謝繽靈，鄧慧玲，付貴芳，王金福，謝鼎華，謝華平，3*

（1.湖南師范大學(xué)動(dòng)物腸道功能調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410081；2.湖南師范大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)與人體健康實(shí)驗(yàn)室，長沙 410081；3.湖南師范大學(xué)淡水魚類發(fā)育生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410081；4.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院耳鼻咽喉科，長沙 410011；5.浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞與發(fā)育生物學(xué)研究所，杭州 310058）

MYO7A是人類Usher綜合征1B型（Usher syndrome type 1B，USH1B）的致病基因。由人類MYO7A突變導(dǎo)致的Usher綜合征病例占Usher綜合征1型（Usher syndrome type 1，USH1）病例的29%～55%［1-2］。MYO7A基因編碼一種非傳統(tǒng)的肌球蛋白——MYOⅦA。該蛋白由2 215個(gè)氨基酸組成，包含1個(gè)N端運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)域，1個(gè)含有幾個(gè)IQ基序的頸部區(qū)域，1個(gè)短的預(yù)測線圈結(jié)構(gòu)域，1個(gè)MyTH4結(jié)構(gòu)域，1個(gè)FERM_M結(jié)構(gòu)域，1個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域，以及2個(gè)C端MyTH4-FERM串聯(lián)結(jié)構(gòu)域［3-4］。MYOⅦA是一種Mg2+介導(dǎo)的ATP酶運(yùn)動(dòng)蛋白，它沿肌動(dòng)蛋白絲運(yùn)動(dòng)，以Ca2+敏感的方式結(jié)合鈣調(diào)蛋白，在多種感覺毛細(xì)胞中都有表達(dá)，并參與多種細(xì)胞活動(dòng)過程［5］。MYOⅦA在視網(wǎng)膜光感受器、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（retinal pigment epithelial cells，RPE）及內(nèi)耳毛細(xì)胞中都有表達(dá)，主要參與光感受器中視蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、RPE中黑色素小體運(yùn)動(dòng)，以及毛細(xì)胞中膜結(jié)合元件的錨定和保持，在胚胎早期內(nèi)耳及視網(wǎng)膜的發(fā)育以及胚胎后期的整體發(fā)育中都至關(guān)重要［6-8］。人類MYO7A基因突變可導(dǎo)致常染色體隱性遺傳的USH1B，其特征是先天性感音神經(jīng)性耳聾、前庭功能障礙及進(jìn)行性視力喪失［9］。

內(nèi)耳是人體重要的感覺器官，且聽覺感受器和位覺感受器都位于內(nèi)耳。斑馬魚的聽覺器官包括內(nèi)耳、韋伯氏器及側(cè)線系統(tǒng)。斑馬魚內(nèi)耳主要由半規(guī)管和耳石器官構(gòu)成，耳石器官中存在大量內(nèi)耳毛細(xì)胞。內(nèi)耳毛細(xì)胞是一種特化的上皮細(xì)胞，頂端具有纖毛束，可感受聲波刺激。當(dāng)纖毛束結(jié)構(gòu)遭到破壞時(shí)，聽力將受到影響［10］。Myo7a基因敲除小鼠品系的纖毛束發(fā)育異常，野生型纖毛束呈有序V型排列，而Myo7a–/–小鼠纖毛束分布雜亂無章［11］。斑馬魚作為模式生物，其內(nèi)耳結(jié)構(gòu)與人體存在一定差異，但由于其胚胎在體外發(fā)育，有利于觀察內(nèi)耳發(fā)育過程，被廣泛應(yīng)用于內(nèi)耳發(fā)育和疾病模型的研究［12］。

斑馬魚的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)復(fù)雜精密，有多種神經(jīng)元分層排布。其中感光細(xì)胞層由感光細(xì)胞——視桿細(xì)胞及視錐細(xì)胞構(gòu)成。視桿細(xì)胞主要感受弱光刺激，含有視紫紅質(zhì)；視錐細(xì)胞主要感受強(qiáng)光刺激。根據(jù)視蛋白的差別，斑馬魚視錐細(xì)胞可分為紅、綠、藍(lán)及紫外敏感型4種類型。感光細(xì)胞可將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枺撨^程依賴于膜內(nèi)外Ca2+濃度變化。斑馬魚與人均為晝行性動(dòng)物，其視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)非常相似，但斑馬魚視網(wǎng)膜層次結(jié)構(gòu)更為簡單，雖然視錐細(xì)胞多一種紫外敏感型類型，但對視網(wǎng)膜表型分析及研究并無影響［10，13］。

在斑馬魚中，myo7a基因具有兩個(gè)不同拷貝——myo7aa和myo7ab。目前關(guān)于斑馬魚myo7aa基因的功能已有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，但對于myo7ab并無關(guān)注。為了研究myo7ab基因在斑馬魚內(nèi)耳發(fā)育過程中的作用，本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建斑馬魚myo7ab基因敲除品系［14］，這對于Usher綜合癥的病理機(jī)制的理解和新的防治方案的研發(fā)具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

TU斑馬魚品系來自國家斑馬魚資源中心，并由本實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖。水溫28.0℃，pH值6.5～7.5，14 h光照/10 h黑暗交替循環(huán)。1對斑馬魚1周產(chǎn)1次卵，胚胎在恒溫28.5℃的E3水（5.00 mmol/L NaCl，0.17 mmol/L KCl，0.33 mmol/L CaCl2，0.33 mmol/L MgSO4，0.10%甲基藍(lán)）［10］中培養(yǎng)，第5天開始喂食草履蟲至2周左右，之后轉(zhuǎn)移至養(yǎng)殖系統(tǒng)架上喂食豐年蟲。

1.1.2 主要試劑

引物由擎科生物技術(shù)有限公司合成；PCR高保真酶購自擎科生物技術(shù)有限公司（Cat#：TSE005）；DNA marker購自擎科生物技術(shù)有限公司（Cat#：TSJ012）；瓊脂糖購自擎科生物技術(shù)有限公司（Cat#：TSJ001）；PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自生工生物工程股份有限公司（Cat#：B518131）；T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購自invitrogen公司（Cat#：Am1314）；RNA純化試劑盒購自Qiagen公司（Cat#：74104）；Cas9蛋白購自invitrogen公司（Cat#：A36498）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 向?qū)NA（gRNA）靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)

首先，在Ensembl網(wǎng)站（http://www.ensembl.org/index.html）上獲取目標(biāo)基因的完整基因組序列（ENSDARG00000044632）、各個(gè)轉(zhuǎn)錄本以及內(nèi)外顯子等信息；找出所有緊鄰5'-NGG-3'（protospacer adjacent motif，PAM）的候選靶序列，靶序列一般大小為18～20 bp。gRNA引物序列F基本結(jié)構(gòu)：靶序列前加保護(hù)堿基（gcg）和T7啟動(dòng)子（TAATACGACTCACTATA），靶序列后加gRNA骨架序列上游序列（GTTTTAGAGGCTAGAAATAGG）。gRNA-R序列：AAGCACCGACTCGGTGCCACT［14］。根據(jù)myo7ab基因靶位點(diǎn)，通過Primer3.0設(shè)計(jì)基因組正反檢測引物Gmyo7ab-F和Gmyo7ab-R（表1）。

表1 本文涉及到的引物和模板序列Tab.1 Primers and template sequences involved in this study

1.2.2 gRNA的合成

以Template DNA為模板（表1），gRNA1-F/gRNA-R或gRNA2-F/gRNA-R為正反引物，退火溫度為61℃，延伸時(shí)間為10 s，用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得攜帶T7啟動(dòng)子的myo7ab基因靶位點(diǎn)序列1及序列2的gRNA模板序列；PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收，以回收的PCR產(chǎn)物作為模板，用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒合成gRNA，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用RNA純化試劑盒進(jìn)行純化回收，–80℃保存。

1.2.3 顯微注射以及靶位點(diǎn)有效性檢測

收集15 min內(nèi)產(chǎn)的斑馬魚受精卵，待發(fā)育至1細(xì)胞期，將myo7ab基因靶位點(diǎn)的gRNA1、gRNA2和Cas9蛋白混勻（終質(zhì)量濃度分別為25.00、25.00、2.33 μg/μL）注射到斑馬魚受精卵中，每顆胚胎的注射體積控制為1 nL，隨后置于28.5℃的恒溫箱中培養(yǎng)；受精卵發(fā)育至36 h后挑選部分胚胎進(jìn)行基因敲除的有效性鑒定，剩余胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至成魚。

1.2.4 可穩(wěn)定遺傳突變體的篩選

將注射后的胚胎培養(yǎng)2個(gè)月至發(fā)育為幼魚，對幼魚逐條剪尾并進(jìn)行基因型鑒定。由于兩個(gè)靶位點(diǎn)之間相距96 bp，如果兩個(gè)靶位點(diǎn)都有效，就會(huì)造成較大片段的缺失。用檢測引物對基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。根據(jù)真核生物的DNA損傷修復(fù)機(jī)制，由于目標(biāo)敲除條帶大小未知，若PCR產(chǎn)物同時(shí)出現(xiàn)465 bp的野生型目的條帶，以及比野生型目的條帶小的條帶，則這些幼魚為攜帶突變的F0代魚；將F0代幼魚繼續(xù)飼養(yǎng)1個(gè)月左右至成魚，與野生型進(jìn)行雜交，用同樣的基因型鑒定方法篩選出可穩(wěn)定遺傳的魚，這些魚為F1代突變體?；蛐丸b定后，將F1代突變體中比野生型目的條帶小的條帶進(jìn)行切膠回收，并送公司測序，分析突變位點(diǎn)和堿基數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 myo7ab基因結(jié)構(gòu)域分析

首先在NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）上查找斑馬魚myo7ab基因的序列并將其下載，利用SMART網(wǎng)站（http://smart.embl-heidelberg.de）查找其蛋白結(jié)構(gòu)域（圖1）。

圖1 MYO7AB蛋白結(jié)構(gòu)域分析Fig.1 Analysis of MYO7AB protein domain

2.2 myo7ab基因靶位點(diǎn)確定

按1.2.1所述的方法在myo7ab基因編碼MYSc蛋白結(jié)構(gòu)域的序列區(qū)域選擇基因敲除位點(diǎn)（圖2）。靶位點(diǎn)序列前加保護(hù)堿基和啟動(dòng)子序列，靶位點(diǎn)序列后加gRNA骨架上游序列，將此作為正向引物gRNA1-F和gRNA2-F。gRNA骨架下游序列作為反向引物gRNA-R。

圖2 myo7ab基因靶位點(diǎn)示意圖Fig.2 The diagram of myo7ab gene targeting site

2.3 myo7ab基因注射有效性檢測與分析

為了檢驗(yàn)靶位點(diǎn)是否有效，本文按1.2.3中所述方法將注射后胚胎進(jìn)行基因型鑒定，結(jié)果顯示，1、2、4和5號泳道除了野生型條帶外，下方有一條較弱的小帶，證明選擇的兩個(gè)靶位點(diǎn)都有效（圖3）。

圖3 gRNA有效性分析Fig.3 Effectiveness analysis of gRNA

2.4 F0代突變體篩選

將注射有效的剩余胚胎養(yǎng)至成魚，對成魚剪尾進(jìn)行基因型鑒定（圖4）。結(jié)果顯示，1、2、3號成魚攜帶突變基因。

圖4 F0代兩個(gè)月幼魚篩選Fig.4 Two months F0 juvenile screening

2.5 穩(wěn)定遺傳突變體的篩選

本試驗(yàn)將篩選到的F0代突變體與野生型斑馬魚雜交，得到F1代，收集F1代斑馬魚胚胎，進(jìn)行DNA鑒定，結(jié)果顯示F0代突變體可穩(wěn)定遺傳（圖5a）。隨后將較小的條帶進(jìn)行切膠回收并送公司測序，峰圖顯示兩個(gè)靶位點(diǎn)都出現(xiàn)堿基缺失(圖5b)。將測序序列在NCBI blast數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)突變體的兩個(gè)靶位點(diǎn)之間都有堿基缺失，其中第一號靶位點(diǎn)與第二號靶位點(diǎn)間缺失58 bp，第二號靶位點(diǎn)3'端缺失30 bp，這證明兩個(gè)靶位點(diǎn)都有效并造成大片段的缺失（圖5c）。將剩余的F1代胚胎養(yǎng)至2個(gè)月的幼魚，再逐條剪尾進(jìn)行基因型鑒定（圖5d），獲得可穩(wěn)定遺傳的F1代魚，說明敲除品系構(gòu)建成功。

圖5 F1代突變體篩選Fig.5 F1 generation mutant screening

3 討論

本文通過CRISPR/Cas9技術(shù)對斑馬魚進(jìn)行了myo7ab基因的基因敲除試驗(yàn)，成功構(gòu)建了能夠穩(wěn)定遺傳的myo7ab基因突變品系。將F1代myo7ab基因雜合突變體成魚自交，觀察F2代myo7ab基因純合突變胚胎，其外表未出現(xiàn)明顯缺陷（圖6），這說明基因敲除后不影響整體胚胎發(fā)育，但是該基因是否引起細(xì)微結(jié)構(gòu)、離子通道功能的改變目前尚不清楚。

圖6 myo7ab基因純合突變胚胎整體發(fā)育正常（50×）Fig.6 myo7ab null mutant has no obvious defect (50×)

MYO7A基因突變導(dǎo)致人類Usher1B型綜合癥，患者在出生后即表現(xiàn)為重度耳聾，隨后在10歲左右出現(xiàn)視網(wǎng)膜色素變性癥狀。Usher1B型綜合征的癥狀表現(xiàn)使基因治療成為可行方案。目前已有研究利用插入小鼠Myo7a基因的腺相關(guān)病毒（adenoassociated viruses，AAV）對Myo7a基因突變小鼠進(jìn)行基因治療［15］。盡管對小鼠Myo7a突變品系已進(jìn)行了諸多研究，但在大多數(shù)小鼠模型中沒有出現(xiàn)視網(wǎng)膜色素變性表型，因此，很多關(guān)于視網(wǎng)膜色素變性的病理機(jī)制的假說難以在小鼠模型中得到證實(shí)［16-18］。斑馬魚作為模式動(dòng)物，具有試驗(yàn)周期短，通體透明易觀察等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)研究［19-20］。利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建斑馬魚myo7a基因突變模型，或能彌補(bǔ)小鼠Myo7a突變模型無視網(wǎng)膜異常表型的缺陷。

斑馬魚中存在myo7aa和myo7ab兩個(gè)拷貝，后續(xù)將通過建立myo7aa基因敲除品系，以及myo7aa/myo7ab雙基因敲除品系，探究兩個(gè)拷貝之間的相互關(guān)系，并觀察其表型，進(jìn)行基因功能研究。