馬柯欣，徐靖斌，任 飛，許 新，劉超生，李發(fā)勝*

1大連醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，大連 116044；2沈陽(yáng)市第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，沈陽(yáng) 110031

PM2.5(空氣動(dòng)力學(xué)直徑≤2.5 μm的細(xì)微顆粒物)是造成空氣污染的主要污染物之一。PM2.5比表面積大，因而很容易附帶有毒有害物質(zhì)，通過呼吸系統(tǒng)進(jìn)入到肺泡深部，引發(fā)肺部炎癥和損傷并很可能進(jìn)展為肺纖維化。成纖維細(xì)胞的大量增多是肺纖維化的主要表征，膠原蛋白在肺血管外周和肺泡間隔中大量累積，纖維結(jié)締組織也隨之增加，最終導(dǎo)致基質(zhì)硬度增加，氣體交換難度加大。內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-mesenchymal transition，EndMT)是成纖維細(xì)胞的來源之一，其特征是內(nèi)皮細(xì)胞逐漸失去表型標(biāo)志物如血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘連蛋白(vascular endothelial cell cadherin，VE-cadherin/CDH5)和血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31/PECAM-1)，間充質(zhì)細(xì)胞表型標(biāo)志物表達(dá)增強(qiáng)如Ⅰ型膠原蛋白(typeⅠcollagen，Col1)、波形蛋白(vimentin)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle action，Acta2/α-SMA)和成纖維細(xì)胞特異性蛋白1(fibroblast-specific protein 1，F(xiàn)sp1/S100A4)等。在這個(gè)過程中，細(xì)胞的增殖能力和遷移能力逐漸增強(qiáng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變[1,2]。近年來，炎癥誘導(dǎo)EndMT的分子機(jī)制已被了解[3]。TGF-β途徑是炎癥誘導(dǎo)EndMT的經(jīng)典途徑[4]，TGF-β三種異構(gòu)體均可在多種細(xì)胞系中介導(dǎo)EndMT的發(fā)生[5]，其中TGF-β1的作用最為明顯。已有研究表明，PM2.5可通過激活TGF-β信號(hào)途徑增強(qiáng)肺部炎癥[6]，但其中的具體作用機(jī)制以及對(duì)肺纖維化的影響尚不清楚。

精油(essential oils，EOs)可通過蒸餾、擠壓或溶劑萃取等方式從芳香植物的花、果實(shí)、種子、葉、莖或根中提取，具有抗菌、消炎、抗氧化、抗衰老等多種活性，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床、藥妝、保健養(yǎng)生等領(lǐng)域[7]。把從芳香植物中提取的精油用作治療醫(yī)療目的的“自然療法”稱之為芳香療法，可通過香薰、吸入、外涂或水療等外用藥法給藥。尤加利、薄荷、乳香和云杉精油是治療呼吸系統(tǒng)疾病的常見精油，可以起到溶解黏液、祛痰、殺菌、止咳和鎮(zhèn)痙等作用，進(jìn)而保護(hù)肺部免受炎癥侵害并緩解肺部炎癥[8-10]。我們根據(jù)芳香療法將上述四種單方精油復(fù)配成復(fù)方精油用于本實(shí)驗(yàn)中，探討了復(fù)方精油通過TGF-β1/SMAD3/p-SMAD3信號(hào)通路對(duì)PM2.5誘導(dǎo)的EndMT的干預(yù)作用。

1 材料及方法

1.1 復(fù)方精油

復(fù)方精油由大連醫(yī)美芳香療法工作室提供，批號(hào)：20170325，由尤加利、云杉、薄荷和乳香單方精油(英國(guó)Absolute Aromas公司惠贈(zèng)、純度近100%)復(fù)配而成。復(fù)方精油的化學(xué)成分分析主要有25種成分，其中桉葉素(16.7%)、α-蒎烯(16.54%)、薄荷醇(12.86%)等[11]。

1.2 試劑

小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基和M199培養(yǎng)基(中國(guó)普諾賽生命科技有限公司，批號(hào)分別為CM-M001、PM150610)；MTT試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL檢測(cè)試劑盒(中國(guó)凱基生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為KGA312、KGP903、KGP1123)；CDH5、TGF-βR1、p-SMAD2和p-SMAD3抗體(中國(guó)博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為bs-0878R、bs-0638R、bs-3419R、bs-5616R)；CD31、Col1、Acta2、SMAD2、SMAD3、TGF-β1和S100A4抗體(美國(guó)Proteintech公司，批號(hào)分別為11265-1-AP、14695-1-AP、14395-1-AP、12570-1-AP、25494-1-AP、21898-1-AP、66489-1-Ig)；PVDF膜(美國(guó)Millipore公司，批號(hào)為FFP39)；SB431542(美國(guó)APExBIO公司，批號(hào)為A8249)；RIPA裂解液(中國(guó)碧云天公司，批號(hào)為P0013B)。

1.3 儀器

酶標(biāo)儀和PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；一體化成像儀ImageQuant LAS 500(美國(guó)GE醫(yī)療公司)；超微量紫外可見分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司，型號(hào)為SMA4000)；垂直電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀(北京六一生物科技有限公司，型號(hào)分別為DYCZ-24DN、DYCZ-40D)。

1.4 PM2.5的提取和懸液制備

1.5 細(xì)胞分離培養(yǎng)和分組

小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(mouse pulmonary vascular endothelial cells,MHC)購(gòu)自中國(guó)普諾賽生命科技有限公司，批號(hào)分別為CP-M001，屬于原代細(xì)胞。

分離步驟：小鼠經(jīng)斷頸處死后，75%酒精浸泡5 min，移至超凈工作臺(tái)內(nèi)，仰臥固定小鼠；沿胸部正中線剪開皮膚，打開胸腔，取出肺組織，分離肺葉，放入含雙抗的PBS中；剪下肺葉邊緣1～2 mm處組織，將邊緣組織剪成1 mm3碎塊；PBS清洗組織碎塊1次，用血清潤(rùn)洗組織碎塊1次，用顯微鑷將組織塊種植于6 cm培養(yǎng)皿中，于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中干貼1 h。

培養(yǎng)步驟：向培養(yǎng)皿中加入2 mL小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，60 h后挑出培養(yǎng)皿內(nèi)組織塊丟棄，培養(yǎng)皿內(nèi)更換新鮮培養(yǎng)基，每3天換液1次，細(xì)胞長(zhǎng)滿后待用。采用小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，使用第五代到第七代的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

分組情況：PM2.5組(500 μg/mL)，復(fù)方精油組(PM2.5500 μg/mL + CEOs 10-5%)，TGF-β通路抑制劑SB431542組(10 μmol/L)和PM2.5+SB431542組(500 μg/mL + 10 μmol/L)。

1.6 MTT法

采用MTT法測(cè)定藥物濃度和細(xì)胞活力，酶標(biāo)儀上檢測(cè)各組550 nm的吸光度值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

將1×105個(gè)MHC細(xì)胞加入6孔組織培養(yǎng)板中；待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，使用無菌的200 μL槍頭尖端在每孔中形成細(xì)胞間隙，并用無菌PBS沖洗掉細(xì)胞碎片；每孔中按照分組需要加入含不同的受試藥物的新鮮無血清培養(yǎng)基，在規(guī)定時(shí)間拍照記錄；Image J軟件分析間隙寬度，每組重復(fù)3次。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)

利用Trizol法提取核酸，按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA eraser操作說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；按照SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)的要求在冰水浴的條件下進(jìn)行加樣，離心；使用TP800 PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增。采用RT-qPCR方法檢測(cè)CDH5、CD31、COL1α1和Acta2的mRNA水平變化(見表1)。

表1 引物序列

1.9 蛋白免疫印跡(Western blot)

各組細(xì)胞加入含有PMSF的裂解緩沖液，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度；蛋白質(zhì)40 μg轉(zhuǎn)移到0.45 μm的PVDF膜上；5%脫脂牛奶封閉2 h；分別加入CDH5(1∶500)、CD31(1∶1 000)、Col1(1∶2 000)、Acta2(1∶2 000)、S100A4(1∶500)、TGF-β1(1∶1 000)、TGF-βR1(1∶1 000)、SMAD2(1∶1 000)、SMAD3(1∶1 000)、p-SMAD2(1∶1 000)和p-SMAD3(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h；ECL超敏發(fā)光液發(fā)光；Image J軟件分析條帶的灰度值。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方精油可干預(yù)PM2.5對(duì)MHC細(xì)胞相關(guān)功能的改變

本實(shí)驗(yàn)室前期研究證明濃度為500 μg/mL的PM2.5可誘導(dǎo)MHC細(xì)胞發(fā)生EndMT[13]。通過MTT法檢測(cè)10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7[(V1/V)%]復(fù)方精油單獨(dú)作用MHC細(xì)胞48 h后細(xì)胞活性的改變，選擇10-5[(V1/V)%]作為復(fù)方精油干預(yù)細(xì)胞時(shí)的藥物濃度(P<0.01，圖1)。

圖1 藥物濃度實(shí)驗(yàn)Fig.1 The experiments of drug concentration注：與CEOs單獨(dú)作用MHC細(xì)胞0 h后細(xì)胞活性的改變，*P<0.05，**P<0.01。Note:*P<0.05,**P<0.01 vs the 0 h group.

PM2.5作用細(xì)胞24 h后明顯提高了MHC細(xì)胞的活性(P<0.01)；在36 h和48 h時(shí)MHC細(xì)胞的活性最高(P<0.000 1)，但復(fù)方精油組的細(xì)胞活性并沒有顯著改變(見圖2C)。遷移實(shí)驗(yàn)中，PM2.5組和復(fù)方精油組分別作用細(xì)胞36 h后，兩組細(xì)胞遷移能力差異明顯(P<0.05，圖2A和2B)，復(fù)方精油可減弱PM2.5對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。

圖2 細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The result of cell function experiments注：B.PM2.5組與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01，復(fù)方精油組與PM2.5組相比，#P<0.05；C.PM2.5組和復(fù)方精油組MHC細(xì)胞不同時(shí)間下的細(xì)胞活性變化，與0 h相比，*P<0.05，**P<0.01，****P<0.000 1。Note:B.The control group vs the PM2.5 group,*P<0.05,**P<0.01;The PM2.5 group vs the PM2.5+CEOs group,#P<0.05.C. *P<0.05,**P<0.01,****P<0.000 1 vs the 0 h group.

2.2 復(fù)方精油可緩解PM2.5誘導(dǎo)MHC細(xì)胞EndMT的進(jìn)程

PM2.5分別作用MHC細(xì)胞0、6、12、24、36、48 h。結(jié)果表明，S100A4、Col1和Acta2的表達(dá)量明顯提升,CDH5和CD31的表達(dá)量明顯下降，提示PM2.5誘導(dǎo)MHC細(xì)胞發(fā)生EndMT[13]。復(fù)方精油分別干預(yù)MHC細(xì)胞6、12、24、36、48 h，其對(duì)PM2.5誘導(dǎo)產(chǎn)生的EndMT有良好的緩解作用，尤其是在蛋白表達(dá)水平上。復(fù)方精油干預(yù)24 h后，Acta2和S100A4的蛋白表達(dá)量下降趨勢(shì)尤為明顯(P<0.001，P<0.01)，而復(fù)方精油對(duì)Col1的緩解作用主要體現(xiàn)在復(fù)方精油干預(yù)36 h后(36 h，P<0.05；48 h，P<0.05，見圖3)。

表2 復(fù)方精油組中MHC細(xì)胞的COL1α1、CD31、CDH5和Acta2 mRNA變化情況

圖3 復(fù)方精油可緩解PM2.5誘導(dǎo)MHC細(xì)胞EndMT的進(jìn)程Fig.3 CEOs can alleviate EndMT in MHC cells exposed to PM2.5注：與6 h組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Note:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 vs the PM2.5 + CEOs group at the 6 h point.

2.3 復(fù)方精油通過調(diào)節(jié)TGF-β1/SMAD3/p-SMAD3通路抑制PM2.5誘導(dǎo)的EndMT

本實(shí)驗(yàn)室前期研究證明PM2.5通過激活TGF-β1/SMAD3/p-SMAD3通路誘導(dǎo)MHC細(xì)胞發(fā)生EndMT[13]。Western blot結(jié)果顯示，與PM2.5組相比，在復(fù)方精油組中，TGF-βR1和p-SMAD2/3均有下降趨勢(shì)，其中TGF-βR1(P<0.05)和p-SMAD3(P<0.01)下降顯著(見圖4)。

圖4 復(fù)方精油可降低PM2.5誘導(dǎo)下TGF-β1/SMAD3/p-SMAD3信號(hào)通路的表達(dá)Fig.4 CEOs can reduce the expression of TGF-β1/SMAD3/p-SMAD3 pathway induced by PM2.5注：復(fù)方精油組與PM2.5組比較，*P<0.05，**P<0.01；PM2.5+SB431542組與PM2.5組比較，##P<0.01。Note:The PM2.5 group vs the PM2.5+CEOs group,*P<0.05 and **P<0.01;The PM2.5 group vs the PM2.5+SB431542 group,##P<0.01.

與此同時(shí)，在復(fù)方精油組中，CD31的蛋白表達(dá)量增加明顯(P<0.05)，Col1、Acta2和S100A4的表達(dá)均具有下降趨勢(shì)(見圖5)。綜上所述，復(fù)方精油可通過下調(diào)TGF-βR1的表達(dá)，降低下游靶分子p-SMAD3的表達(dá)從而抑制EndMT的發(fā)生。

3 討論

PM2.5是最受關(guān)注的空氣污染物之一。因其顆粒小，較易到達(dá)人體的肺泡和血液中，從而加快已患肺部疾病人群的疾病進(jìn)程。血管內(nèi)壁的內(nèi)皮細(xì)胞與血液直接接觸，對(duì)血液中的異物刺激具有明顯的異質(zhì)性。處于EndMT進(jìn)程的內(nèi)皮細(xì)胞是成纖維細(xì)胞的來源之一，不僅導(dǎo)致成纖維細(xì)胞大量增加，同時(shí)會(huì)使毛細(xì)血管床密度減少，加重組織缺氧、缺血，從而加速肺纖維化進(jìn)程。實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)已證明PM2.5可誘導(dǎo)MHC細(xì)胞發(fā)生EndMT，Acta2、Col1和S100A4的蛋白表達(dá)量上升，CD31和CDH5的表達(dá)下降，說明PM2.5可使小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EndMT，S100A4的蛋白表達(dá)量的增加也證實(shí)了EndMT在肺纖維化中具有重要的作用[13]。

本實(shí)驗(yàn)采用的復(fù)方精油主要成分為α-蒎烯(16.54%)、桉葉素(16.7%)和薄荷醇(12.86%)等[12]。桉葉素是腫瘤壞死因子-α的阻遏劑，可有效抑制哮喘和慢性肺阻塞疾病的惡化過程，具有潛在的類固醇抗炎藥物的作用[14]。α-蒎烯具有抗氧化和抗菌作用，對(duì)腫瘤細(xì)胞A549顯示一定的抑制活性[15]。薄荷醇能夠阻斷血管平滑肌的L型鈣通道，對(duì)心血管疾病起到一定的治療作用[16]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PM2.5可誘導(dǎo)處理MHC細(xì)胞48 h時(shí)，MHC細(xì)胞的增殖能力和遷移能力達(dá)到頂峰，但在復(fù)方精油組中，MHC細(xì)胞的整體功能并沒有因PM2.5的誘導(dǎo)而發(fā)生顯著變化。復(fù)方精油干預(yù)36 h后，Acta2和Col1的蛋白表達(dá)量明顯減少，提示復(fù)方精油對(duì)EndMT的發(fā)生具有良好的緩解作用。

研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β在肺臟的發(fā)育、損傷和修復(fù)的過程中扮演重要的角色，其可通過激活TGF-β1受體促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成，并對(duì)肺纖維化的發(fā)病機(jī)制起到調(diào)控作用。前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，PM2.5處理MHC細(xì)胞48 h后，TGF-β1、TGF-βR1和p-SMAD3的蛋白表達(dá)量增加，但在PM2.5組中加入SB431542 48 h后，TGF-βR1和p-SMAD3的表達(dá)減少，因SMAD蛋白磷酸化是TGF-β1信號(hào)通路的典型指標(biāo)，由此可見，PM2.5可通過調(diào)節(jié)TGF-β信號(hào)通路，刺激TGF-β1轉(zhuǎn)化為活性形式去激活TGF-βR1，TGF-βR1被激活后與SMAD3結(jié)合，p-SMAD3的過度表達(dá)可促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的增加和膠原的積累[13]。而在復(fù)方精油組中，TGF-βR1和p-SMAD3的蛋白表達(dá)量明顯下降，復(fù)方精油通過抑制TGF-βR1的激活降低p-SMAD3的表達(dá)，從而抑制PM2.5誘導(dǎo)的EndMT發(fā)生。

由此推斷，復(fù)方精油可通過抑制TGF-β1/SMAD3/p-SMAD3信號(hào)通路的表達(dá)減緩PM2.5誘導(dǎo)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞EndMT的發(fā)生。這些發(fā)現(xiàn)為PM2.5暴露后肺部EndMT的損傷修復(fù)和復(fù)方精油的干預(yù)方案提供了理論基礎(chǔ)。