張水冰，李 穎，趙思怡，黃 帆，海那爾·烏拉孜巴依，丘明旺，方婉儀，姚 琳，張茂祥

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510405）

腰椎間盤(pán)突出癥（lumbar disc herniation，LDH）是由于纖維環(huán)無(wú)法限制椎間盤(pán)內(nèi)容物即髓核的突破，進(jìn)而壓迫腰椎神經(jīng)根和硬膜囊，早期引起腰痛繼而可能發(fā)展為坐骨神經(jīng)痛的腰椎間盤(pán)退行性異常綜合征［1］。近年有研究表明，腰椎間盤(pán)突出癥的發(fā)病率居于椎管疾病的第一位［2］。在英國(guó)每年約有三分之一的人受腰痛折磨［3］。但是目前關(guān)于腰椎間盤(pán)突出癥的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，其臨床主要表現(xiàn)為腰痛、腿痛、神經(jīng)功能障礙等癥狀［3-4］。中醫(yī)認(rèn)為腰椎間盤(pán)突出癥屬于“筋病”、“腰痛”、“痹癥”的領(lǐng)域，最早見(jiàn)于《素問(wèn)·脈要精微論》：“腰者腎之府，轉(zhuǎn)搖不能，腎將憊矣”，《素問(wèn)·五常政大論》也有相關(guān)論述“濕氣下臨，腎氣上從，當(dāng)其時(shí)反腰椎痛，動(dòng)搖不便也”。

當(dāng)歸四逆湯（Danggui-Sini Decoction，DSD）自于張仲景所著的《傷寒論》，其條文分別在辨厥陰病篇和附篇《辨不可下并脈證并治第二十》中記載。當(dāng)歸四逆湯由當(dāng)歸三兩、桂枝三兩(去皮)、芍藥二兩、甘草二兩(炙)、細(xì)辛三兩、通草二兩、大棗二十五枚(擘)組成，主要功效為溫通經(jīng)脈、驅(qū)散內(nèi)寒、調(diào)養(yǎng)精血［5］。現(xiàn)代研究中當(dāng)歸四逆湯具有治療糖尿病周?chē)窠?jīng)病變、冠心病、消化性潰瘍、肩周炎、頸椎病、血栓閉塞性脈管炎、雷諾氏病、痹癥等疾病的功效［6-8］。臨床觀察顯示，當(dāng)歸四逆湯對(duì)治療腰椎間盤(pán)突出癥有著明顯作用［9-12］。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)主要研究藥物作用靶點(diǎn)、功能及作用通路以推斷出藥物所能達(dá)到的理想療效和作用機(jī)理。中藥復(fù)方涉及多種藥物，通過(guò)藥物靶點(diǎn)之間的共同作用達(dá)到療效。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的給藥思路和中藥的復(fù)方給藥本質(zhì)殊途同歸，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以幫助了解當(dāng)歸四逆湯作用于腰椎間盤(pán)突出癥的機(jī)制,并為腰椎間盤(pán)突出癥新療法的開(kāi)發(fā)探索提供思路。

1 材料與方法

1.1 當(dāng)歸四逆湯作用靶點(diǎn)的獲取

當(dāng)歸四逆湯方由當(dāng)歸、桂枝、白芍、甘草、細(xì)辛、通草、大棗七味藥物組成。通過(guò)檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP ；https://tcmspw.com/）和中藥潛在靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)（the petental target data base of traditional Chinese medicine，TCM-PTD ；http://tcm.zju.edu.cn/），找到當(dāng)歸四逆湯的活性成分，并根據(jù)藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、藥物相似性（drug likeness，DL）≥0.18的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，得到當(dāng)歸四逆湯的有效活性成分。

在TCMSP中檢索有效活性成分相關(guān)靶點(diǎn)。將得到的當(dāng)歸四逆湯作用靶點(diǎn)與UniProt（https://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)中的靶點(diǎn)名稱(chēng)相匹配，得到作用靶點(diǎn)名簡(jiǎn)稱(chēng)。

1.2 腰椎間盤(pán)突出癥相關(guān)作用靶點(diǎn)獲取及篩選

人類(lèi)基因GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.genecards.org/）能提供靶點(diǎn)、靶點(diǎn)與疾病的關(guān)系等多種信息。孟德?tīng)柤膊』騉MIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https://omim.org/）含有已知的孟德?tīng)柤膊　?5 000條基因信息和人類(lèi)關(guān)注的表型和基因型之間的關(guān)系。在GenCards數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中以“l(fā)umbar disc herniation”、“LDH”為關(guān)鍵詞檢索與腰椎間盤(pán)突出癥相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，并除去重復(fù)數(shù)據(jù)。

1.3 當(dāng)歸四逆湯作用于腰椎間盤(pán)突出癥的潛在作用靶點(diǎn)的獲取

為明確腰椎間盤(pán)突出癥疾病相關(guān)靶點(diǎn)與當(dāng)歸四逆湯復(fù)方潛在靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，將腰椎間盤(pán)突出癥靶點(diǎn)與當(dāng)歸四逆湯潛在靶點(diǎn)進(jìn)行交集，以獲取藥物疾病共同作用靶點(diǎn)。利用 ClusterProfiler R 語(yǔ)言編程軟件繪制Venn圖，得到當(dāng)歸四逆湯作用于腰椎間盤(pán)突出癥的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 藥物活性成分-靶蛋白-疾病共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將當(dāng)歸四逆湯作用于腰椎間盤(pán)突出癥的潛在作用靶點(diǎn)和活性成分與潛在作用靶點(diǎn)的關(guān)系輸入Cytoscape Version 3.6.1軟件，構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.5 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

STRING平臺(tái)（https://string-db.org/，version11.0）是一種包含已知和預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)，其中收集了大量的蛋白相互作用關(guān)系。將篩選得到的疾病-藥物成分共同靶蛋白導(dǎo)入STRING功能性蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)，限定物種為人類(lèi)，最低相互作用閾值設(shè)為高等“medium confidence”（Score≥0.4）獲取蛋白互作關(guān)系（protein-protein interaction，PPI）。使用Cytoscape 3.6.1軟件對(duì)獲得的PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

將得到的蛋白互作關(guān)系表格使用ClusterProfiler R軟件進(jìn)行分析注釋?zhuān)瑢?duì)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中與其他靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)的靶點(diǎn)進(jìn)行排序，得到核心靶點(diǎn)的信息。

1.6 基因本體論（GO）富集分析

為了闡明當(dāng)歸四逆湯作用于腰椎間盤(pán)突出癥潛在靶點(diǎn)在基因功能層面上發(fā)揮的作用，使用ClusterProfiler R軟件對(duì)當(dāng)歸四逆湯作用于腰椎間盤(pán)突出癥的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）富集分析，將結(jié)果可視化。

1.7 京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路分析

使用ClusterProfiler R軟件中BioConductor平臺(tái)的“clusterProfiler”功能對(duì)當(dāng)歸四逆湯作用于腰椎間盤(pán)突出癥的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，并將結(jié)果可視化。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape Version 3.6.1軟件構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.8 分子對(duì)接

采用AutoDock vina軟件對(duì)上述分析后得出的關(guān)鍵靶點(diǎn)及活性分子進(jìn)行對(duì)接驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 當(dāng)歸四逆湯活性成分和作用靶點(diǎn)的獲取

通過(guò)TCMSP、TCM-PTD檢索，OB≥30%、DL≥0.18進(jìn)行篩選，得到細(xì)辛有效活性成分8個(gè)，通草有效活性成分4個(gè)，桂枝有效活性成分7個(gè)，甘草有效活性成分4個(gè)，當(dāng)歸有效活性成分2個(gè)，大棗有效活性成分15個(gè)，白芍有效活性成分13個(gè)，去除重復(fù)的有效成分，得到當(dāng)歸四逆湯的有效活性成分45個(gè)，詳見(jiàn)表1。

表1 當(dāng)歸四逆湯的活性成分Tab.1 Active ingredients of Danggui-Sini Decoction

根據(jù)得到的有效活性成分，在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到細(xì)辛作用靶點(diǎn)164個(gè)，通草作用靶點(diǎn)6個(gè)，桂枝作用靶點(diǎn)74個(gè)，甘草作用靶點(diǎn)106個(gè)，當(dāng)歸作用靶點(diǎn)69個(gè)，大棗作用靶點(diǎn)113個(gè)，白芍作用靶點(diǎn)123個(gè)，去除重復(fù)靶點(diǎn)，得到當(dāng)歸四逆湯的作用靶點(diǎn)164個(gè)，與Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中載入的靶點(diǎn)簡(jiǎn)稱(chēng)進(jìn)行基因名稱(chēng)匹配，最終得到當(dāng)歸四逆湯的作用靶點(diǎn)132個(gè)，詳見(jiàn)表2?？梢?jiàn)當(dāng)歸四逆湯的活性成分較多且復(fù)雜，具有較強(qiáng)的藥物利用價(jià)值，多靶點(diǎn)多通路共同作用于疾病。本文對(duì)當(dāng)歸四逆湯作用靶點(diǎn)及活性成分進(jìn)行整理，有助于相關(guān)試驗(yàn)的進(jìn)一步開(kāi)展。

表2 （續(xù)）Tab.2 (continued)

表2 當(dāng)歸四逆湯作用靶點(diǎn)Tab.2 Targets of DSD

2.2 腰椎間盤(pán)突出癥作用靶點(diǎn)的篩選

在GenCards數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中以“l(fā)umbar disc herniation”、“LDH”為關(guān)鍵詞檢索與腰椎間盤(pán)突出癥相關(guān)的疾病靶點(diǎn)并除重復(fù)基因后，得到疾病作用靶點(diǎn)379個(gè)。

2.3 當(dāng)歸四逆湯作用于腰椎間盤(pán)突出癥的潛在作用靶點(diǎn)的獲取

將當(dāng)歸四逆湯的作用靶點(diǎn)和腰椎間盤(pán)突出癥的相關(guān)靶點(diǎn)輸入ClusterProfiler R軟件繪制Venn圖，左邊藍(lán)色代表腰椎間盤(pán)突出癥相關(guān)靶點(diǎn)，紅色代表當(dāng)歸四逆湯藥物作用靶點(diǎn)，陰影部分表示兩者的共有靶點(diǎn)，見(jiàn)圖1。得到當(dāng)歸四逆湯作用于腰椎間盤(pán)突出癥的潛在作用靶點(diǎn)25個(gè)，見(jiàn)表3。潛在作用靶點(diǎn)為我們研究的重點(diǎn)，可提示藥物治療疾病的關(guān)鍵信息。

表3 當(dāng)歸四逆湯作用于腰椎間盤(pán)突出癥的潛在靶點(diǎn)Tab.3 DSD acts as a potential target for lumbar disc herniation

圖1 當(dāng)歸四逆湯-疾病共有靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Venn diagram of the common targets between DSD and disease

2.4 構(gòu)建藥物活性成分-靶蛋白-疾病共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

采用 Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建當(dāng)歸四逆湯治療腰椎間盤(pán)突出癥的活性成分-靶蛋白-疾病共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖，其中當(dāng)歸四逆湯作用于腰椎間盤(pán)突出癥相關(guān)的有效活性成分有8種（藍(lán)色菱形代表），分別是paeoniflorin、beta-sitosterol、kaempferol、(+)-catechin、stigmasterol、formononetin、licochalcone a、sesamin，共同作用于25個(gè)共同靶點(diǎn)（綠色方形節(jié)點(diǎn)代表），見(jiàn)圖2。網(wǎng)絡(luò)圖顯示出當(dāng)歸四逆湯發(fā)揮作用時(shí)呈現(xiàn)出多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。且beta-sitosterol、kaempferol、sesamin連接靶點(diǎn)較多，可視為藥物作用的關(guān)鍵成分。

圖2 當(dāng)歸四逆湯“活性成分-疾病靶蛋白”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 The “drug active component-disease target” network of DSD

2.5 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將通過(guò)篩選獲取的疾病和藥物成分共同靶蛋白在STRING平臺(tái)構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)PPI模型。將蛋白種類(lèi)設(shè)置為人類(lèi)，最低相互作用閾值設(shè)為中等“medium confidence”（0.4），其余值不做修正，獲取PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。

圖3 當(dāng)歸四逆湯與腰椎間盤(pán)突出癥蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.3 The protein-protein interaction network of DSD and LDH

再應(yīng)用 Cytoscape 3.6.1中的cytohHubba插件繪制靶蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鰣D，見(jiàn)圖4。圖中節(jié)點(diǎn)顏色隨著Degree值的增大而顏色加深，Degree平均值為14.64。結(jié)果提示：當(dāng)歸四逆湯治療腰椎間盤(pán)突出癥的靶標(biāo)中Degree值從大到小排列，值較大的10個(gè)靶蛋白為IL6、AKT1、PTGS2、MAPK1、STAT3、MAPK8、JUN、CASP3、MAPK14、IL10。具體結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鰣DFig.4 Protein-protein interaction network topology analysis diagram

將蛋白互作關(guān)系使用ClusterProfiler R軟件進(jìn)行分析注釋?zhuān)鶕?jù)相連靶點(diǎn)的數(shù)目（Count）進(jìn)行排序，結(jié)果顯示，當(dāng)歸四逆湯治療腰椎間盤(pán)突出癥的靶標(biāo)中Count值排名前十的靶蛋白為IL6、AKT1、MAPK1、MAPK8、PTGS2、STAT3、CASP3、JUN、IL10、MAPK14，具體見(jiàn)圖5。PPI中Degree值可提示該靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中聯(lián)系廣，信度高。Count值提示相連靶點(diǎn)數(shù)目較多，二者結(jié)合可得出當(dāng)歸四逆湯作用于腰椎間盤(pán)突出癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)：IL6、AKT1、MAPK1、MAPK14、STAT3、MAPK8、CASP3、IL10。

圖5 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)注釋分析Fig.5 Annotation analysis of protein-protein interaction network

表4 共同靶點(diǎn)的GO功能富集分析Tab.4 The GO analysis of co-target protein

2.6 GO功能富集分析

使用ClusterProfiler R軟件對(duì)當(dāng)歸四逆湯作用于腰椎間盤(pán)突出癥的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)GO功能富集分析，探究當(dāng)歸四逆湯治療疾病的可能作用機(jī)制。設(shè)置物種為人類(lèi)，P<0.05，共得到44條結(jié)果，其中包括絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）活性、半胱氨酸型內(nèi)肽酶（cysteine endopeptidases，CE）活性參與凋亡過(guò)程、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶（serine proteinases/ threonine/tyrosine kinase）活性、血紅素結(jié)合/核受體活性/轉(zhuǎn)錄因子活性、直接的配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、黃素單核苷酸（flavin mononucleotide，F(xiàn)MN）結(jié)合等，見(jiàn)表5。并將結(jié)果用氣泡圖表示，橫坐標(biāo)表示該通路富集的靶點(diǎn)數(shù)目占總數(shù)的比例，縱坐標(biāo)為功能名稱(chēng)，圓點(diǎn)大小表示富集的靶點(diǎn)數(shù)目多少，圓點(diǎn)越大則表明該功能上的靶點(diǎn)數(shù)目越多，圓圈的顏色表示調(diào)整后P值（Padjust）大小，由藍(lán)到紅調(diào)整后P值逐漸減小，詳見(jiàn)圖6。

圖6 共同靶點(diǎn)的GO功能富集分析（前20）Fig.6 The GO analysis of co-target protein（Top 20）

2.7 KEGG通路分析

使用 ClusterProfiler R軟件對(duì)當(dāng)歸四逆湯與腰椎間盤(pán)突出癥的共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，以調(diào)整后P值為篩選條件，篩選出作用通路共17條，包括缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信號(hào)通路、FoxO（forkhead box O3）信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗、鉑耐藥、鞘脂信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制劑、ErbB（verb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog）信號(hào)通路、精氨酸生物合成、p53信號(hào)通路、環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷酸-蛋白激酶 G（cGMP-PKG）信號(hào)通路、核因子激活的B細(xì)胞的κ-輕鏈增強(qiáng)（NF-κB）信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號(hào)通路、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、精氨酸和脯氨酸代謝、大鼠肉瘤（rat sarcoma，Ras）信號(hào)通路，具體見(jiàn)表5。繪制氣泡圖，縱坐標(biāo)表示功能名稱(chēng)，橫坐標(biāo)為富集的靶點(diǎn)數(shù)目，顏色表示調(diào)整后P值，由藍(lán)到紅P值逐漸減小，見(jiàn)圖7。

圖7 KEGG通路富集分析Fig.7 KEGG pathway enrichment analysis

表5 KEGG通路富集分析Tab.5 KEGG pathway enrichment analysis

將所得通路輸入Cytoscape3.6.1，輸出“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，橢圓形表示通路，三角形表示活性成分，箭形表示靶點(diǎn)，關(guān)聯(lián)的節(jié)點(diǎn)數(shù)目越多則形狀越大，見(jiàn)圖8。

圖8 “活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.8 “Active ingredient-target-path” network diagram

2.8 分子對(duì)接

選取上述分析后得出的IL6和AKT1 2個(gè)關(guān)鍵靶蛋白進(jìn)行對(duì)接驗(yàn)證，見(jiàn)圖9、10。

圖9 IL6與paeoniflorin 分子對(duì)接圖Fig.9 Molecular docking diagram of IL6 and paeoniflorin

IL6與paeoniflorin對(duì)接后顯示，paeoniflorin提供了4個(gè)氫鍵結(jié)合位點(diǎn)，分別為GLN156、ASP160、GLU106、SER107，氫鍵較多提示結(jié)合部位較為緊密。AKT1與kaempferol對(duì)接顯示，kaempferol提供了2個(gè)氫鍵結(jié)合位，分別是CYS310、TYR326，且根據(jù)3D全景圖可見(jiàn)，AKT1結(jié)合位點(diǎn)分裂為2個(gè)部分，結(jié)合結(jié)構(gòu)相對(duì)較為復(fù)雜。

3 討論

腰椎間盤(pán)突出癥的患者病因相對(duì)復(fù)雜，現(xiàn)代研究認(rèn)為發(fā)病機(jī)制主要包括腰椎間盤(pán)退行性改變、急性損傷、慢性勞損、炎癥化學(xué)刺激、自身免疫反應(yīng)的作用等［13-16］。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究當(dāng)歸四逆湯治療腰椎間盤(pán)突出癥的潛在靶點(diǎn)和作用機(jī)制。結(jié)果顯示，藥物含有25個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析表明，IL6、AKT1、PTGS2、MAPK1、STAT3、MAPK8、MAPK14等靶點(diǎn)存在協(xié)同作用，提示該方劑在治療腰椎間盤(pán)突出癥中具有多組分、多靶點(diǎn)、多功能、多通路的復(fù)合型特點(diǎn)。白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL6）是T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞所衍生的趨化因子族群中的一種細(xì)胞因子，并作為重要的中樞基因參與相位反應(yīng)的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)身體免疫系統(tǒng)以及運(yùn)動(dòng)期間的新陳代謝等生物活動(dòng)［17］。試驗(yàn)研究對(duì)腰突和正常組織進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，IL6表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞在突出腰椎間盤(pán)周?chē)难仔匀庋拷M織中表達(dá)最強(qiáng)，因此IL6為腰椎間盤(pán)突出癥疼痛產(chǎn)生的關(guān)鍵因子［18］。本研究顯示，IL6與芍藥苷（paeoniflorin）存在相互作用關(guān)系，提示paeoniflorin可能為當(dāng)歸四逆湯抑制腰椎間盤(pán)突出癥的關(guān)鍵化學(xué)成分。AKT1參與包括細(xì)胞凋亡和葡萄糖代謝在內(nèi)的細(xì)胞過(guò)程。近年來(lái)的試驗(yàn)研究表明AKT1在血管損傷中起著重要作用［19］。腰椎間盤(pán)壓迫刺激血管導(dǎo)致神經(jīng)根局部供血障礙、炎性水腫和酸性代謝產(chǎn)物積聚，使神經(jīng)根傳導(dǎo)功能下降，是腰椎間盤(pán)突出癥引發(fā)腰腿痛的主要原因［20］。FoxO1作為由AKT1調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子［21］，同時(shí)也是成骨細(xì)胞增殖和氧化還原平衡所需的唯一因子，可控制骨的形成。AKT1主要通過(guò)PI3K/AKT途徑使FoxO1磷酸化，失去調(diào)控成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的能力［22］。這與本研究證實(shí)FoxO信號(hào)通路為當(dāng)歸四逆湯治療腰椎間盤(pán)突出癥關(guān)鍵信號(hào)通路的結(jié)論相吻合。AKT1與山萘酚（kaempferol）相互作用，并且通過(guò)PI3K/AKT途徑影響FoxO1治療腰椎間盤(pán)突出癥，這為腰椎間盤(pán)突出癥新藥的研究帶來(lái)新的啟示。

KEGG代謝通路富集分析和GO功能富集分析結(jié)果表明，當(dāng)歸四逆湯治療主要通過(guò)MAP激酶活性、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、血紅素結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、氧化還原酶活性、FMN結(jié)合、內(nèi)肽酶活性、激素結(jié)合等功能治療腰椎間盤(pán)突出癥，涉及 HIF-1、FoxO、NF-κB、MAPK、p35等信號(hào)通路。HIF-1的活性對(duì)于組織缺血后的恢復(fù)十分重要。HIF-1能夠通過(guò)上調(diào)與血管系統(tǒng)相關(guān)的蛋白基因表達(dá)，如使血管生成更多的內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受體和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶等來(lái)抑制缺血損傷［23］，同時(shí)通過(guò)與靶點(diǎn)VEGF、STAT3相關(guān)聯(lián)，在缺氧的條件下促進(jìn)破骨細(xì)胞的產(chǎn)生［24］。NF-κB信號(hào)通路在損傷應(yīng)答、炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)控等病理方面具有重要作用。動(dòng)物試驗(yàn)表明，抑制NF-κB信號(hào)通路可下調(diào)炎性因子的表達(dá)水平，從而達(dá)到緩解疼痛的作用［25-27］。有研究顯示，HIF-1可以通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路使破骨細(xì)胞延遲分化或不分化，從而抑制破骨的吸收［28］。同時(shí)提示，STAT3可能與腰椎間盤(pán)突出癥中骨的吸收與再生相關(guān)，其相關(guān)活性成分甘草查爾酮a（licochalcone a）可為新藥的開(kāi)發(fā)提供思路。MAPK通路同樣可以誘導(dǎo)各種促炎因子［29］，下調(diào)MAPK活性，抑制MAPK通路可以達(dá)到緩解炎癥的作用。最新研究表明，F(xiàn)oxO信號(hào)通路可以通過(guò)調(diào)節(jié)T細(xì)胞建立功能適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，以抵抗細(xì)胞損傷，能夠?yàn)樗幬镝t(yī)治腰椎間盤(pán)突出癥帶來(lái)新的提示［30］。

藥物成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，當(dāng)歸四逆湯活性成分中的山奈酚、β-谷甾醇（β-sitosterol）靶點(diǎn)數(shù)目最多，提示這些活性成分可能參與了當(dāng)歸四逆湯治療腰椎間盤(pán)突出癥的過(guò)程。本研究結(jié)果表明，當(dāng)歸四逆湯中山奈酚、β-谷甾醇等成分對(duì)IL6、AKT1、MAPK1、MAPK8、PTGS2、STAT3、CASP3、JUN、IL10、MAPK14等相關(guān)靶點(diǎn)通過(guò)HIF-1、FoxO、內(nèi)分泌抵抗和MAPK等信號(hào)通路以抑制缺血損傷、下調(diào)炎性因子、構(gòu)建免疫系統(tǒng)等功能作用于腰椎間盤(pán)突出癥。

綜上，本研究揭示了當(dāng)歸四逆湯作用于腰椎間盤(pán)突出癥的靶點(diǎn)、通路及作用機(jī)制，利于臨床進(jìn)行參考應(yīng)用，同時(shí)為新藥開(kāi)發(fā)提供思路。