周 岳，顏 貝，田 稼， 賈邵彤，裴承斌，王紅紅，王紅燕*，馬良宏*

1寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 寧夏人類精子庫；2寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點實驗室，銀川 750001；3寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖中心，銀川 750004

精子冷凍作為保存男性生育力的有效手段，是當(dāng)今人類輔助生殖技術(shù)過程中不可或缺的一部分。超低溫會導(dǎo)致精子運動能力受損，且冷凍和解凍過程冰晶的形成以及此過程中過度氧化應(yīng)產(chǎn)生大量活性氧可對精子的結(jié)構(gòu)和功能造成損傷[1]。實驗室人員將精子與冷凍保護(hù)劑混勻后一起冷凍，可降低其死亡率。目前常用的冷凍保護(hù)劑為甘油-卵黃-檸檬酸鹽(GEYC)保護(hù)劑[2]，但是常規(guī)的冷凍保護(hù)劑對于弱精癥精子冷凍效果較差。近幾年，國內(nèi)外學(xué)者將天然或人工合成物質(zhì)加入冷凍保護(hù)劑以減輕精子的冷凍損傷；研究人員發(fā)現(xiàn)保護(hù)劑中添加左旋肉堿可有效地降低精子DNA碎片率、精子細(xì)胞凋亡率[3]；此外，研究人員在冷凍保護(hù)劑中加入Vit E，Zn2+以及抗氧化劑(MitoQ)發(fā)現(xiàn)，這些抗氧化物質(zhì)的加入，可以緩解凍融過程對精子造成的傷害，在一定程度上提高凍融后精子活動力、存活率及精子DNA完整性[4-6]。越來越多的科研人員正在努力找到更有利于精子凍后活力的天然保護(hù)劑。

淫羊藿，一種中國的古老中藥材，是我國應(yīng)用最廣，最具開發(fā)潛力的中草藥之一，淫羊藿多糖(EPS)提煉于此種藥材。近年來，越來越多研究發(fā)現(xiàn)，EPS具有抗病毒，抗衰老，抗氧化，清除氧自由基[7-9]等作用。本實驗在人類精液冷凍過程中常用的GEYC冷凍保護(hù)劑基礎(chǔ)上，加入EPS，探究優(yōu)化的保護(hù)劑對于精子凍后活力和功能的影響。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

選取2019年6～9月在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的15名弱精癥患者，年齡31.9±7.5歲，精液體積2.5±0.6 mL，精子總活力28.7%±5.4%。其納入判定標(biāo)準(zhǔn)：按照WHO(人類精液檢查與處理實驗室手冊》(2011年第五版)標(biāo)準(zhǔn)，選擇精液體積≥1.5 mL，精子總數(shù)≥39×106/mL)，精子前向運動PR<32%，精子(PR+NP)<40%。本課題經(jīng)過寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會倫理通過，并經(jīng)患者知情同意后進(jìn)行。

1.2 試劑及儀器

淫羊藿多糖(S24632，上海源葉生物科技有限公司)；精子計數(shù)板(SEFI medical instruments，Israel)；Diff Quik快速染色試劑盒(G1541；Solarbio)；丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；精子細(xì)胞氧化應(yīng)激活性超氧陰離子檢測試劑盒(GMS14034；GENMED)；DFI流式細(xì)胞檢測試劑盒(CP0101；Cellpro Biotechnology)；精子頂體染色流式細(xì)胞檢測試劑盒(CP01011；Cellpro Biotechnology)；計算機輔助精液分析系統(tǒng)(CASA)(偉力)；透射電鏡(JEM1200-EX TEM，JEOL)。

1.3 分組與處理

所有研究對象均禁欲3～5天，手淫法留取標(biāo)本于無菌取精杯中，每份患者精液樣本首先置于37 ℃水浴搖床液化30 min，實驗每份樣本平均分為Fresh組，G0組(無EPS添加)、G1組(含1.0 mg/mL EPS)、G2組(含2.0 mg/mL EPS)、G3組(含3.0 mg/mL EPS)、G4組(含4.0 mg/mL EPS)、G5組(含5.0 mg/mL EPS)。精液液化后，用BWW(精子培養(yǎng)液)稀釋精液樣本，500 g離心10 min，棄掉上清，分別加入1 mL精子培養(yǎng)液(按照分組加入相應(yīng)量的EPS)37 ℃孵育20 min；然后進(jìn)入精子冷凍過程；冷凍保護(hù)劑基礎(chǔ)液體按照WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》(2011年第五版)推薦的GEYC(甘油-卵黃-檸檬酸鹽)保護(hù)劑，分別按分組加入相應(yīng)的EPS。各組冷凍保護(hù)劑均需通過0.22 μm的濾器過濾，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 精子冷凍和復(fù)蘇

1.4.1 手工二步冷凍法

將精液和保護(hù)劑以2∶1的比例添加到冷凍保存管中，并將冷凍保存管放置在距液氮表面約5 cm的高度10 min。隨后，將其降低至液位以上0.1 cm不與液位接觸)5 min；然后將其浸入液氮中保存。

1.4.2 精子復(fù)蘇

凍存1個月后，取出凍存管在水浴箱內(nèi)復(fù)溫，10 min后進(jìn)行檢查；輕柔顛倒10次混勻，取樣進(jìn)行精子活力及其他分析。

1.5 精子相關(guān)參數(shù)檢測

1.5.1 CASA分析

相差顯微鏡下，采用CASA(計算機輔助精子分析)檢測PR(精子活力)以及精子活動度的各項指標(biāo)(VSL、VCL、VAP)。

1.5.2 精子存活率實驗

使用WHO指南推薦的伊紅-苯胺黑檢測存活率。首先，用生理鹽水將精子濃度調(diào)節(jié)至2×106～50×106，并將25 μL精液和等體積的伊紅-苯胺黑懸浮液添加到1.5 mL離心管中，混合并靜置30 s用每種精子懸浮液進(jìn)行精子涂片，在空氣中干燥并在干燥后立即檢查。在油鏡下用明場顯微鏡(放大倍數(shù)，×1 000)檢查每個載玻片。利用實驗室計數(shù)器，對染色的和未染色的精子進(jìn)行計數(shù)。每個樣品進(jìn)行兩次評估，并評估200個精子，以達(dá)到可接受的低抽樣誤差。如果差異太大，則進(jìn)行重新采樣和重新評估。

1.5.3 精子形態(tài)學(xué)檢測

使用Diff Quik快速染色試劑盒進(jìn)行精子染色。首先，用生理鹽水將精子濃度調(diào)節(jié)至(2×106～50×106)，然后制備精子涂片，將其浸入染料Ⅰ中10 sec，然后將速溶染料Ⅱ浸5 s。然后將載玻片在流水下沖洗以除去過量的染料溶液。密封后評估總共200個精子。記錄正常和異常精子的數(shù)量并計算百分比。

1.6 精子功能檢測

1.6.1 精子核碎裂指數(shù)(DFI)

通過SCSA(精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)測定法)評估精子DFI。原理：染料吖啶橙與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)出綠色熒光，與單鏈DNA結(jié)合的而發(fā)出紅色熒光，通過流式細(xì)胞儀檢測不同熒光的比例來判斷DNA的完整性。選擇DFI流式細(xì)胞檢測試劑盒(CP0101；Cellpro Biotechnology)，具體操作如下：將精子1×106～2×106/mL用液體A稀釋至終體積100 μL。隨后，添加200 μL B溶液，然后孵育30 s(需要精確的時間)。加入600 μL溶液C。然后使用BD Accuri C6(美國BD Biosciences)檢測其熒光，調(diào)節(jié)FL1和FL3通道的電壓以使主要細(xì)胞群出現(xiàn)在指定的門中。穩(wěn)定運行兩min后，將精子流速控制在100～300/sec開始收集信息。至少收集5 000 個精子，每個樣本至少檢測兩次。收集數(shù)據(jù)后，將流式細(xì)胞儀(FCS)文件復(fù)制到DFI-View軟件(DFI-View，Cellpro Biotechnology)中進(jìn)行分析。

1.6.2 精子頂體反應(yīng)(AR)

通過凝集素免疫熒光染色法評估精子發(fā)生AR的能力。原理：利用PSA(豌豆凝集素)可與精子頂體中糖蛋白特異結(jié)合的特性，PSA可作為探針檢測頂體反應(yīng)。鈣離子載體A23187可誘導(dǎo)精子發(fā)生頂體反應(yīng)。選用精子頂體染色流式細(xì)胞檢測試劑盒(CP01011；Cellpro Biotechnology)。具體操作如下：用溶液A將精子濃度調(diào)整為4×106～5×106個活精子。準(zhǔn)備兩個1.5 mL離心管，分別加入10 μL溶液B和10 μL溶液C。混合并在37 ℃下孵育15 min，然后將100 μL預(yù)冷的70%乙醇加入每個試管中，然后孵育2 min。將該混合物以500× g離心5 min，棄去上清液，加入500 μL染色工作溶液(溶液D和溶液E的混合物)，然后搖動并混合。隨后，將混合物在37 ℃下孵育15 min。在BD Accuri C6上，調(diào)整FL1通道的電壓，以使主要細(xì)胞群處于指定的門中。將精子流速控制在100～300/sec，至少收集5 000個精子，每個樣品至少分析兩次。將流式細(xì)胞儀(FCS)文件復(fù)制到軟件中進(jìn)行分析。

1.7 丙二醛(MDA)的檢測

通過硫代巴比妥酸(TBA)比色法檢測MDA。選擇南京建城生物制劑有限公司的MDA檢測試劑盒進(jìn)行檢測。嚴(yán)格按照根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，并通過分光光度計讀取吸光度值。

1.8 活性氧的檢測

選擇精子細(xì)胞氧化應(yīng)激活性超氧陰離子試劑盒(GMS14034；GENMED)進(jìn)行檢測。嚴(yán)格按照根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。本實驗室中，二氫溴化乙啶(dihydroethidium bromide；hydroethidine；DHE)，可穿過細(xì)胞膜。一旦被包括過氧化氫，過氧化物和過亞硝酸鹽陰離子的分子氧化，它就會產(chǎn)生熒光。采用BD Accuri C6 488 nm的激發(fā)波長進(jìn)行分析。精子流速控制在100/sec，收集至少10 000個精子，每個樣品至少檢測兩次。

1.9 精子電鏡分析

精液標(biāo)本液化以后0.85% NaCl洗滌2 次并離心(3 500 rpm)10 min后，棄上清，再沿離心管內(nèi)壁緩慢滴加2.5%戊二醛固定液，置于4 ℃冰箱內(nèi)固定2～4 h，再用鋨酸后固定，蒸餾水清洗，Epon812環(huán)氧樹脂包埋，半薄切片，甲苯胺藍(lán)染色，光鏡下定位。取精子細(xì)胞區(qū)作超薄切片，日立H-7000透射電鏡觀察，重點觀察精子頭部質(zhì)膜的變化。

1.10 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 EPS最佳抗氧化濃度的篩選

冷凍復(fù)蘇后發(fā)現(xiàn)2.0 mg/mL和3.0 mg/mL組的MDA含量較未添加組(0 mg/mL)明顯降低(P<0.05)，3.0 mg/mL組ROS含量最低，且明顯低于其他干預(yù)EPS組(見圖1)；此后實驗選用濃度為3.0 mg/mL作為EPS干預(yù)組進(jìn)行后續(xù)研究。未冷凍組作為新鮮對照組(fresh)，0 mg/mL組作為空白對照組(control)。

圖1 各組MDA含量以及ROS陽性細(xì)胞占比折線圖Fig.1 The content of MDA and the percentage of ROS positive cells in each group注：Fresh：新鮮對照組；0：空白對照組。Note:Fresh:Fresh control group;0:Blank control group.

2.2 凍后精子精子活力以及正常形態(tài)等相關(guān)參數(shù)的比較

精子冷凍后，PR顯著降低，且空白對照組和淫羊藿多糖組之間無顯著差異；冷凍后，精子存活率降低明顯，淫羊藿多糖組顯著高于空白對照組。VCL、VSL、VAP降低，且淫羊藿多糖組的VCL、VAP較空白對照組明顯升高，但兩組間VSL差異不顯著(見表1)。

表1 精液冷凍復(fù)蘇前后精子活力以及存活率

表2 精子畸形率

精子正常形態(tài)率空白對照組(2.3%±0.6%)較新鮮對照組(4.2%±1.1%)降低，EPS組(3.2%±0.8%)較空白對照組升高?；温式y(tǒng)計結(jié)果顯示，空白對照組頭部畸形率，中段畸形率，主段畸形率較新鮮對照組顯著升高，淫羊藿多糖組頭部畸形率較空白對照組顯著降低(P<0.05)(見圖2、表2)。

圖2 Diff-Quik精子染色顯示精子形態(tài)和伊紅-苯胺黑染色檢測精子存活率Fig.2 Diff-Quik sperm staining showed sperm morphology and eosin-aniline black staining to detect sperm survival rate注：*表示精子頂體異常；頭部染成紅色或暗粉色認(rèn)為死精子(白色D)；頭部染成白色或淺粉色認(rèn)為活精子(L)；標(biāo)尺：20 μm。Fresh：新鮮對照組；Control：空白對照組；EPS：淫羊藿多糖組。Note:*Abnormal acrosome structure of sperm;the head is dyed red or dark pink,which is considered dead sperm (white D);the head is dyed white or light pink,which is considered live sperm (L);Scale:20 μm.Fresh:Fresh control group;Control:Blank control group;EPS:Epimedium polysaccharide group.

2.3 精液冷凍后精子DFI及AR水平比較

精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)測定(SCSA)法評估精子DFI，并通過數(shù)據(jù)分析軟件對流式結(jié)果進(jìn)行了分析。綠色熒光是吖啶橙染料與雙鏈DNA結(jié)合而發(fā)出的，吖啶橙染料與單鏈DNA結(jié)合發(fā)出紅色熒光。如圖3所示，精子冷凍后，空白對照組DFI(29.69%±6.62%)和淫羊藿多糖組的DFI(22.34%±5.32%)較新鮮組(8.47%±2.83%)明顯增高(P<0.05)，且淫羊藿多糖組的DFI顯著低于空白對照組(P<0.05)。采用凝集素免疫熒光染色法檢測精子AR反應(yīng)。鈣離子載體A23187誘導(dǎo)頂體反應(yīng)后，相對熒光強度減弱，顯示為熒光峰向左移動；精子冷凍后，空白對照組AR(7.35%±1.92%)和淫羊藿多糖組AR(10.13%±2.79%)較新鮮組(12.36%±1.53%)明顯降低(P<0.05)，且EPS組的AR顯著高于空白對照組(P<0.05)(見圖4)。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測到的精子DFIFig.3 Sperm DFI detected by flow cytometry注：第一行：FSC/SSC點圖(R1：目標(biāo)細(xì)胞群)；第二行：熒光散點圖(FL1-H：綠色熒光；FL3-H：紅色熒光)。Note:First row:FSC/SSC dot plot (R1:Target cell population);Second row:Fluorescence scatter plot(FL1-H:Green fluorescence;FL3-H:Red fluorescence).

圖4 精子頂體反應(yīng)熒光直方圖Fig.4 Sperm acrosome reaction histogram注：紅色：表示不存在鈣離子載體(A23187)時精子中頂體的熒光分布直方圖；綠色：表示存在鈣離子載體(A23187)時精子中頂體的熒光分布直方圖。Note:Red:the fluorescence distribution histogram of acrosome in sperm without calcium ion carrier (A23187);Green:fluorescence distribution histogram of acrosome in sperm with calcium ion carrier (A23187).

2.4 精液冷凍后精子線粒體微觀結(jié)構(gòu)觀察

空白對照組表現(xiàn)為質(zhì)膜腫脹，頂體膜溶解破損，不完整(見圖5A)；此外，精子細(xì)胞核受損，空泡增多(見圖5-a2)。EPS組精子頭部結(jié)構(gòu)變化：透射電鏡下可見精子質(zhì)膜水腫，精子頂體膜保存完整，且精子頂體結(jié)構(gòu)異常數(shù)量明顯減少，精子細(xì)胞核結(jié)構(gòu)異常數(shù)量減少(見圖5B)。

圖5 精子頭部顯微結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Detection of microstructure of sperm head注：A：冷凍對照組；B：EPS組(比例尺：2 000 nm)。Note:A:The frozen control group;B:the EPS group(Scale bar:2 000 nm).

3 討論

隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究表明，過量的氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)精子功能損傷，引起男性不育[10]。精液冷凍作為一種生育力保存的有效手段，在其凍融過程中，產(chǎn)生大量的活性氧，對精子的活力和功能產(chǎn)生不良影響[11-13]，進(jìn)而影響輔助生殖技術(shù)的妊娠率。精子質(zhì)膜因為富含多聚不飽和脂肪酸，易受氧化應(yīng)激損傷。而且，氧化損傷能夠?qū)е戮淤|(zhì)膜損傷、呼吸抑制、細(xì)胞內(nèi)酶的缺失、軸絲蛋白損傷和線粒體膜損傷等[14]。凍融復(fù)蘇后的精子結(jié)構(gòu)明顯受損，精子質(zhì)膜完整性被破壞，核DNA受損，精子運動參數(shù)明顯下降，精子功能受損，從而引起復(fù)蘇后精子生育能力下降[15]。

隨著細(xì)胞冷凍技術(shù)的發(fā)展，針對生殖細(xì)胞的冷凍保護(hù)劑也在在不斷優(yōu)化中。研究人員通過添加抗氧化劑，來降低凍融產(chǎn)生的過量活性氧對精子的損害，取得了較為滿意的效果[4-6,16,17]。一些來源于植物的天然抗氧化劑以其來源廣泛、高效、低毒等特性受到研究者的重視。淫羊藿多糖，提煉自中國古老藥材淫羊藿，研究人員在山羊精液冷凍保護(hù)劑中加入3 mg/mL的淫羊藿多糖時，可有效降低凍融過程中活性氧的水平，提高凍融后的精子質(zhì)量[18]，本課題研究也發(fā)現(xiàn)，3 mg/mL的EPS在人弱精精子凍融過程中，抗氧化性最佳，可有效降低活性氧的水平。但是隨著EPS濃度超過3 mg/mL后，隨著濃度的增高，其抗氧化性減弱。其原因可能是淫羊藿多糖的抗氧化能力并不是劑量越大越好，第一可能是當(dāng)抗氧化劑清除或抑制自由基時，轉(zhuǎn)換成為另一種自由基，破壞了精液中ROS和防御體系的平衡，并打破了整個體系的抗氧化能力；第二可能是高濃度的抗氧化劑起到促氧化的作用，但目前其確切機制還尚不清楚，其機理有待于進(jìn)一步深入研究[19]。在各組精子各項參數(shù)檢測中，EPS組的精子PR值較空白對照組無明顯差異，但是EPS組的精子活動參數(shù)(VCL、VAP)以及精子存活率較空白對照組升高顯著。1 000倍光鏡下，檢查精子的正常形態(tài)，EPS組的正常形態(tài)較空白對照組明顯好轉(zhuǎn)，尤其是精子頭部頂體區(qū)的畸形率明顯減少。在透射電鏡下，發(fā)現(xiàn)冷凍可導(dǎo)致精子頭部質(zhì)膜明顯腫脹，頂體膜溶解破損，正常膜結(jié)構(gòu)消失，精子核區(qū)遭受損失，且空泡增多，這與LI研究結(jié)果相一致[18]。EPS組精子頭部質(zhì)膜超微結(jié)構(gòu)明顯改善，精子核區(qū)保存完整。我們通過檢測精子DFI以及AR反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)EPS組的DFI較未添加EPS的空白對照組明顯降低，AR值顯著升高。通過上述研究，我們推測在精子凍融過程中加入EPS，減少了凍融過程中活性氧的產(chǎn)生，降低了其對精子質(zhì)膜的影響，從而保證了精子質(zhì)膜的完整，同時對精子頭部頂體區(qū)和核DNA區(qū)起到了保護(hù)作用。

在本研究的精子處理過程中，精液液化后通過離心將精子從精液中分離出來，避免精液中非精子成分對精子結(jié)構(gòu)和功能的負(fù)面影響。在冷凍前，用含LBP的BWW培養(yǎng)基中培養(yǎng)精子20 min，使LBP能夠更好地與精子相互作用，以期獲得更好的凍融效果。

淫羊藿是我國傳統(tǒng)的藥用植物，對于其活性提取物的研究也在不斷進(jìn)行中，研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿黃酮體外具有良好的抗氧化效果[20]。本項研究致力于研究淫羊藿活性提取物的另外一種-淫羊藿多糖，發(fā)現(xiàn)在精子冷凍保護(hù)液中添加EPS可以降低精子冷凍損傷，改善冷凍后精子質(zhì)量和功能，其作用可能與其降低精子內(nèi)ROS水平從而減弱了其對精子膜結(jié)構(gòu)的損害有關(guān)。