許 皓，劉建榮，倪 佳，任 飛，王力欣，王 崢，劉 瑩

吉林特研生物技術(shù)有限責(zé)任公司,吉林長(zhǎng)春 130122

綠膿桿菌是能夠引起急性、高度傳染性疾病的、可以導(dǎo)致水貂出血性肺炎的一種細(xì)菌。本菌革蘭氏染色呈陰性，單個(gè)、成雙或短鏈狀存在，能單向運(yùn)動(dòng)，無(wú)芽孢，能形成莢膜，能分泌綠膿菌素和熒光素。采用日本血清分型系統(tǒng)將綠膿桿菌分為A～N 14種血清型。近年來(lái)，我國(guó)山東省、河北省、黑龍江省、吉林省等地主要的水貂養(yǎng)殖地區(qū)持續(xù)暴發(fā)流行水貂出血性肺炎，對(duì)水貂的致病力往往是致死性的，造成水貂嚴(yán)重的出血性肺炎，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究對(duì)2013～2016年不同省份病料的采集，進(jìn)行了細(xì)菌分離鑒定和相關(guān)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明綠膿桿菌G、B、I是最流行的血清型，是導(dǎo)致養(yǎng)殖場(chǎng)水貂大規(guī)模死亡的原因。

1 材料

1.1 菌株

綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853為杭州天和微生物試劑有限責(zé)任公司的產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

18～20日齡SPF級(jí)ICR小鼠，購(gòu)自長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 主要試劑

綠膿桿菌分型血清為日本生研株式會(huì)社的產(chǎn)品；瓊脂（Agar）均為Sigma-Aldrich公司的產(chǎn)品；蛋白胨、酵母粉均為英國(guó)OXOID公司的產(chǎn)品；NaCl為廣東光華科技股份有限公司的產(chǎn)品；PCR反應(yīng)預(yù)混液Ex Taq? 為生工生物工程（上海）股份有限公司的產(chǎn)品；生化鑒定管、藥敏片為杭州濱河微生物試劑有限公司的產(chǎn)品。

1.4 主要儀器

超凈工作臺(tái)（SW.CJ.2FD）購(gòu)自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備公司；空氣恒溫?fù)u床（KYC111）購(gòu)自上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PCR儀（T100TM Thermal Cycler）購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；電熱恒溫水槽（DK-8D）購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；隔水式培養(yǎng)箱（BG-160）購(gòu)自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；光學(xué)正置顯微鏡（Axio Lab. A1）購(gòu)自卡爾蔡司公司。

2 方法

2.1 病料采集與細(xì)菌分離

423 份病料樣品來(lái)自2013～2016年山東省、河北省、黑龍江省、吉林省的82個(gè)水貂群，包括大、中、小型養(yǎng)殖場(chǎng)和各種類型的農(nóng)村散養(yǎng)戶。發(fā)病水貂多表現(xiàn)為呼吸困難、鼻孔流血、突發(fā)性死亡等癥狀。采集患病水貂肺組織，用無(wú)菌剪刀在肺組織剪開(kāi)一個(gè)切口，將接種環(huán)深入切口內(nèi)取樣，劃線接種于PYG平板，37 ℃培養(yǎng)18～24 h后觀察，挑取各種優(yōu)勢(shì)菌落傳代純化。

2.2 細(xì)菌培養(yǎng)

將采集的肺臟病料組織劃線接種于PYG平板上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h后挑取疑似菌落進(jìn)行傳代純化，再培養(yǎng)18～24 h后觀察菌落形態(tài)。同時(shí)，分別挑取3～5個(gè)單菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，觀察菌體形態(tài)特征。

2.3 細(xì)菌PCR鑒定及分型

2.3.1 PCR引物

采用通用引物擴(kuò)增16SrRNA基因，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。對(duì)疑似的綠膿桿菌菌株進(jìn)行PCR鑒定。本實(shí)驗(yàn)所用PCR引物詳見(jiàn)表1。

表1 本試驗(yàn)所用PCR引物

2.3.2 模板的制備

用擴(kuò)增的純化菌液，取1 mL加入1.5 mL離心管中，以10000 r/min離心10 min，棄上清液，加入100 μL ddH20混勻，煮沸15 min，12000r/min再離心15 min，取上清液即為模板。

2.3.3 PCR擴(kuò)增

反應(yīng)體系（40 μL）：PCR反應(yīng)預(yù)混液Ex Taq?20 μL，無(wú)菌水18 μL，10 pmol/L上、下游引物各0.5 μL ，細(xì)菌基因組模板1 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃變性5 min；30個(gè)循環(huán)，94 ℃變性40 s、56 ℃退火50 s、72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸10 min，降溫至4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上120 V電泳分離25 min，核酸染料染色，凝膠成像系統(tǒng)照相后觀察分析。綠膿桿菌的PCR產(chǎn)物，由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，并對(duì)測(cè)序結(jié)果應(yīng)用在線生物學(xué)軟件，進(jìn)行NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜索比對(duì)分析。

2.3.4 綠膿桿菌血清型分型

將綠膿桿菌菌種復(fù)蘇后分別用接種環(huán)劃線接種于PYG平板，置37 ℃培養(yǎng)18 h。各挑取單菌落再次分別劃線接種于PYG平板，置37 ℃培養(yǎng)18 h，各用5 mL生理鹽水將平板上的菌落洗下，制備成濃度均一的凝集原（菌數(shù)為8×109CFU/mL），2～8 ℃保存?zhèn)溆谩?zhǔn)備潔凈的載玻片，用記號(hào)筆分區(qū)標(biāo)記后，取20 μL制備的綠膿桿菌凝集原滴于載玻片上，再取待檢的水貂血清（簡(jiǎn)稱待檢血清）20 μL置于凝集原上，同時(shí)取20 μL綠膿桿菌凝集原加20 μL生理鹽水作為陰性對(duì)照，取20 μL綠膿桿菌凝集原加20 μL綠膿桿菌抗水貂陽(yáng)性血清（玻片凝集反應(yīng)至少出現(xiàn)“+++”）作為陽(yáng)性對(duì)照，用槍頭將凝集原和待檢血清混合，在30～60 s內(nèi)用肉眼觀察結(jié)果。

2.4 綠膿桿菌的小鼠毒力試驗(yàn)

對(duì)63株G、B、I型綠膿桿菌進(jìn)行了小鼠半數(shù)致死劑量（50% Lethal Dose, LD50）的測(cè)定。

2.5 生化鑒定

按照文獻(xiàn)[3]采用細(xì)菌生化鑒定管對(duì)純培養(yǎng)物進(jìn)行生化鑒定，接種后的發(fā)酵管置于隔水式培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18～24 h，統(tǒng)計(jì)生化試驗(yàn)結(jié)果。

2.6 藥敏試驗(yàn)

按照K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)及結(jié)果的判斷。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌的形態(tài)與培養(yǎng)特性

綠膿桿菌在培養(yǎng)基上形成圓形、稍平、邊緣不整齊或者呈波浪狀、藍(lán)綠色的菌落，有獨(dú)特的芳香氣味；革蘭染色、鏡檢，分離菌株為革蘭陰性小桿菌，單個(gè)散在或成對(duì)出現(xiàn)（見(jiàn)圖1）。

圖1 綠膿桿菌菌落形態(tài)及鏡下形態(tài)

3.2 PCR鑒定結(jié)果

對(duì)分離菌株16 SrRNA 基因進(jìn)行擴(kuò)增，均擴(kuò)增出大小為1421、1418 bp的DNA條帶（見(jiàn)圖2）。將分離菌株所測(cè)16SrRNA基因序列與GenBank中已收錄核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性檢索，經(jīng)比對(duì)后確定菌株為綠膿桿菌，分別與登錄號(hào)HQ641264.1、KF977858.1的綠膿桿菌16SrRNA序列同源性均為99%。

圖2 綠膿桿菌的PCR控增結(jié)果

3.3 綠膿桿菌血清型分型

按綠膿桿菌血清型分型方法對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定，各血清型菌株均能與對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)（見(jiàn)圖3）。

圖3 綠膿桿菌分型結(jié)果

3.4 G、B、I型綠膿桿菌的小鼠毒力試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)對(duì)63株綠膿桿菌的小鼠毒力試驗(yàn)結(jié)果，篩選出小鼠毒力試驗(yàn)中表現(xiàn)毒力最強(qiáng)的12株綠膿桿菌（4株G型、4株B型、4株I型）（見(jiàn)表2），標(biāo)記為1～12號(hào)菌株。

表2 12株綠膿桿菌的小鼠毒力試驗(yàn)結(jié)果

3.5 生化鑒定

生化試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表3）表明，綠膿桿菌3種血清型12個(gè)菌株的十六烷三甲基溴化銨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)、明膠液化、硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)、42 ℃生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性；綠膿菌素、氧化酶、乙酰胺培養(yǎng)基生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果存在差異，同一血清型的不同菌株之間也存在明顯差異。

表3 12株綠膿桿菌的生化鑒定結(jié)果

表4 12株綠膿桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

綠膿桿菌是引起水貂出血性肺炎的重要病原之一，水貂感染該菌后，以出血性肺炎和敗血癥為主要特征，發(fā)病急、死亡快，常呈地方性暴發(fā)，發(fā)病貂死亡率在10%～50%[4,5]。隨著我國(guó)養(yǎng)殖毛皮動(dòng)物的發(fā)病率持續(xù)上升，給毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。日本的Homma（1976）根據(jù)O抗原將綠膿桿菌分為A～N的14個(gè)血清型，生研公司根據(jù)該系統(tǒng)生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清試劑盒被廣泛應(yīng)用于綠膿桿菌的血清學(xué)分析。白雪[6]等人于2011年采用日本生研公司的血清學(xué)分型系統(tǒng)對(duì)從各地患有出血性肺炎的水貂中分離到的45株綠膿桿菌進(jìn)行了血清型分析，結(jié)果表明42株為G型，2株為B型，1株為I型，G型占93%，為主要流行血清型；丹麥的Hammer等人于2003年對(duì)72株貂源綠膿桿菌進(jìn)行了血清型分析，其中75%為G型、8%為B型、C型占17%。本研究結(jié)果表明：引起水貂出血性肺炎的綠膿桿菌分離株主要血清型是G、B型，I型次之，這與白雪、Hammer等人研究結(jié)果一致。

本研究通過(guò)小鼠毒力試驗(yàn)篩選出12株毒力較強(qiáng)的菌株，進(jìn)行了生化試驗(yàn)及藥敏試驗(yàn)。生化試驗(yàn)結(jié)果表明：12株菌株的十六烷三甲基溴化銨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)、明膠液化、硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)、42 ℃生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性；綠膿菌素、氧化酶、乙酰胺培養(yǎng)基生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果存在差異，同一血清型的不同菌株之間也存在明顯差異。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明：12株菌株對(duì)強(qiáng)力霉素、林可霉素均耐藥；對(duì)阿米卡星為敏感；對(duì)慶大霉素、阿莫西林、氨芐西林、新霉素均為耐藥或介于中間；對(duì)環(huán)丙沙星、諾氟沙星、青霉素G、鏈霉素、多粘菌素B、四環(huán)素的敏感性不同；對(duì)氧氟沙星為敏感或介于中間，這可能與養(yǎng)殖場(chǎng)大量不合理地使用抗生素有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

本研究對(duì)所分離到菌株的菌體形態(tài)、血清型、生化特性、藥物敏感性等生物學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定，為進(jìn)一步客觀評(píng)估水貂出血性肺炎的危害及其綜合防控提供參考依據(jù)。