藺姝祺 趙琦 曹慧 楊宇 趙曉曦

耳聾是嚴(yán)重影響人類健康和生活質(zhì)量的疾病之一，遺傳因素在其發(fā)病中占有重要位置。大約 80%遺傳性耳聾為非綜合征型[1]。近期，國(guó)內(nèi)開(kāi)展的大規(guī)模耳聾分子流行病學(xué)研究表明，相當(dāng)一部分非綜合征性耳聾由為數(shù)不多的幾個(gè)基因引起，如 GJB2 基因、SLC26A4 基因、12SrRNA基因以及GJB3 基因等[2]。

目前，國(guó)內(nèi)一些地方已開(kāi)展利用遺傳性耳聾基因檢測(cè)試劑盒，對(duì)新生兒進(jìn)行耳聾基因篩查[3]，這一工作對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)患者和攜帶者有重要意義。但新生兒篩查是在孩子出生后進(jìn)行的檢查，聾兒出生后沒(méi)有根治的方法，只能是對(duì)癥治療，對(duì)預(yù)防聾兒出生并沒(méi)有起到真正作用。

市場(chǎng)上常用的遺傳性耳聾基因檢測(cè)試劑盒，主要是針對(duì)GJB2 基因、SLC26A4 基因、12SrRNA基因、GJB3 基因進(jìn)行檢測(cè)。

臨床上抽取羊水主要是為了診斷胎兒的染色體病。為了使羊水細(xì)胞生長(zhǎng)的更旺盛，通常在收獲羊水細(xì)胞前需要更換培養(yǎng)基，為了防止在制備染色體核型標(biāo)本中發(fā)生失敗，通常將換液時(shí)舊培養(yǎng)基放在另一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，等胎兒染色體分析完成后，這個(gè)培養(yǎng)物通常被廢棄。那么是否可以利用這部分羊水細(xì)胞進(jìn)行胎兒耳聾基因檢測(cè)是本研究所要探討的問(wèn)題。如果能夠利用這部分羊水細(xì)胞進(jìn)行胎兒耳聾基因的檢測(cè)，對(duì)于防止耳聾患兒出生，早期發(fā)現(xiàn)耳聾基因攜帶者將起重要作用，而且對(duì)于充分利用胎兒遺傳物質(zhì)對(duì)胎兒遺傳病篩查和診斷將有重要意義。

對(duì)象和方法

1.對(duì)象：選取2019年6月至2019年7月間在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科進(jìn)行羊水穿刺查胎兒染色體孕婦作為研究對(duì)象。入組標(biāo)準(zhǔn)為因母體血清篩查高風(fēng)險(xiǎn)和高齡孕婦(年齡大于35歲患者)，且無(wú)明顯其他疾病史，胎兒染色體核型正常；排除標(biāo)準(zhǔn)為胎兒超聲異常，或有明顯遺傳病病史的孕婦。

2.羊水細(xì)胞的收集：用吸管輕輕刮出培養(yǎng)瓶上的羊水細(xì)胞，將其與培養(yǎng)液一起吸入離心管，1 500轉(zhuǎn)/5分鐘離心。

3.羊水細(xì)胞DNA提取和含量檢測(cè)：選用深圳亞能生物科技有限公司提供的DNA試劑盒，按照試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行操作提取羊水標(biāo)本中DNA，用分光光度法檢測(cè)標(biāo)本DNA含量。

選用深圳亞能生物科技有限公司生產(chǎn)的遺傳性耳聾基因檢測(cè)試劑盒，按照試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行操作。通過(guò)對(duì)DNA的擴(kuò)增、雜交顯色，判斷待測(cè)標(biāo)本是否存在耳聾相關(guān)的基因的突變。

該試劑盒主要檢測(cè)4個(gè)常見(jiàn)的遺傳性耳聾基因的16個(gè)突變位點(diǎn)，包括GJB2基因的四個(gè)突變位點(diǎn)(35del G、176-191del 16、235del C、299-300del AT)，GJB3基因的兩個(gè)突變位點(diǎn)(538C>T、547G>A)，SLC26A4基因的八個(gè)突變位點(diǎn)(IVS7-2A>G、2168A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、IVS15+5G>A、1975G>C、2027T)，12SrRNA基因的兩個(gè)位點(diǎn)(1494C>T、1555A>G)，通過(guò)DNA反向雜交位點(diǎn)顯色，判斷相應(yīng)位點(diǎn)的突變情況。圖1顯示在模條上各基因位點(diǎn)的位置。

圖1 耳聾基因檢測(cè)模條各基因位點(diǎn)圖

結(jié)果

1.羊水標(biāo)本的DNA含量：16個(gè)羊水DNA標(biāo)本含量見(jiàn)表1，標(biāo)本8沒(méi)有提取到足夠DNA。

表1 16個(gè)羊水DNA標(biāo)本含量

2.耳聾基因的檢測(cè)結(jié)果：對(duì)15個(gè)羊水標(biāo)本和1個(gè)已知遺傳性耳聾基因攜帶者外周血標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，16個(gè)標(biāo)本均可顯示清晰的雜交斑點(diǎn)。在15個(gè)羊水標(biāo)本中，6號(hào)標(biāo)本為GJB2 基因突變(235del C突變)雜合子。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 6號(hào)標(biāo)本的遺傳性耳聾基因檢測(cè)結(jié)果

討論

本研究結(jié)果顯示，利用染色體核型分析后剩余羊水標(biāo)本可以提取足夠的DNA進(jìn)行耳聾基因檢測(cè)。這一研究結(jié)果對(duì)于以后開(kāi)發(fā)和利用染色體核型分析后剩余羊水標(biāo)本對(duì)胎兒遺傳病進(jìn)行篩查和診斷有重要意義。

GJB2基因，常染色體隱性遺傳。GJB2 基因突變主要導(dǎo)致先天性非綜合征性耳聾。GJB2基因的編碼產(chǎn)物Cx26蛋白對(duì)維持耳內(nèi)正常滲透壓和聽(tīng)覺(jué)生理有著極其重要的作用[4]。GJB2基因的致聾機(jī)制主要是各種突變所致的Cx26結(jié)構(gòu)和定位異常，從而導(dǎo)致蛋白通道的功能異常[4]。

SLC26A4基因，常染色體隱性遺傳。SLC26A4 基因與大前庭水管綜合征(enlarged vestibular aqueduct syndrome,EVAS)和Pendred氏綜合征密切相關(guān)[5]。SLC26A4基因編碼產(chǎn)生Pendrin蛋白，表達(dá)于內(nèi)耳、甲狀腺和腎臟，SLC26A4基因突變導(dǎo)致Pendrin蛋白的合成和功能的異常，引起前庭水管擴(kuò)大，使耳蝸前庭的內(nèi)環(huán)境容易受到顱內(nèi)壓的影響，最終導(dǎo)致內(nèi)耳毛細(xì)胞受損，聽(tīng)神經(jīng)萎縮，造成聽(tīng)覺(jué)障礙[6]。

12SrRNA基因是線粒體基因，母系遺傳，與氨基糖苷類藥物敏感性耳聾密切相關(guān),該基因突變可改變線粒體DNA空間結(jié)構(gòu),形成與氨基糖苷類藥物作用的結(jié)合位點(diǎn),二者結(jié)合后阻礙線粒體核糖體蛋白質(zhì)的合成、抑制ATP合成,K+、Na+、Ca2+離子泵喪失功能,最終因聽(tīng)毛細(xì)胞逐漸死亡而引起不可逆性耳聾[7]。

GJB3基因，常染色體顯性或隱性遺傳性耳聾，與后天高頻感音神經(jīng)性耳聾有關(guān)[8]。GJB3基因突變使縫隙連接蛋白Cx31結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，最終導(dǎo)致后天高頻感音神經(jīng)性耳聾[9]。間隙連接蛋白在耳蝸Corti氏器的K+循環(huán)通路中至關(guān)重要，GJB3基因突變導(dǎo)致其編碼的Cx31蛋白在細(xì)胞膜上丟失，導(dǎo)致K+循環(huán)被破壞,使Corti氏器局部K+濃度過(guò)高，發(fā)生鉀中毒,最終導(dǎo)致耳聾[9]。

羊水中的細(xì)胞主要來(lái)源于胎兒皮膚和黏膜的脫落細(xì)胞，在這些細(xì)胞中僅有少量活細(xì)胞，因此在制備染色體標(biāo)本時(shí)需要對(duì)羊水細(xì)胞進(jìn)行1周左右的培養(yǎng)，讓少量活細(xì)胞增殖達(dá)到一定數(shù)量時(shí)才能制備染色體核型標(biāo)本,羊水細(xì)胞以貼壁方式增殖[10]。在培養(yǎng)液中僅有少量的活細(xì)胞，本研究將這部分細(xì)胞放入另一個(gè)培養(yǎng)瓶中，少量的活細(xì)胞又可以增殖、貼壁。本研究主要是從第二次貼壁羊水細(xì)胞中提取DNA。在從培養(yǎng)瓶上刮出貼壁細(xì)胞前，都在倒置顯微鏡下觀察到有細(xì)胞增殖的克隆。在16個(gè)標(biāo)本中，有15個(gè)標(biāo)本都提取到了一定量的DNA，有一個(gè)標(biāo)本沒(méi)有提取到足夠DNA。導(dǎo)致沒(méi)有提取到足夠DNA的可能的原因有以下兩個(gè)方面：(1)細(xì)胞增殖不夠充分，活細(xì)胞量少；(2)在DNA提取過(guò)程中有操作失誤。在今后的研究中，可以通過(guò)評(píng)估細(xì)胞增殖的克隆數(shù)來(lái)選取提取羊水細(xì)胞DNA的時(shí)機(jī)，提高提取DNA的成功率。

本研究主要是通過(guò)商業(yè)化的遺傳性耳聾基因檢測(cè)試劑盒對(duì)常見(jiàn)的四種耳聾基因進(jìn)行檢測(cè)，這四種耳聾基因遺傳方式明確，耳聾基因致病機(jī)制復(fù)雜，到目前為止對(duì)于遺傳性耳聾沒(méi)有根治的方法。如果在行胎兒染色體檢查時(shí)，同時(shí)對(duì)耳聾基因進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)減少聾兒出生的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有重要意義。

志謝：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科遺傳室武艾寧、于榮鑫和萬(wàn)驍文老師