羅婉蓉，余 佳，劉 沖，金曉旎，歐陽(yáng)鈺沭，童 星，劉寧昂*

（1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)學(xué)院，放射醫(yī)學(xué)與輻射防護(hù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省高校放射醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，蘇州 215123；2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)中心，蘇州 215123）

20世紀(jì)70年代末以來(lái)，全球乳腺癌發(fā)病率一直呈上升趨勢(shì)。2018年，預(yù)計(jì)全國(guó)約有36.8萬(wàn)新發(fā)乳腺癌病例，乳腺癌已成為45歲以下女性最常見(jiàn)的癌癥死因［1］。三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）及人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）三種受體均呈陰性表達(dá)的乳腺癌亞型。中國(guó)女性TNBC患者占所有乳腺癌的12%～20%，遠(yuǎn)高于西方國(guó)家10%～15%的占比［2-3］。與激素受體（ER、PR）陽(yáng)性或HER2陽(yáng)性乳腺癌相比，由于分子特征的限制，TNBC缺少相關(guān)的內(nèi)分泌和靶向治療靶點(diǎn)，導(dǎo)致其高復(fù)發(fā)率和高死亡率，且放療后TNBC的局部復(fù)發(fā)率遠(yuǎn)高于其他乳腺癌亞型［4-5］。這提示TNBC存在固有的和/或獲得性的放療抗性，可能是導(dǎo)致TNBC放療失敗的重要原因。已有研究表明，約50%的TNBC與乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）及抑癌基因p53的突變或缺失相關(guān)［6-8］。然而，對(duì)于另外50%與BRCA1及p53缺陷不相關(guān)的TNBC亞型，其輻射抗性比BRCA1/p53缺陷型TNBC更高，且發(fā)病的分子機(jī)制尚不清楚［9-10］。因此，探明這一部分非BRCA1相關(guān)的TNBC輻射抗性的分子機(jī)制，是降低TNBC的輻射抗性和改善放療預(yù)后的關(guān)鍵。

輻射誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂（DNA double-strand break，DSB）是細(xì)胞死亡的重要原因。因此，細(xì)胞內(nèi)DSB的修復(fù)能力是決定其輻射敏感性、基因組完整性和細(xì)胞存亡命運(yùn)的關(guān)鍵。抑制DSB的精準(zhǔn)修復(fù)能增加腫瘤細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性，而細(xì)胞內(nèi)過(guò)高的DSB修復(fù)活性則導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞輻射抗性的增強(qiáng)。真核細(xì)胞主要通過(guò)兩種修復(fù)方式應(yīng)對(duì)DSB損傷：其一是修復(fù)精確性較低的非同源重組末端連接（nonhomologous end joining，NHEJ）；其二是修復(fù)精確度極高的同源重組修復(fù)（homologous recombination，HR）。兩種DSB修復(fù)途徑的選擇被細(xì)胞嚴(yán)格調(diào)控。以DSB修復(fù)相關(guān)的分子為靶標(biāo)，通過(guò)對(duì)DSB修復(fù)通路的干預(yù)，選擇性抑制高修復(fù)精確度的同源重組修復(fù)活性，增加DNA輻射損傷修復(fù)錯(cuò)誤率，有可能降低細(xì)胞的輻射抗性，從而改善放療的療效及預(yù)后。

本研究的前期研究中，特異性敲除小鼠乳腺上皮細(xì)胞中的DNA同源重組修復(fù)相關(guān)蛋白（BRCA2 and CDKN1A interacting protein，BCCIP）后，約50%的雌鼠快速形成了乳腺結(jié)節(jié)，其中10%最終發(fā)展成乳腺癌，并且所有BCCIP缺陷的乳腺癌細(xì)胞都喪失了DSB修復(fù)關(guān)鍵蛋白53BP1［11］。在乳腺癌病人的病理組織樣本中，約49%的TNBC中出現(xiàn)了BCCIP的自發(fā)缺失，同時(shí)53BP1的缺失和BCCIP陰性型TNBC呈高度相關(guān)［11］。根據(jù)上述研究的結(jié)果，本研究提出，53BP1的缺失提高了BCCIP陰性腫瘤細(xì)胞的輻射抗性。因此，基于前期大量的臨床、動(dòng)物試驗(yàn)數(shù)據(jù)及文獻(xiàn)調(diào)研證據(jù)，本研究通過(guò)闡明BCCIP/53BP1途徑對(duì)乳腺癌細(xì)胞輻射敏感性的調(diào)控機(jī)制，明確了約50%高輻射抗性TNBC的分子特征，為優(yōu)化這類(lèi)乳腺癌的治療方案、發(fā)現(xiàn)新的放療增敏靶點(diǎn)提供理論和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)；小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；DR-GFP U2OS（人骨肉瘤細(xì)胞）由深圳大學(xué)許興智教授提供；人TNBC細(xì)胞MDA-MB-231由蘇州大學(xué)暢磊教授提供；RPMI-1640（Roswell Park Memorial Institute-1640）培養(yǎng)基、DMEM（Dulbecco’s modified eagle medium）培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自美國(guó)Gibico公司；胰酶、青霉素/鏈霉素雙抗和左旋谷氨酰胺購(gòu)自江蘇海門(mén)碧云天生物技術(shù)有限公司；著絲粒和端粒熒光探針購(gòu)自韓國(guó)Panagene公司；γH2AX抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；53BP1和Lamin B抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；GAPDH抗體購(gòu)自蘇州睿瀛生物技術(shù)有限公司；BCCIP抗體、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑及siRNA（si53BP1）購(gòu)自美國(guó)Thermofisher公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及BCCIP穩(wěn)定敲低細(xì)胞株的構(gòu)建

4T1 細(xì)胞培養(yǎng)于含有10% FBS、1% 雙抗及1%左旋谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)基中，MEF、DRGFP U2OS和MDA-MB-231細(xì)胞均培養(yǎng)在含有上述相同添加成分的DMEM培養(yǎng)基中。細(xì)胞在37℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，用0.25%的胰酶消化傳代。試驗(yàn)所用細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。使用慢病毒載體plKD-CMV-Puro-U6-shRNA，插入文獻(xiàn)已報(bào)道的小鼠BCCIP shRNA回文序列（5'-GGATGAAGATGAGATCTTTGGTTCAAGAGACCAAAGATCTCATCTTCATCCTTTTTT-3'）［12］。配合psPAX2和pMD2.G輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人腎上皮細(xì)胞293T細(xì)胞包裝病毒，并利用成熟的病毒感染細(xì)胞3次，以過(guò)表達(dá)shBCCIP序列構(gòu)建BCCIP穩(wěn)定敲低的細(xì)胞株。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～80%匯合度時(shí)，使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑對(duì)DR-GFP U2OS細(xì)胞進(jìn)行si53BP1的轉(zhuǎn)染。每105個(gè)細(xì)胞使用20 pmol siRNA。4T1、MEF和MDA-MB-231細(xì)胞用胰酶處理后混入si53BP1，使用Lonza Amaxa Nucleofector II電穿孔儀protocol T-24預(yù)先設(shè)定的電壓和脈沖頻率進(jìn)行轉(zhuǎn)染。上述細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后收獲，用于蛋白質(zhì)印運(yùn)（Western blot）檢測(cè)或后續(xù)試驗(yàn)。本研究的試驗(yàn)分組如下表1。

表1 本研究試驗(yàn)分組Tab.1 The experimental groups in this study

1.4 Western blot檢測(cè)

除去細(xì)胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗細(xì)胞2遍，徹底去除PBS后，加入適量十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）細(xì)胞裂解液，冰上裂解后收集蛋白。蛋白液經(jīng)超聲破碎后，100℃變性5 min，渦旋混勻后上樣。分別使用12%和5%～6%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）對(duì)γH2AX和53BP1進(jìn)行檢測(cè)，電泳完成后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)印有蛋白的聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，經(jīng)5%脫脂牛奶室溫封閉2.0 h。隨后，將封閉好的PVDF膜與γH2AX、BCCIP、53BP1或GAPDH等一抗在4℃條件下分別過(guò)夜孵育。第二天用PBST洗膜3次，每次10 min。室溫孵育相應(yīng)種屬的二抗1.5 h，PBST洗膜后，用ECL（electrochemiluminescence）化學(xué)發(fā)光試劑在顯影機(jī)（Proteinsimple，F(xiàn)luorChem M）上檢測(cè)目的蛋白質(zhì)條帶信號(hào)。

1.5 免疫熒光染色

細(xì)胞于照射后的不同時(shí)間經(jīng)4.00%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）/PBS室溫固定10 min，用0.50% SDS和0.25% Triton X-100/PBS室溫通透5 min。隨后，經(jīng)1.00%小牛血清（bull serum albumin，BSA）/PBS室溫封閉1 h，將樣品置于濕盒內(nèi)，在4℃條件下過(guò)夜孵育一抗。次日清洗PBS后用對(duì)應(yīng)的熒光二抗室溫孵育1.0 h。最后，經(jīng)4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色并封片，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。每組獨(dú)立試驗(yàn)至少分析200個(gè)細(xì)胞的焦點(diǎn)數(shù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 輻射類(lèi)型及劑量

根據(jù)不同試驗(yàn)的需要，利用X射線儀（RS 2000X-ray Biological Irradiator，Rad Source Technologies）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行0、2、4、6 Gy劑量的 X 射線照射，劑量率為1.046 Gy/min。在細(xì)胞受照后不同時(shí)間點(diǎn)收集樣品進(jìn)行后續(xù)分析。

1.7 克隆形成試驗(yàn)

首先，利用野生型細(xì)胞測(cè)試不同劑量下的克隆形成率。將充分分散的細(xì)胞按照推算的克隆形成率接種于60 mm培養(yǎng)皿中，12 h后進(jìn)行照射處理，每處理組設(shè)置3個(gè)平行樣品以增加試驗(yàn)可靠性。照射14 d后，顯微鏡下觀察每個(gè)克隆集落中的細(xì)胞數(shù)，當(dāng)細(xì)胞數(shù)多于50個(gè)時(shí)，用甲醇固定細(xì)胞，并用結(jié)晶紫對(duì)細(xì)胞克隆進(jìn)行染色，回收結(jié)晶紫溶液并清洗培養(yǎng)皿。待干燥后，計(jì)算細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)（surviving fraction，SF），繪制存活曲線，計(jì)算半數(shù)致死劑量（median lethal dose，LD50）。

1.8 端粒-著絲粒熒光原位雜交(CT-FISH）和姐妹染色單體（SCE）互換試驗(yàn)

端粒-著絲粒熒光原位雜交（telomere-centromere fluorescencein situhybridization，CT-FISH）試驗(yàn)：細(xì)胞經(jīng)過(guò)2 Gy照射之后，立即加入0.025 μg/mL秋水仙堿，并在37℃培養(yǎng) 24 h以截獲輻射損傷修復(fù)后的中期染色體。胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，使用0.075 mol/L的氯化鉀低滲處理細(xì)胞使染色體松弛，隨后采用經(jīng)典的Carnoy固定液［V（CH3OH）∶V（CH3COOH）=3∶1］4℃固定細(xì)胞3次。在染色體鋪片完成后，染色體與FITC-telomere PNA（peptide nucleic acid）探針和Cy3-centromere PNA探針（Panagene，South Korea）的混合雜交液在80℃高溫下變性3 min，并室溫雜交1 h，標(biāo)記染色體的著絲粒和端粒，最后用DAPI標(biāo)記染色體，完成CT-FISH的制片。

姐妹染色單體互換（sister chromatid exchange，SCE）試驗(yàn)：向細(xì)胞中加入BrdU（終濃度為10 μmol/L），并于24 h后給與細(xì)胞2 Gy照射，照射后立即加入0.025 μg/mL秋水仙堿，37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h以截獲輻射損傷修復(fù)后的中期染色體。胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞后，使用0.075 mol/L的氯化鉀低滲處理細(xì)胞使染色體松弛。隨后，采用經(jīng)典的 Carnoy 固定液［V（CH3OH）∶V（CH3COOH）=3∶1］4℃固定細(xì)胞 3次。在染色體鋪片完成后，加入Hoechst 33258并在60℃條件下經(jīng)black light曝光處理1 h。最后，用DAPI標(biāo)記染色體，完成SCE制片。

上述制作好的玻片使用中期染色體自動(dòng)捕獲細(xì)胞遺傳學(xué)工作站（MetaSystems/Zeiss Axio Imager Z2）進(jìn)行PNA 探針標(biāo)記的染色體和SCE染色體的高通量自動(dòng)識(shí)別和圖像拍攝。使用Isis（MetaSystems）軟件對(duì)染色體進(jìn)行快速分析。

1.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

每組試驗(yàn)至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量染色體快速精確分析系統(tǒng)的建立

基于中期染色體自動(dòng)捕獲細(xì)胞遺傳學(xué)工作站（MetaSystems/Zeiss Axio Imager Z2）的軟件和硬件平臺(tái)（圖1a），首先建立了采用 CT-FISH 技術(shù)的染色體快速精確分析系統(tǒng)。相對(duì)于傳統(tǒng)的吉姆薩（Giemsa）染色，CT-FISH分析可以更加清楚直觀地展現(xiàn)染色體的端粒和著絲粒（圖1b），為精確分析不同類(lèi)型的染色體畸變（圖1c，雙著絲粒染色體、三/四著絲粒染色體、片段、著絲粒環(huán)等），評(píng)價(jià)電離輻射后DSB的修復(fù)效率、基因組穩(wěn)定性維持的能力等提供了優(yōu)良的技術(shù)平臺(tái)。

圖1 中期染色體自動(dòng)捕獲MetaSystems/Zeiss Axio Imager Z2細(xì)胞遺傳學(xué)工作站及CT-FISH對(duì)比吉姆薩染色在染色體分析中的優(yōu)勢(shì)Fig.1 The advantages of metaphase chromosome automatical capture cytogenetics workstation established by MetaSystems/Zeiss Axio Imager Z2 and CT-FISH technique in chromosome aberration analysis compared to Giemsa staining approach

2.2 53BP1缺失增加BCCIP陰性乳腺癌細(xì)胞輻射后基因組穩(wěn)定性

為明確53BP1的同時(shí)缺失是否提高了BCCIP陰性乳腺癌細(xì)胞對(duì)輻射基因毒性損傷的抵抗能力，本研究在驗(yàn)證了53BP1和BCCIP的敲低效率后（圖2a），首先應(yīng)用高通量染色體快速精確分析系統(tǒng)檢測(cè)53BP1缺失對(duì)BCCIP陰性4T1乳腺癌細(xì)胞電離輻射導(dǎo)致異常染色體形成率的影響，鑒定53BP1對(duì)輻射損傷后BCCIP陰性細(xì)胞基因組穩(wěn)定性維持能力的調(diào)節(jié)作用。分析結(jié)果顯示，BCCIP的單獨(dú)缺失導(dǎo)致輻射后三著絲粒染色體畸變率的顯著增加（圖2b），這一結(jié)果與之前報(bào)道的BCCIP參與同源重組修復(fù)相符合［12］。而53BP1在BCCIP陰性4T1乳腺癌細(xì)胞中的額外缺失可以下調(diào)BCCIP缺陷導(dǎo)致的輻射后染色體高畸變率（圖2b），提示53BP1的額外缺失增加了輻射后細(xì)胞基因組穩(wěn)定性的維持功能，部分恢復(fù)了BCCIP陰性細(xì)胞對(duì)輻射遺傳毒性的抵抗能力。

圖2 53BP1缺失可部分恢復(fù)BCCIP陰性細(xì)胞對(duì)輻射遺傳毒性的抵抗Fig.2 The defected resistant capacity to radiation genotoxicity in BCCIP deficient cells can be partially restored by 53BP1 additionally deletion

2.3 53BP1敲低促進(jìn)BCCIP陰性乳腺癌細(xì)胞中輻射誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂的修復(fù)能效

輻射可以引起細(xì)胞基因組DNA多種類(lèi)型的損傷，其中DSB是最為嚴(yán)重且致命的DNA損傷類(lèi)型。第139位絲氨酸磷酸化修飾后的組蛋白H2AX被稱(chēng)之為γH2AX，是公認(rèn)的DNA雙鏈斷裂標(biāo)志物，而輻射后γH2AX焦點(diǎn)的聚集形成被認(rèn)為是細(xì)胞識(shí)別DSB并做出反應(yīng)的關(guān)鍵步驟。根據(jù)細(xì)胞種類(lèi)的不同，γH2AX水平一般在細(xì)胞受照0.5～2.0 h之間達(dá)到峰值，隨后由于細(xì)胞DNA修復(fù)程序的啟動(dòng)而逐漸降低，約在受照8.0～24.0 h之間基本完成主要的DSB修復(fù)工作。因此，應(yīng)用2 Gy X射線照射4T1細(xì)胞和MEF細(xì)胞誘導(dǎo)DSB損傷，并在照射后4.0 h固定細(xì)胞，通過(guò)免疫熒光染色分析γH2AX 焦點(diǎn)數(shù)量可以作為細(xì)胞DSB修復(fù)效率的評(píng)價(jià)依據(jù)。結(jié)果顯示，未照射的BCCIP和53BP1陽(yáng)性的野生型細(xì)胞幾乎沒(méi)有γH2AX焦點(diǎn)形成，而B(niǎo)CCIP單缺失細(xì)胞則存在自發(fā)DSB損傷水平的升高（無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異）。另外，與野生型細(xì)胞相比較，BCCIP陰性細(xì)胞經(jīng)2 Gy劑量照射后，γH2AX 焦點(diǎn)數(shù)在照射后4.0 h依然保持較高水平，而53BP1的額外缺失可以明顯降低BCCIP陰性細(xì)胞中的γH2AX 焦點(diǎn)數(shù)量（圖3a）。這些結(jié)果提示，53BP1的同時(shí)缺失可以促進(jìn)BCCIP陰性乳腺癌細(xì)胞受照后的DSB損傷修復(fù)能力。另外，我們?cè)?BCCIP 敲低的MEF細(xì)胞中抑制53BP1表達(dá)，利用Western blot發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在4 Gy X射線照射8.0 h后γH2AX水平較BCCIP 單缺失組變?nèi)?，更接近正常?duì)照組損傷修復(fù)后的恢復(fù)水平，提示53BP1缺失可以改善輻射后BCCIP陰性細(xì)胞中DSB的修復(fù)效率（圖3b）。與以往文獻(xiàn)報(bào)道相符，BCCIP單缺失組因同源重組修復(fù)效率的明顯抑制，自發(fā)及誘發(fā)DSB均無(wú)法得到有效修復(fù)，因而使細(xì)胞維持較高的γH2AX活化狀態(tài)（圖3）。

圖3 53BP1缺失促進(jìn)BCCIP陰性乳腺癌細(xì)胞DSB修復(fù)效率Fig.3 The DSB repair efficiency in BCCIP negatively expressed breast cancer cells was enhanced by 53BP1 concurrent deletion

2.4 53BP1調(diào)控BCCIP低表達(dá)細(xì)胞同源重組修復(fù)及細(xì)胞輻射抗性

DR-GFP系統(tǒng)是利用細(xì)胞的同源重組修復(fù)，以特定序列為模板，將被I-SceI內(nèi)切酶破壞的不完整GFP序列修復(fù)成具有表達(dá)活性的完整GFP熒光蛋白，從而通過(guò)熒光信息的表達(dá)情況報(bào)告細(xì)胞同源重組修復(fù)的效率。我們?cè)贒R-GFP U2OS細(xì)胞中同時(shí)敲低 BCCIP 與 53BP1，并轉(zhuǎn)入I-SceI內(nèi)切酶表達(dá)質(zhì)粒pCBAS，在GFP序列產(chǎn)生特異性的DSB位點(diǎn)，隨后利用流式細(xì)胞儀分析經(jīng)同源重組修復(fù)后GFP熒光陽(yáng)性細(xì)胞的比例。如圖4a所示，與BCCIP/53BP1陽(yáng)性的DR-GFP U2OS細(xì)胞相比，BCCIP單敲低導(dǎo)致GFP信號(hào)的明顯降低，而53BP1在BCCIP敲低細(xì)胞中的同時(shí)缺失則顯著恢復(fù)了GFP熒光信號(hào)，提示53BP1的缺失可以恢復(fù)BCCIP陰性細(xì)胞的同源重組修復(fù)效率。

由于同源重組修復(fù)是介導(dǎo)DSB損傷后姐妹染色單體互換的重要途徑，因此姐妹染色單體的互換率也被廣泛作為評(píng)價(jià)同源重組修復(fù)效率的指標(biāo)。利用Metasystem高通量染色體快速精確分析系統(tǒng)檢測(cè)姐妹染色單體互換率，得出與DR-GFP試驗(yàn)相似的結(jié)果，53BP1缺失可以顯著補(bǔ)償輻射損傷后BCCIP敲低造成的同源重組修復(fù)效率的抑制（圖4b）。

圖4 53BP1缺失恢復(fù)BCCIP陰性細(xì)胞同源重組修復(fù)效率Fig.4 53BP1 depletion restored homologous recombination repair efficiency in BCCIP deficient cells

2.5 53BP1缺失增強(qiáng)BCCIP低表達(dá)乳腺癌細(xì)胞的輻射抗性

克隆形成是放射生物學(xué)中最為經(jīng)典的細(xì)胞輻射敏感性檢測(cè)和評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。通過(guò)克隆形成試驗(yàn)在BRCA1正常型人TNBC細(xì)胞MDA-MB-231中發(fā)現(xiàn)，不同劑量照射后，同時(shí)敲低BCCIP和53BP1的細(xì)胞克隆形成率較 BCCIP 單缺失的細(xì)胞恢復(fù)明顯（圖5），提示 53BP1缺失增強(qiáng)了BCCIP陰性乳腺癌細(xì)胞的輻射抗性。

圖5 克隆形成試驗(yàn)Fig.5 Colony formation assay

3 討論

同源重組修復(fù)相關(guān)蛋白BCCIP于2000—2001年由兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，因其與同源重組修復(fù)關(guān)鍵蛋白乳腺癌易感基因2（breast cancer susceptibility gene 2，BRCA2）相互作用而得名［13-14］。研究表明，BCCIP通過(guò)影響同源重組修復(fù)效率，在腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的調(diào)節(jié)及基因組穩(wěn)定性的維持中發(fā)揮重要作用。BCCIP在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、喉癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、腎癌、肝癌等腫瘤組織中的表達(dá)量均下降或不表達(dá)［14-19］，提示BCCIP的缺失與多種實(shí)體瘤的發(fā)生相關(guān)。例如：在喉癌組織中p53表達(dá)正常，而 BCCIP缺失的病人具有較高的輻射抗性、局部復(fù)發(fā)率以及較低的生存率［16］。我們前期通過(guò)臨床研究也發(fā)現(xiàn)，在BRCA1及p53正常的高輻射抗性TNBC中，BCCIP的表達(dá)量顯著降低［11］。在473例乳腺癌病人活檢樣本中，有33%的樣本組織檢測(cè)出BCCIP表達(dá)的下調(diào)或缺失。在TNBC中，BCCIP的缺失率高達(dá)約49%，而非三陰性乳腺癌中BCCIP的缺失率僅為25%（P=3.86×10–7）。這些研究結(jié)果提示，BCCIP的表達(dá)缺失是BRCA1/p53正常型TNBC的一個(gè)重要分子特征，有可能是導(dǎo)致TNBC高輻射抗性的主要分子事件。

在細(xì)胞水平，BCCIP的缺失主要通過(guò)影響同源重組修復(fù)中的關(guān)鍵蛋白R(shí)AD51和BRCA2的功能，降低同源重組修復(fù)的效率而導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，從而增加癌變風(fēng)險(xiǎn)［20-23］。與此同時(shí)，BCCIP缺失還會(huì)引起細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性增加［24］。一個(gè)有趣的現(xiàn)象是，在正常細(xì)胞中，下調(diào)BCCIP蛋白會(huì)導(dǎo)致輻射敏感性增加，但BCCIP缺陷的腫瘤細(xì)胞卻表現(xiàn)出高輻射抗性。為了解釋這一現(xiàn)象，我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，約50%的組織特異性BCCIP敲低雌鼠在1年內(nèi)快速形成了良性的乳腺結(jié)節(jié)，其中10%最終發(fā)展成了惡性乳腺癌［11］。更重要的是，所有BCCIP缺陷的惡性乳腺癌細(xì)胞都喪失了DNA損傷修復(fù)的一個(gè)關(guān)鍵蛋白——53BP1。與此同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)，在TNBC病人的組織樣本中，53BP1的缺失和BCCIP陰性腫瘤呈高度相關(guān)。根據(jù)這些臨床病例研究和小鼠試驗(yàn)的結(jié)果，我們推測(cè)53BP1的缺失很可能提高了BCCIP陰性腫瘤細(xì)胞的輻射抗性。

接下來(lái)的問(wèn)題是，53BP1缺失通過(guò)何種途徑才能提高BCCIP陰性腫瘤細(xì)胞的輻射抗性？已知對(duì)DSB斷裂位點(diǎn)3'末端局部切除修飾啟動(dòng)的調(diào)控在DSB修復(fù)通路的選擇中起決定性作用。同源重組修復(fù)需要核酸酶在斷裂末端切除修飾形成一個(gè)200 bp左右的單鏈同源臂。細(xì)胞周期嚴(yán)格調(diào)控的某些同源重組修復(fù)早期啟動(dòng)因子，如BRCA1、BLM（bloom syndrome protein）、Exo1（exonuclease 1）等，在DSB末端切除過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在非同源重組末端連接中這類(lèi)末端切除修飾則被抑制，DSB修復(fù)關(guān)鍵調(diào)控蛋白53BP1在DSB位點(diǎn)的迅速聚集保護(hù)其末端免于過(guò)度切除，從而決定細(xì)胞DSB損傷的修復(fù)方式，并參與調(diào)節(jié)不同DSB修復(fù)途徑在細(xì)胞周期各時(shí)相中的優(yōu)勢(shì)選擇［25-28］。病理情況下，同源重組修復(fù)相關(guān)蛋白的失活將導(dǎo)致細(xì)胞自發(fā)基因突變率的升高、基因組穩(wěn)定性的降低，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生率的升高。近年來(lái)，聚ADP核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抑制劑由于對(duì)多種同源重組修復(fù)缺陷型腫瘤具有較好的治療效果，因而被美國(guó)食品及藥物管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)，并已廣泛應(yīng)用于BRCA1缺陷型乳腺癌。然而已有臨床和基礎(chǔ)研究報(bào)道提示，部分BRCA1缺陷型三陰性乳腺癌對(duì)PARP抑制劑具有較高的耐藥性，其機(jī)理可能與53BP1的協(xié)同缺失及其引起的同源重組修復(fù)能效恢復(fù)有關(guān)［29-30］。如圖6所示，當(dāng)53BP1和BRCA1（或BLM、Exo1等）功能均正常時(shí)，細(xì)胞中的BRCA1會(huì)識(shí)別DSB位點(diǎn)并抑制53BP1與其結(jié)合，促進(jìn)DSB末端切除復(fù)合體（DNA end resection complex，ERC）等功能蛋白對(duì)受損DNA末端的識(shí)別和切除，從而啟動(dòng)同源重組修復(fù)。如果同源重組早期啟動(dòng)因子缺失，而53BP1正常表達(dá)，由于53BP1對(duì)DSB末端切除功能的抑制，同源重組修復(fù)缺少必要的啟動(dòng)條件，DSB將主要通過(guò)非同源重組末端連接途徑進(jìn)行易錯(cuò)修復(fù)，導(dǎo)致輻射敏感性和基因組不穩(wěn)定性的增加，細(xì)胞死亡。如果同源重組修復(fù)早期啟動(dòng)因子和53BP1同時(shí)缺失，由于53BP1抑制作用解除，同源重組修復(fù)功能得到補(bǔ)償，細(xì)胞對(duì)輻射的抗性也隨之增強(qiáng)［28-30］。巧合的是，我們?cè)谇捌诠ぷ髦邪l(fā)現(xiàn)，53BP1的缺失還與BCCIP陰性的TNBC高度相關(guān)［11］。因此我們提出假設(shè)，53BP1缺失通過(guò)補(bǔ)償BCCIP缺陷造成的同源重組修復(fù)效能降低來(lái)維持基因組的穩(wěn)定性，從而提高細(xì)胞的輻射抗性。

圖6 BRCA1和53BP1共同缺失導(dǎo)致部分恢復(fù)輻射引起的同源重組修復(fù)［7］Fig.6 Co-deficiency of BRCA1 and 53BP1 resulted in restoration of homologous recombination repair［7］

為驗(yàn)證這一假說(shuō)，本研究在小鼠乳腺癌等多種細(xì)胞中首先構(gòu)建穩(wěn)定敲低BCCIP的細(xì)胞株，在此基礎(chǔ)上通過(guò)siRNA敲低53BP1，構(gòu)建BCCIP/53BP1雙缺失細(xì)胞。通過(guò)PNA熒光探針FISH技術(shù)聯(lián)合高通量自動(dòng)捕獲系統(tǒng)對(duì)輻射誘導(dǎo)染色體畸變進(jìn)行大規(guī)模分析，結(jié)果表明，敲低BCCIP引起細(xì)胞輻射后染色體畸變率的顯著增加，這一結(jié)果與先前的文獻(xiàn)報(bào)道相符［12］。而53BP1的額外缺失則降低了BCCIP陰性乳腺癌細(xì)胞染色體高畸變率的發(fā)生，從而增加輻射后細(xì)胞基因組穩(wěn)定性的維持能力。隨后，通過(guò)對(duì)輻射后DSB損傷標(biāo)志物γH2AX的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，53BP1的缺失促進(jìn)了BCCIP陰性乳腺癌細(xì)胞DSB修復(fù)能力。進(jìn)一步利用兩種不同的DSB修復(fù)檢測(cè)方法均發(fā)現(xiàn)，53BP1缺失通過(guò)補(bǔ)償BCCIP陰性細(xì)胞的同源重組修復(fù)效率，進(jìn)而提高細(xì)胞應(yīng)對(duì)DSB損傷的能力。最后，通過(guò)克隆形成試驗(yàn)證實(shí)了53BP1的缺失增強(qiáng)了BCCIP陰性細(xì)胞的輻射抗性。這些結(jié)果提示，BCCIP/53BP1雙缺失型TNBC的高輻射抗性可能通過(guò)丟失53BP1使BCCIP陰性細(xì)胞解除對(duì)同源重組修復(fù)的抑制，進(jìn)而增加BCCIP陰性乳腺癌細(xì)胞同源重組修復(fù)的效率，最終增強(qiáng)了細(xì)胞的放療抗性。

綜上所述，本研究從BCCIP/53BP1這條新途徑闡明TNBC高輻射抗性的原因，明確了BCCIP/53BP1雙缺失乳腺癌細(xì)胞高放療抗性是通過(guò)53BP1的缺失增強(qiáng)了BCCIP陰性細(xì)胞DSB損傷的同源重組修復(fù)能力。目前已報(bào)道的BRCA1/p53途徑只能解釋約50% TNBC輻射敏感性的調(diào)節(jié)機(jī)制，而本研究的發(fā)現(xiàn)說(shuō)明了另外50% TNBC輻射抗性更強(qiáng)的原因，從而為全面闡明TNBC高輻射抗性的分子機(jī)制，尋找新的潛在放療增敏分子靶標(biāo)，提供了理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)依據(jù)。