采用甲醇作為流動相時，BEH C18色譜柱分離效果更好。由于乙腈和甲醇相比，毒性更大，價格更高，因此本實驗采用Waters BEH C18色譜柱，甲醇+體積分數(shù)0.1%甲酸水溶液作為流動相，25 min內(nèi)14種目標化合物均可得到良好的分離。

2.1.2 質譜條件優(yōu)化

取上述混合標準工作液分別進樣，進行全掃描確定分子離子峰，然后以分子離子峰為母離子，對其進行轟擊以獲得二次碎裂產(chǎn)生的子離子。將分子離子和2個信號強度適宜的子離子組成監(jiān)測離子對，以多反應檢測模式（MRM）進行定性和定量分析。在此基礎上優(yōu)化了對靈敏度影響較大的碰撞能量和碎裂電壓，從而使特征離子的豐度和比例達到最佳。

2.2 固相萃取柱的選擇

吸附劑的選擇是保證高效萃取效率的基礎。測定水體中的農(nóng)藥一般采用如C18、C8等非極性吸附劑，而親水親脂平衡（HLB）型固相萃取柱，對極性和非極性物質都有很好的回收率和重復性，因此也常被用于類似研究。所以本次實驗對比研究了C18、Oasis PRIME HLB這2種固相萃取小柱對空白水樣加標的萃取回收率。實驗結果表明，Oasis PRIME HLB小柱對14種抗生素均具有較好的回收效果，且重復性更好。可能是C18的填料對于這些化合物吸附性較強，難以洗脫或是這些物質極性較強而對其沒有吸附效果，造成回收效果不理想。因此最終選擇Oasis PRIME HLB作為固相萃取柱。

2.3 洗脫液的確定

實驗對比了乙酸乙酯、乙腈、甲醇三種溶劑的洗脫效果。實驗采取單人六平行加標實驗，取其平均值，計算回收率。結果表明，乙酸乙酯僅對磺胺類化合物的洗脫回收能力較好；乙腈對磺胺類、四環(huán)素類的洗脫回收能力較強；而甲醇對磺胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類抗生素的回收率都比較好，回收率范圍為70%～95%（見圖1），因此，實驗選取甲醇作為洗脫溶劑。

圖1 三種不同洗脫液對實驗回收率的影響

2.4 方法的線性范圍與檢出限

在優(yōu)化實驗條件下，對生活飲用水中14種目標抗生素進行測定，在0.5 ng/mL～100 ng/mL均得到良好的響應和分離，各標物測定的線性范圍如表3所示，相關系數(shù)為0.9978～0.9996，以3倍信噪比（S/N=3）計算方法的檢出限，其結果見表3。

表3 測試14種抗生素線性方程、相關系數(shù)（r2）和方法檢出限

2.5 方法回收率、精密度和重現(xiàn)性

本實驗以家用制備純水和自來水為基底，依據(jù)我國主要流域的抗生素（包括磺胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類）的濃度分布（幾個至上千個ng/L）[20]設計出10倍、20倍、50倍檢出限和1 ug/L四個水平濃度進行加標，加標后按照1.4節(jié)的方法處理，每個濃度水平，各取6個平行樣品，計算各目標抗生素的平均回收率和相對偏差，結果見表4。從結果可以看出，純水中各抗生素的回收率范圍為：70.5%～95.8%，RSD范圍為：1.0%～4.7%，自來水中各抗生素的回收率范圍為：62.0%～86.9%，RSD范圍為：2.0%～6.9%，回收率、RSD均符合分析要求，表明該方法有較好的重現(xiàn)性和準確性，也顯示出本方法對實際生活飲用水中抗生素分析的實用性和有效性。

表4 測試14種抗生素方法回收率和精密度

2.6 水樣儲存介質對方法回收率的影響

在樣品測試過程中發(fā)現(xiàn)，水樣的存放介質對樣品的測試結果有很大的影響。本實驗中以自來水為基底，采用玻璃和塑料兩種介質作為樣品存放容器，按照10倍、20倍、50倍檢出限和1 ug/L四個水平濃度進行加標，加標后各存放3天后，按照1.4節(jié)的方法處理測定，結果如表5。從結果可以看出，存放于塑料容器中的水樣回收較差，甚至出現(xiàn)檢測不出來的情況，而玻璃容器的回收則符合分析要求，結果表明塑料容器對于水樣抗生素有一定的吸附，因此在進行水樣檢測時，對測試水樣應選用玻璃容器存放。

表5 自來水中加標測試回收率（單位：%）

3 結論

本研究采用固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜（SPEUPLC-MS/MS）技術，通過優(yōu)化色譜條件、質譜條件、固相萃取柱類型、洗脫液及水樣存放容器，建立了生活飲用水中4大類14種抗生素同時分析測定方法。所分析的14種抗生素在0.5 ng/mL～100 ng/mL都有較好的線性，相關系數(shù)大于0.99，檢出限0.5 ng/L～5 ng/L，自來水基質加標回收率在62.0%～86.9%，相對標準偏差RSD在2.0%～6.9%，該方法有良好的靈敏度和穩(wěn)定性，為生活飲用水中典型抗生素的分析提供了一種快速、準確可靠的分析方法，也為監(jiān)控我國生活飲用水的抗生素污染水平提供了技術支撐。