張 萌，陳東圳，寧 攀，任研偉，李 陽，張 亮

（1.西安交通大學第一附屬醫(yī)院，西安 710061；2.西安工程大學材料工程學院，紡織行業(yè)功能感知纖維及異形織造技術重點實驗室，西安 710048；3.西安交通大學生命科學與技術學院，西安 710049）

表面增強拉曼散射（surface-enhanced Raman scattering，SERS）是一種超靈敏的光譜分析技術［1］。該技術主要利用激光激發(fā)產(chǎn)生的局部表面等離子體共振（localized surface plasmon resonance，LSPR）效應進行傳感分析。該效應可以放大貴金屬納米結構表面的局部電磁場強度，極大地增強吸附或者靠近貴金屬納米結構表面靶標分子的拉曼信號，從而產(chǎn)生SERS指紋譜信號，并從SERS信號中獲取分子的結構信息。SERS技術已被應用于各種生物分子、生物細胞的無損檢測，靈敏度甚至可以達到單分子水平［2］。毫無疑問，SERS技術具有良好的傳感靈敏度，在微生物細胞的檢測中具有獨到的優(yōu)勢。細菌是一種對人類社會產(chǎn)生巨大危害和影響的微生物，合理的研究利用SERS技術實現(xiàn)對活性細菌的快速和原位檢測具有重要意義［3］。如評估抗生素的功效、對抗“超級細菌”感染或抗菌素耐藥性等［4］。一般的SERS增強基底材料均具有較強的殺菌能力，而活性細菌的原位檢測難度較大。

基于上述存在的問題，本研究團隊前期開發(fā)了一種Ta原子摻雜的Ta@Ag多孔薄膜，Ta原子的摻雜有效抑制了Ag納米結構的殺菌性能，提高了Ag納米表面的生物相容性，實現(xiàn)了活性細菌的原位檢測分析［5］。然而，由于Ta@Ag多孔薄膜是一種平面二維結構，當細菌吸附于薄膜表面時，Ta@Ag薄膜表面的光激發(fā)等離子體共振區(qū)域通常被細菌覆蓋，獲得穩(wěn)定的SERS信號具有一定困難。此外，研究發(fā)現(xiàn)，“納米間隙”和“納米針尖”結構能極大放大局部電磁場強度，形成SERS“熱點”區(qū)域，提高檢測的靈敏度［6-8］。因此，等離子體“納米間隙”和“納米針尖”結構是一種極為有效的SERS增強基底［6-8］。研發(fā)具有較高SERS信號靈敏度、良好細菌細胞生物兼容性的等離子體貴金屬納米結構具有重要意義。

本論文通過使用無機的雙氧水作為“清潔”還原劑，無機硝酸銀作為反應調控劑，在低溫下（10℃）進行各相異性生長，制備出一種毛丹狀Au@Ag合金納米顆粒。首先，該納米結構表面分布有致密的單晶“納米針尖”，在適合波長的激發(fā)光激發(fā)下，可產(chǎn)生極強的LSPR效應，從而形成致密分布的SERS“熱點”。其次，毛丹狀Au@Ag合金納米顆粒具有較好的細菌生物兼容性，細菌吸附該納米結構仍能保持良好的生物活性。最后，在細菌表面吸附毛丹狀Au@Ag合金納米顆粒，并采用633 nm的激發(fā)光激發(fā)納米結構表面的LSPR效應，進而實現(xiàn)細菌表面功能化學基團的原位檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

試驗中所用到的主要化學藥品均為分析純，分別有硝酸銀、雙氧水、氯金酸等。試驗中使用的主要設備有：玻璃反應瓶、 全自動數(shù)控干燥箱、分析天平、攪拌器、離心機、數(shù)控超聲波清洗器等。采用的細菌是大腸桿菌（Esherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。

1.2 試驗方法

1.2.1 毛丹狀Au@Ag合金納米結構制備

將0.45 mL的HAuCl4水溶液（12.50 mol/L）加入燒瓶，加入10 mol/L 的硝酸銀水溶液，緊接著加入90 μL的金種子溶液和30 μL的冰水。然后，將燒瓶放入10℃的水浴中，磁力攪拌（200 r/min）10 min，滴加堿性雙氧水溶液還原HAuCl4。磁力攪拌反應10 min后，離心收集制備的納米結構。

1.2.2 材料結構表征

采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡（FEI Verios 460）和透射電子顯微鏡（JEM-200CX）進行表面結構形貌的表征；X射線能譜（energy dispersive X-ray spectrometer，EDS）分析采用能譜儀（EDS-OCTANE plus module）進行表征；紫外可見吸收光譜采用的光譜儀型號為Lambda 950；拉曼光譜采用激光拉曼光譜儀（HORIBA, LabRAM HR Evolution）進行表征分析。

1.2.3 毛丹狀Au@Ag合金納米結構細菌細胞相容性測試

細菌的生物活性采用平板計數(shù)法進行研究。將0.5 mL的原始濃度、二分之一濃度、四分之一濃度、八分之一濃度的毛丹狀Au@Ag合金多級納米顆粒溶液紫外照射60 min殺菌，然后分別與革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）液進行1∶1體積的混合，室溫下作用3 h后取100 μL的大腸桿菌懸浮液涂布在LB固態(tài)培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h，通過菌落數(shù)量計算細菌的存活率。

1.2.4 SERS檢測

首先，將毛丹狀Au@Ag合金納米結構與細菌細胞滴加混合；然后，將表面吸附有Au@Ag合金納米結構的細菌滴加至硅片表面；最后，置于拉曼光譜儀信號采集平臺進行檢測，激發(fā)光波長選擇633 nm，積分時間為1～15 s，激發(fā)光功率為1～5 mW。

2 結果與討論

2.1 毛丹狀Au@Ag合金納米結構

采用濕化學還原反應法制備毛丹狀Au@Ag合金多級納米結構。如圖1a所示，毛丹狀Au@Ag合金多級納米結構表面呈現(xiàn)出致密的納米針尖結構（圖1a），納米顆粒平均直徑約為80 nm，表面致密的納米針尖分布清晰可見，其中大量分布的致密的納米針尖可產(chǎn)生較高的納米級粗糙度，致密的納米針尖之間可形成大量的納米間隙區(qū)域，該納米間隙區(qū)域也可產(chǎn)生較大的比表面積，有利于提高單個毛丹狀Au@Ag合金多級納米結構對靶標分子的吸附能力。圖1b為單個毛丹狀Au@Ag合金納米顆粒表面局部放大的透射電子顯微鏡圖像（transmission electron microscope image，TEM）形貌圖，分析發(fā)現(xiàn)，每一個納米針尖呈現(xiàn)出單晶結構。研究發(fā)現(xiàn)，“納米間隙”和“納米針尖”結構均為極好的SERS“熱點”結構，吸附于該結構區(qū)域的靶標分子可產(chǎn)生明顯的SERS信號［8-9］。然而，在常用的SERS檢測中，制備 “納米間隙”和“納米針尖”表面結構具有較大困難［10］。水熱反應或者濕化學合成工藝通常使用足量的表面活性劑分子和有機還原劑分子，這種吸附行為會產(chǎn)生阻擋效應，增加靶標分子吸附在“納米間隙”或“納米針尖”區(qū)域中的阻力，從而降低SERS信號的靈敏度［3，5-6，11］。因此，本研究采用堿性無機雙氧水作為還原劑，并以無機硝酸銀鹽作為誘導劑，從源頭避免引入任何表面活性劑和有機還原劑，最后制備出了毛丹狀Au@Ag合金納米結構。分析發(fā)現(xiàn)，毛丹狀Au@Ag合金納米結構生長過程分為兩步：1）氯金酸、硝酸銀還原產(chǎn)生的金、銀原子沉積在金種子表面，并形成大量生長位點，較低的反應溫度（10℃）導致較慢的反應速率［8，14-18］；2）還原產(chǎn)生的銀原子通過欠電位沉積，選擇性地吸附在不同晶面，這種對晶面的選擇性吸附效應抑制了金原子在特定晶面的沉積，最終產(chǎn)生各向異性的生長［3，12-16］，并形成具有多針尖的毛丹狀Au@Ag合金納米結構（圖1a、1b）。

圖1 毛丹狀Au@Ag合金納米結構Fig.1 Rambutan-like Au@Ag alloy nanostructure

2.2 毛丹狀Au@Ag合金納米結構對細菌細胞的吸附及細菌兼容性

依據(jù)Song等［17］的報道 ，高表面粗糙度的花粉狀納米結構對細胞表面具有很強的黏附能力。毛丹狀Au@Ag合金納米結構具有多針狀的表面結構和較高的納米級表面粗糙度。因此，本研究分別將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌與毛丹狀Au@Ag合金納米結構混合，然后觀察毛丹狀Au@Ag合金納米結構在細菌表面的吸附能力。TEM表征發(fā)現(xiàn)，毛丹狀Au@Ag合金納米結構在細菌表面具有很強的吸附能力（圖2）。因此，可有效利用毛丹狀Au@Ag合金納米結構進行細菌表面的SERS傳感分析。

圖2 細菌細胞吸附毛丹狀Au@Ag合金納米顆粒Fig.2 Bacterial cell absorbed by rambutan-like Au@Ag alloy nanoparticles

此外，基于平板計數(shù)法，本研究進一步分析了毛丹狀Au@Ag合金納米顆粒對細菌細胞的生物兼容性。不同濃度的毛丹狀Au@Ag合金納米結構作用于革蘭氏陰性菌（大腸桿菌），孵育一定時間。然后，將大腸桿菌懸浮液接種在固體LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16 h，通過菌落數(shù)量觀察細菌的存活數(shù)量。試驗發(fā)現(xiàn)，毛丹狀Au@Ag合金納米顆粒和大腸桿菌孵育作用后，大腸桿菌均能繁殖生長出較致密的菌落（圖3），不同的存活率均在誤差可接受的范圍。由圖3、4的數(shù)據(jù)可以進一步發(fā)現(xiàn)，毛丹狀Au@Ag合金納米顆粒對于大腸桿菌具有較好的生物兼容性，毛丹狀Au@Ag合金納米顆粒溶液與大腸桿菌孵育作用后，大腸桿菌仍能保持較高的生物活性。在大腸桿菌的兼容性試驗中，Au@Ag合金納米顆粒對其具有較好的兼容性。分析認為，本文制備的是一種Au@Ag合金納米球，Au是人類發(fā)現(xiàn)的化學性能最穩(wěn)定、生物相容性最好的金屬元素之一，因此對不同的微生物細胞具備普遍適用的生物相容性。

圖3 毛丹狀Au@Ag合金納米顆粒細菌細胞生物兼容性測試Fig.3 Biocompatibility test of bacterial cell for rambutan-like Au@Ag alloy nanoparticles

2.3 毛丹狀Au@Ag合金納米結構LSPR性能分析

金、銀納米結構的光學性能受控于納米結構的形貌。研究發(fā)現(xiàn)，納米球、納米棒、納米立方體、納米八面體、納米十面體以及納米二十面體等一系列不同的納米結構具有不同的光學性能［18］。其中的分支狀或者星形金、銀納米結構受到了研究人員的廣泛關注。試驗研究和理論計算分析表明，星形納米結構的納米針尖和納米間隙能產(chǎn)生極強的局部電磁場強度放大，而與其相關的LSPR 帶通常位于可見光到近紅外光波長范圍，使得該類納米結構在SERS生物傳感分析中具有極大優(yōu)勢。本研究提出的毛丹狀Au@Ag合金納米結構表面具有致密的納米針尖結構。 因此，本研究采用紫外吸收可見光譜和時域有限差分法研究了毛丹狀Au@Ag合金納米結構的光學性能。

研究發(fā)現(xiàn)，制備的毛丹狀Au@Ag合金納米結構呈現(xiàn)出明顯的LSPR特征峰及特殊的光學性能。圖5a展示了毛丹狀Au@Ag合金納米結構的紫外可見吸收光譜，其吸收峰位于 630 nm 波長。這一波長與SERS檢測中常用的633 nm的激發(fā)波長相匹配，因此可以產(chǎn)生表面增強共振拉曼散射，提高SERS分析的靈敏度。位于“納米針尖”或者“納米間隙”區(qū)域位置的電磁場強度的放大是產(chǎn)生拉曼增強的主要因素。為闡明毛丹狀Au@Ag合金納米結構與電磁場強度增強、激發(fā)光波長之間的對應關系，本研究模擬了毛丹狀Au@Ag合金納米結構在633 nm激發(fā)光激發(fā)下產(chǎn)生的局部電磁場強度分布。

首先， 本文根據(jù)毛丹狀Au@Ag合金納米結構的TEM，建立了毛丹狀Au@Ag合金納米結構的三維物理模型。其次，基于建立的物理模型，研究使用時域有限差分方法計算了633 nm激發(fā)光條件下Au@Ag合金納米結構的表面電磁場強度分布。計算中入射光設定為x軸方向，電場方向對應為y軸方向，磁場方向對應為z軸方向，網(wǎng)格尺寸設定為2 nm，并假定計算模型懸浮于空氣中（n=1.0）。計算中忽略納米結構的化學增強效應以及銀元素在金銀合金中的影響。分析發(fā)現(xiàn)，在633 nm的激發(fā)光激發(fā)下，“納米針尖”區(qū)域可產(chǎn)生較強的局部電磁場強度放大（圖5b），且毛丹狀Au@Ag合金納米結構周圍存在一定的非定域電磁場分布。這一分析結果支持采用633 nm的激發(fā)光進行后續(xù)的SERS傳感。

圖5 毛丹狀Au@Ag合金納米結構的局部表面等離子體共振性能Fig.5 Localized surface plasmon resonance property of rambutan-like Au@Ag alloy nanostructure

圖4 毛丹狀Au@Ag合金納米顆粒與大腸桿菌細胞作用后細菌的存活率Fig.4 The survival rate of Escherichia coli treated by rambutanlike Au@Ag alloy nanoparticles

2.4 SERS細菌檢測

如圖6所示，將表面吸附有毛丹狀Au@Ag合金納米顆粒的大腸桿菌滴加至無菌的單晶硅片表面，然后置于拉曼檢測平臺進行檢測。分析發(fā)現(xiàn)，在633 nm的激發(fā)光激發(fā)下，毛丹狀Au@Ag合金納米結構表面能夠產(chǎn)生極強的LSPR效應。因此，本研究采用633 nm的激發(fā)光，檢測由毛丹狀Au@Ag合金納米結構增強的細菌拉曼信號，測試的SERS光譜如圖6c所示，具體的拉曼特征峰如表1所示。其中典型的拉曼位移位置為560 cm–1、772～910 cm–1、932 cm–1、1 102 cm–1、1 430 cm–1，這些拉曼特征峰位置分別代表糖類、核酸、蛋白質ν（C-C）及苯丙氨酸（蛋白質）、β-胡蘿卜素及δ（CH2）。此外，使用1 430 cm–1拉曼位移處的特征峰對細菌表面進行成像（圖6b），結果顯示在局部區(qū)域呈現(xiàn)出較強的SERS信號，分析認為該區(qū)域應吸附有較為致密的毛丹狀Au@Ag合金納米顆粒。

圖6 SERS傳感檢測大腸桿菌Fig.6 SERS sensing of E.coli

表1 細菌的典型拉曼特征峰Tab.1 Typical Raman characteristic peaks of bacteria

本研究將毛丹狀Au@Ag合金納米顆粒吸附于細菌表面，然后滴加于硅片表面進行細菌SERS信號的激發(fā)及收集。本研究設計的這種檢測方法的優(yōu)點主要如下：第一，構建的毛丹狀Au@Ag合金納米顆粒具有較高的表面粗糙度和致密的納米針尖結構，能在三維的細菌表面進行吸附［5］，且能保持較高的細菌生物活性；第二，構建的毛丹狀Au@Ag合金納米顆粒在單顆粒表面具有大量的“納米針尖”和“納米間隙”，這種結構可產(chǎn)生較強的LSPR效應［3］；第三，將毛丹狀Au@Ag合金納米顆粒吸附于細菌表面，可以有效地增強細菌表面的SERS信號，且制樣簡便，在實際檢測中容易操作。

3 討論

SERS作為一種檢測細菌的熱門技術，一直都是研究者所關注的焦點。在以往的研究中，多是研究如何增強拉曼散射強度，而忽略了大多基底材料具有的殺菌效果。本研究團隊在之前的研究基礎上，采用具有較好細菌細胞兼容性的Au@Ag合金納米顆粒，同時也提出了利用毛膽狀納米結構來增強拉曼信號。首先，使用無機堿性雙氧水作為“清潔”還原劑，還原制備了一種毛丹狀Au@Ag合金納米顆粒，該制備方法能從源頭避免有機還原劑、表面活性劑的引入，從而避免有機分子對SERS基底材料的不可逆吸附和污染。研究發(fā)現(xiàn)，毛丹狀Au@Ag合金納米顆粒對細菌表面具有較強的吸附能力，且細菌能保持較高的生物活性，毛丹狀Au@Ag合金納米顆粒在單顆粒表面具有大量的“納米針尖”和“納米間隙”，這種結構可產(chǎn)生較強的LSPR效應?；谖覀兊募毦皆囼灒梢钥隙ǖ氖?，毛丹狀Au@Ag合金納米結構對革蘭氏陽性細菌（金黃色葡萄球菌）和革蘭氏陰性細菌（大腸桿菌）都具有很好的吸附效果。其主要原因是毛丹狀Au@Ag合金納米結構具有粗糙的表面結構，該結構表面存在類似于花粉顆粒的毛刺狀物理結構，這樣的物理結構必然具有很好的吸附掛載能力。一般情況下，該類結構不管是對細菌還是哺乳動物細胞，都具有良好的吸附能力。

本論文的研究，僅對大腸桿菌的生物兼容性進行了測試，測試發(fā)現(xiàn)毛丹狀Au@Ag合金納米結構對大腸桿菌的生物兼容性良好。Au單質是人類發(fā)現(xiàn)的化學性能最穩(wěn)定、生物相容性最好的金屬元素之一。Au@Ag合金納米結構中Au是起主導作用的元素，目前大部分的等離子體生物檢測都會用到Au納米結構。利用以上特點，本研究檢測了活性細菌的SERS指紋譜信號，表明了SERS分析方法能廣泛應用于微生物細胞的檢測分析。