王春安，狄生偉，付德昌，鄭 鵬

（1 黑龍江昇太牧業(yè)發(fā)展有限公司，黑龍江 蘭西 151500；2 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

中國是世界第一養(yǎng)豬大國，具有豐富的豬種資源，中國的豬種資源對(duì)世界的養(yǎng)豬生產(chǎn)和豬的育種都具有重要意義。然而由于各種原因，有些地方豬種數(shù)量急劇下降，甚至絕種，因此，亟需加強(qiáng)地方豬種的活體保存及利用生物技術(shù)保存種質(zhì)資源［1-3］。

民豬是中國東北地區(qū)一個(gè)古老的地方豬種，具有產(chǎn)仔多、肉質(zhì)好、抗寒、耐粗飼的突出優(yōu)點(diǎn)［4］，是受保護(hù)的國家級(jí)地方品種?？梢圆捎眉?xì)胞培養(yǎng)技術(shù)從細(xì)胞水平保存民豬這一重要遺傳資源。

利用豬的耳緣組織培養(yǎng)成纖維細(xì)胞是一種操作簡單、常用的方法，為了在動(dòng)物組織塊的再利用、遺傳資源的保存中探索一種新的保存方法，試驗(yàn)在采用植塊法培養(yǎng)民豬耳緣組織成纖維細(xì)胞的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討了組織塊的再培養(yǎng)和冷凍保存后再培養(yǎng)的方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

民豬，為飼養(yǎng)在黑龍江省蘭西縣種豬場（黑龍江昇太牧業(yè)發(fā)展有限公司）內(nèi)的保種種豬，按照飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼喂，自由飲水。按照家系、個(gè)體之間沒有親緣關(guān)系進(jìn)行選擇，共采集45頭民豬耳緣組織。

1.2 主要試劑

DMEM/F-12、胎牛血清（FBS），購自HyClone公司；雙抗，為100×青霉素-鏈霉素溶液，100 mL裝，每毫升含10 000 U 青霉素和10 mg 鏈霉素，Biosharp 公司產(chǎn)品；其他試劑如無特殊說明，均購自Sigma公司。

細(xì)胞培養(yǎng)基：DMEM/F-12+15%FBS+1%雙抗（10 mg/mL的青霉素和鏈霉素）。消化液：0.25%胰蛋白酶（Amresco）。細(xì)胞凍存液：DMEM/F-12+15%FBS+10%二甲基亞砜（DMSO）+1%雙抗。

1.3 耳緣組織采集

保定豬只，用75%酒精棉擦洗采樣部位，用耳號(hào)鉗在原有耳缺的部位剪下1塊耳組織，放入添加2%雙抗的PBS 的離心管內(nèi)搖晃、清洗；然后將組織塊移入有75%酒精的離心管內(nèi)涮洗10 s 消毒；再將組織塊移入2%雙抗的PBS中搖晃清洗，去除殘余酒精；最后將組織塊放入含2%雙抗的PBS的離心管中，置于4 ℃采樣箱內(nèi)，送回實(shí)驗(yàn)室。

1.4 組織塊處理

將運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室的組織塊移入75%酒精中浸泡10 s進(jìn)行初步滅菌；隨后用含2%雙抗的PBS清洗；將組織塊移入玻璃皿中，用滅菌手術(shù)刀將毛發(fā)充分刮凈，用含2%雙抗的PBS 清洗后，再次將組織塊移入75%酒精中浸泡10 s；再用含2%雙抗的PBS 清洗，去除殘余酒精；將組織塊移入加有培養(yǎng)液的玻璃皿中。

1.5 組織塊的植塊培養(yǎng)

用滅菌眼科剪將組織塊剪成1 mm3塊，用培養(yǎng)液清洗組織塊后浸泡在培養(yǎng)液內(nèi)；用牙簽或鑷子將剪碎的組織塊擺到新的60 mm 培養(yǎng)皿內(nèi)，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中；過夜培養(yǎng)后，組織塊牢固地貼在底壁上，加入新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；每2～3 d 換一次培養(yǎng)液，直到細(xì)胞生長至90%；采用胰酶進(jìn)行消化，傳代。

1.6 組織塊的再培養(yǎng)

將1.5中組織塊生長出的細(xì)胞進(jìn)行消化、傳代后，剩余的組織塊用培養(yǎng)液清洗一遍，將組織塊擺到新的60 mm 培養(yǎng)皿內(nèi)，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，重新進(jìn)行植塊法培養(yǎng)；過夜培養(yǎng)后，組織塊牢固地貼在底壁上，再加入新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；每2～3 d換一次培養(yǎng)液。

1.7 組織塊冷凍后的再培養(yǎng)

將1.5中的組織塊生長出的細(xì)胞進(jìn)行消化、傳代后，將剩余的組織塊用培養(yǎng)液清洗一遍，15～20 個(gè)組織塊加入1.5 mL 冷凍液，移入1.8 mL凍存管內(nèi)，將凍存管放入細(xì)胞凍存盒內(nèi)，置于-80 ℃冰箱內(nèi)過夜，然后置于液氮內(nèi)保存。冷凍保存20 d后，用37 ℃溫水解凍，用培養(yǎng)液對(duì)組織塊進(jìn)行清洗，再按照1.6 的方法重新進(jìn)行植塊法培養(yǎng)。

1.8 細(xì)胞的傳代培養(yǎng)與生長曲線繪制

當(dāng)組織塊法培養(yǎng)的細(xì)胞長滿皿底后，用胰酶進(jìn)行消化、傳代，觀察細(xì)胞的生長形態(tài)。選擇第二代的成纖維細(xì)胞，用胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/mL，用96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，每孔接種100 μL，每2 d 換液1 次，每24 h 計(jì)數(shù)1 次，每次每組取3 孔，每孔計(jì)數(shù)3 次，求平均值。以細(xì)胞密度（個(gè)/mL）為縱坐標(biāo)、培養(yǎng)天數(shù)（d）為橫坐標(biāo)繪制生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 植塊法培養(yǎng)成纖維細(xì)胞

新鮮豬耳緣皮膚組織貼壁5 d后，可見組織塊周圍有細(xì)胞游離出來并貼壁生長，細(xì)胞呈圓形、梭形、三角形等形態(tài)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，組織塊周圍的細(xì)胞生長速度增加。除成纖維細(xì)胞外，還可以見到上皮細(xì)胞、圓形細(xì)胞，其中上皮細(xì)胞圍繞組織塊，緊靠組織塊生長，成纖維細(xì)胞迅速向外周生長，并逐漸成為優(yōu)勢(shì)生長的細(xì)胞（見圖1A）。培養(yǎng)15 d后，細(xì)胞逐漸鋪滿皿底（圖1B），可以進(jìn)行傳代培養(yǎng)。利用此種方法，培養(yǎng)了45 頭民豬的成纖維細(xì)胞。

圖1 新鮮組織塊經(jīng)植塊法培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞

2.2 成纖維細(xì)胞的傳代

成纖維細(xì)胞長滿皿底后可以進(jìn)行傳代，利用成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞對(duì)胰酶敏感性的不同來控制消化時(shí)間，將成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞分開。當(dāng)成纖維細(xì)胞已經(jīng)脫離皿底、而上皮細(xì)胞沒有脫離時(shí)，終止消化（見圖2），然后收集成纖維細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存或傳代。

圖2 植塊法培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的消化

2.3 組織塊的再培養(yǎng)

新鮮的組織塊進(jìn)行植塊法培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，當(dāng)組織塊周圍長滿細(xì)胞后，進(jìn)行消化、吹打，然后將組織塊用培養(yǎng)液清洗一遍，重新進(jìn)行植塊法培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后，可見組織塊周圍已經(jīng)有成纖維細(xì)胞生長（見圖3A），隨著時(shí)間的增長，組織塊周圍的細(xì)胞逐漸增多（見圖3B）。

圖3 生長出細(xì)胞的組織塊的再植塊培養(yǎng)

2.4 組織塊冷凍后再培養(yǎng)

新鮮的組織塊進(jìn)行植塊法培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，當(dāng)組織塊周圍長滿細(xì)胞后進(jìn)行消化、吹打，然后將組織塊用培養(yǎng)液清洗一遍，按照冷凍細(xì)胞的方法進(jìn)行冷凍；冷凍20 d 后解凍，用培養(yǎng)液清洗一遍，重新進(jìn)行植塊法培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后，可見組織塊周圍已經(jīng)有成纖維細(xì)胞生長，隨著時(shí)間的增長，組織塊周圍的細(xì)胞逐漸增多（見圖4）。

2.5 不同處理對(duì)組織塊的細(xì)胞生長的影響

見表1。

表1 不同處理對(duì)組織塊的細(xì)胞生長的影響（n=5）

試驗(yàn)經(jīng)過采用新鮮組織塊直接培養(yǎng)、長出細(xì)胞的組織塊再培養(yǎng)、長出細(xì)胞的組織塊冷凍后再培養(yǎng)，結(jié)果表明，組織塊再培養(yǎng)、組織塊冷凍后再培養(yǎng)后長出細(xì)胞時(shí)間和細(xì)胞傳代時(shí)間都比新鮮組織塊提前2 d，而且組織塊再培養(yǎng)時(shí)污染比率明顯低于新鮮組織塊。

2.6 成纖維細(xì)胞的傳代培養(yǎng)與生長曲線

3 種培養(yǎng)方法獲得的成纖維細(xì)胞經(jīng)過消化傳代后進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長，形態(tài)正常（見圖5），增殖4～5 d后長滿皿底。細(xì)胞生長曲線顯示，細(xì)胞增殖正常（見圖6）。

圖5 成纖維細(xì)胞傳代后進(jìn)行培養(yǎng)

圖6 成纖維細(xì)胞的增殖曲線

3 討論

3.1 植塊法培養(yǎng)成纖維細(xì)胞

利用組織塊法培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，是多種動(dòng)物耳皮膚組織成纖維細(xì)胞較理想的培養(yǎng)方法，本試驗(yàn)采用這種方法成功獲得民豬的耳皮膚組織成纖維細(xì)胞。利用組織塊法培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，不同的研究者報(bào)道生長出細(xì)胞的時(shí)間是不一致的，細(xì)胞長出時(shí)間與所用方法、培養(yǎng)條件、豬品種和年齡都有關(guān)系［5-8］。在培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的過程中，通常還會(huì)有上皮細(xì)胞生長，除形態(tài)不同外，兩種細(xì)胞對(duì)胰酶的敏感性不同，在消化過程中利用上皮細(xì)胞不容易消化的特性將成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞分開，經(jīng)過2～3次傳代就能將上皮細(xì)胞完全剔除。

3.2 組織塊的再利用

利用組織塊培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長滿皿底之后進(jìn)行消化，通常只收集成纖維細(xì)胞，而對(duì)于組織塊通常都丟棄了［9-10］。在本試驗(yàn)中，將組織塊再次植塊培養(yǎng)、進(jìn)行冷凍后再植塊培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)組織塊再培養(yǎng)后仍然能長出細(xì)胞，而且長出細(xì)胞時(shí)間比新鮮組織塊長出細(xì)胞時(shí)間提前1～2 d?？赡艿脑蚴?，新鮮組織塊離體后進(jìn)行培養(yǎng)，需要一個(gè)對(duì)外部的環(huán)境適應(yīng)的過程；而組織塊再培養(yǎng)時(shí)組織塊已經(jīng)適應(yīng)了環(huán)境，組織塊內(nèi)的成纖維細(xì)胞具備了在培養(yǎng)皿內(nèi)不斷分裂增殖的特性。利用組織塊的再培養(yǎng)法可以在組織塊數(shù)量有限的條件下獲取大量細(xì)胞。然而對(duì)于組織塊能夠培養(yǎng)利用多少次、組織塊內(nèi)是否存在皮膚干細(xì)胞等問題還需要進(jìn)一步確認(rèn)。

3.3 細(xì)菌的污染

組織塊法培養(yǎng)成纖維細(xì)胞面臨的最大問題就是污染問題［3］。豬的耳組織表面經(jīng)常和外界環(huán)境接觸，尤其是畜舍環(huán)境較差時(shí)耳組織上會(huì)有很多污染源存在。在取樣時(shí)如果擦洗、消毒不徹底，常常會(huì)導(dǎo)致下一步的細(xì)胞污染。前期試驗(yàn)污染較嚴(yán)重，后期要求飼養(yǎng)員采集樣品時(shí)徹底擦洗豬耳表面的附著物，同時(shí)將PBS 清洗液中雙抗的濃度提高到5%，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后刮干凈表面的毛發(fā)再進(jìn)行一次酒精消毒和清洗。經(jīng)過這樣的處理，組織塊污染的情況幾乎不會(huì)發(fā)生。另外組織塊再培養(yǎng)過程中沒有發(fā)生污染的情況，主要是因?yàn)榍捌诮?jīng)過處理和培養(yǎng)，組織塊是無菌的，繼續(xù)在無菌條件下培養(yǎng)就不會(huì)發(fā)生污染。因此，利用組織塊的再培養(yǎng)不僅可以擴(kuò)大細(xì)胞來源，還可以更好地避免細(xì)胞培養(yǎng)中的污染問題。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)采用植塊法培養(yǎng)了45頭民豬耳緣組織的成纖維細(xì)胞，成功建立了一種組織塊再培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)方法。