陳忠宜，李金玉，葛風(fēng)偉，謝爾瓦尼木·阿不都艾尼，趙晶晶，寧煥宸，趙和平，趙惠新*

1新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 干旱區(qū)植物逆境生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830054；2北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，抗性基因資源與分子發(fā)育北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100875

真菌病分為淺部真菌和深部真菌，目前深部真菌感染病例數(shù)日益增多，且90%以上臨床報道的與真菌有關(guān)的死亡病例,都與隱球菌、念珠菌和曲霉菌有關(guān)[1]，已成為影響人類生活品質(zhì)、威脅生命健康安全的重要疾病之一。白色念珠菌(Candidaalbicans)是念珠菌屬中致病力最強(qiáng)的一種革蘭氏陽性條件致病菌，常常侵犯人體皮膚、黏膜，并導(dǎo)致內(nèi)臟或全身感染[2]。造成的全球死亡率在36%至63%之間，已成為公共衛(wèi)生系統(tǒng)和醫(yī)療保健領(lǐng)域亟待解決的重要問題。

已經(jīng)廣泛報道了使用拮抗菌抑制白色念珠菌，其中芽孢桿菌占所篩選的主體，其次是真菌和放線菌[3]。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)能分泌多種抗菌代謝產(chǎn)物，并具有多功能，低毒性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥，農(nóng)業(yè)，科研等研究領(lǐng)域[4]。目前研究多為環(huán)脂肽類的抗菌物質(zhì)，如表面活性素(surfactin)、伊枯草素(iturin)、芬枯草素(fengycin)，及鏈肽類抗菌物質(zhì)[5]，對這些抗菌物質(zhì)只在體外的抗真菌研究較多，體內(nèi)效果研究較少，目前只發(fā)現(xiàn)伊枯草素在感染白色念珠菌的小鼠中有一定的治療效果[6]，且對枯草芽孢桿菌代謝物中的其他抗菌物質(zhì)研究較少。

前期從新疆和碩地區(qū)土壤中篩選獲得了枯草芽孢桿菌BS-Z15，其發(fā)酵液中粗提的代謝產(chǎn)物(metabolites extracted from fermentation broth，MEs)拮抗真菌能力強(qiáng)，且拮抗穩(wěn)定性好[7]，在對MEs抗真菌活性及對小鼠給藥的安全性評價發(fā)現(xiàn)，該菌株能有效抑制多種真菌如大麗輪枝菌、黃曲霉，且對小鼠無毒害作用[8]。本文對枯草芽孢桿菌BS-Z15發(fā)酵液中粗提的MEs在體外對白色念珠菌的最低抑菌劑量值測定(MIC)，研究對酵母態(tài)白色念珠菌的殺滅作用，在通過建立白色念珠菌感染小鼠體內(nèi)模型，探討MEs對其治療作用。通過研究枯草芽孢桿菌BS-Z15發(fā)酵液中粗提的MEs在體外和體內(nèi)對白色念珠菌的抑制作用，為開發(fā)出具有抗真菌作用強(qiáng)、副作用低的抗真菌藥物打下堅實(shí)的研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥品與試劑

二甲基亞砜、氫氧化鈉(分析純)；0.9%氯化鈉注射液、氟康唑氯化鈉注射液、環(huán)磷酰胺、三氮嗎啡琳丙磺酸、RPMI1640培養(yǎng)基(含L谷氨酰胺,不含碳酸氫鈉)、馬鈴薯培養(yǎng)基(上海研拓生物科技有限公司)；總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒、總超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒(上海信帆生物科技有限公司)。

1.2 菌種

枯草芽孢桿菌BS-Z15由本實(shí)驗(yàn)室自主分離純化,白色念珠菌由北京師范大學(xué)提供。

1.3 動物

雄性昆明種小鼠(KM小鼠)60只,6周齡,體重在25±2 g左右,由新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,動物生產(chǎn)許可證號:SCKK(新)20180003。

2 方法

2.1 體外抗真菌試驗(yàn)

2.1.1 枯草芽孢桿菌BS-Z15發(fā)酵液中的MEs的提取

參照Zhao等[9]對活性物質(zhì)的提取方法，對該菌分泌的胞外抗菌物質(zhì)進(jìn)行提取。BS-Z15菌液12 000 rpm離心過濾獲得無菌體發(fā)酵液，酸沉淀過夜后12 000 rpm離心，無菌水溶解獲得的沉淀，有機(jī)溶劑萃取獲得MEs，最后用正丁醇萃取風(fēng)干。

2.1.2 MEs對白色念珠菌抑菌圈及最低抑菌濃度的測定

采用平板對峙法，制備雙層培養(yǎng)基平板，底層為瓊脂凝膠，上層為加有白色念珠菌孢子懸液的馬鈴薯固體培養(yǎng)基，后用1 mL槍頭在上層平板上打孔，并向孔內(nèi)加入100 μL按照“2.1.1”方法提取的MEs。將平板置于28 ℃的黑暗培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3天，然后取出，觀察并測量抑菌圈大小。

采用微量肉湯稀釋法[10]，參考美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NCCLS)推薦的《產(chǎn)孢絲狀真菌液基稀釋法抗真菌藥物敏感性試驗(yàn)方案》(M38-A)[11]。測定最終濃度為1.32、0.66、0.33、0.165、0.082 5、0.041 2、0.020 6 mg/mL的MEs抑菌能力，并設(shè)真菌生長對照孔、空白對照孔和氟康唑?qū)φ湛?0.02 mg/mL)于36 ℃孵育48 h在530 nm處讀結(jié)果。并通過目視觀察分級(4：生長濁度不減低；3：生長濁度輕度減低或約75%受試菌生長；2：生長濁度顯著減低或約50%受試菌生長；1：輕度生長或約25%受試菌生長；0：肉眼觀察清晰或不生長)，以輕度生長或約抑制25%受試菌生長管為MIC判斷終點(diǎn)。所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)3組重復(fù)。

2.1.3 MEs對酵母態(tài)白色念珠菌影響的觀察

制備白色念珠菌懸浮液，使用血球計數(shù)板計數(shù)1.0×107/mL，并加入測得最低抑菌濃度的MEs，溫度為31 ℃，180 rpm，黑暗條件下振蕩培養(yǎng)至3天，每12 h取樣一次。以等體積蒸餾水為對照。制備電子掃描顯微鏡樣品，所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)3組重復(fù)。

2.2 對小鼠白色念珠菌感染模型的治療作用

2.2.1 試驗(yàn)分組

昆明種雄性小鼠60只,6周齡,體質(zhì)量25±2 g,每組10只，分籠飼養(yǎng)，將小鼠飼養(yǎng)在22±2 °C的房間內(nèi)，給予充足的飲水和食物。所有小鼠在研究開始前均喂以標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒動物飼料，并進(jìn)行1周的馴化。在研究開始之前，各組之間的體重沒有統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異(P>0.05)，按體重隨機(jī)分為6組。即空白組、模型組、陽性對照藥氟康唑組(90 mg/kg)、MEs低劑量組(30 mg/kg)、MEs中劑量組(60 mg/kg)和MEs高劑量組(90 mg/kg)。

2.2.2 動物模型的建立與給藥

空白組除正常飲水外，每日灌胃生理鹽水溶液0.02 mL/g。模型組在建立念珠菌感染小鼠模型前3天，每天腹腔注射環(huán)磷酰胺(Cyc)200 mg/kg,第4天即接種尾靜脈無菌注射2×106CFU/mL白色念珠菌菌懸液1 mL，第5天開始連續(xù)7天腹腔無菌注射0.02 mL/g生理鹽水。給藥組在前4天與模型組處理相同，第5天開始連續(xù)7天灌胃預(yù)設(shè)劑量的各組藥物[12]。

2.2.3 小鼠一般狀態(tài)及病理形態(tài)學(xué)觀察

在第五天起觀察每組小鼠的總體狀況，最后一次給藥后24 h后對所有小鼠稱重，麻醉后進(jìn)行腹部主靜脈取血。取血后立即脫頸椎處死小鼠，并快速剖腹取出肝臟、脾臟和胸腺，用生理鹽水沖洗多余組織，再用濾紙吸去生理鹽水后稱重并記錄，計算肝臟、脾臟和心臟指數(shù)。并將各組小鼠的脾臟和肝臟組織用10%的甲醛溶液固定72 h，石蠟包埋切片，用常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色后進(jìn)行鏡檢。

2.2.4 不同處理對小鼠總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的影響

腹腔主靜脈取血后，離心20 min(2500 rpm)，吸取上層血清按試劑盒操作說明測定血清中總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量。小鼠尸體全部澆乙醇火燒處理。

2.3 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 MEs對白色念珠菌最低抑菌濃度

在使用平板對峙法后，發(fā)現(xiàn)MEs對白色念珠菌有良好的抑菌能力，如圖1所示。

圖1 MEs對白色念珠菌抑菌圈Fig.1 Inhibition zone of MEs against C.albicans

隨后我們進(jìn)行了MEs對白色念珠菌最低抑菌濃度的測定，如表1所示，在48 h后，0.020 62 mg/mL孔的渾濁度與陰性對照孔相差無幾，在0.041 2 mg/mL孔生長濁度輕度減低，當(dāng)弄濃度為0.33 mg/mL時生長濁度顯著減低，只有輕度生長，且此時的OD值也是顯著降低(P<0.01)，根據(jù)絲狀真菌肉湯稀釋抗真菌敏感性試驗(yàn)參考方法中氟康唑和酮康唑等藥物以輕度生長或約抑制25%受試菌生長管為MIC判斷終點(diǎn)。所以我們以0.33 mg/mL作為最低抑菌濃度(MIC)。

表1 不同濃度MEs對白色念珠菌生長的影響

3.2 MEs對酵母態(tài)白色念珠菌孢子形態(tài)影響

將0.33 mg/mL MEs加入培養(yǎng)白色念珠菌的YPD培養(yǎng)基中，對照組為加入等量無菌水，對酵母態(tài)白色念珠菌孢子形態(tài)的影響如圖2。培養(yǎng)初期，處理組與對照組的白色念珠菌孢子體形態(tài)有些許差異，總體孢子形態(tài)呈橢球型，孢子體飽滿、表明光滑，但有少數(shù)孢子體凹陷屬于正常的死亡現(xiàn)象；處理組，即白色念珠菌在0.33 mg/mL MEs的YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)了12、24、48、72 h后孢子體隨著處理時間的延長出現(xiàn)皺縮、凹陷、光滑度明顯降低的現(xiàn)象。處理12 h后，處理組白色念珠菌孢子體開始出現(xiàn)凹陷的現(xiàn)象，對照組較為正常；在處理24 h后，白色念珠菌孢子體出現(xiàn)皺縮、干癟、凹陷等現(xiàn)象，對照組孢子依舊較為飽滿、圓潤。處理48 h后，白色念珠菌孢子體更加干癟凹陷，且出現(xiàn)菌體破裂死亡等現(xiàn)象，對照組也出現(xiàn)少許菌體皺縮凹陷等正常死亡現(xiàn)象。處理72 h后，處理組孢子死亡情況最為嚴(yán)重，幾乎無正常孢子，對照組依舊存在正常的少數(shù)孢子體凹陷的狀況。

圖2 MEs對酵母態(tài)白色念珠菌影響的電鏡照片(×2 700)Fig.2 Electron micrographs of the effects of MEs on C.albicans in yeast(×2 700)

3.3 不同處理對小鼠體征情況的影響

正常對照組小鼠實(shí)驗(yàn)過程中均較活潑，毛色光亮，飲食正常，行動自如。模型組接種白色念珠菌后第2天開始出現(xiàn)皮毛不整、無光澤，倦縮駝背，活動減少，進(jìn)食量減少，精神不振、相互撕咬，體重下降等現(xiàn)象。如表2所示，陽性藥物氟康唑組和MEs高、中劑量組小鼠生長狀況給藥后癥狀有所改善。在各組死亡率統(tǒng)計上，正常組、氟康唑組小鼠在實(shí)驗(yàn)期間無小鼠死亡現(xiàn)象，死亡率為0%，模型組在實(shí)驗(yàn)第二天就出現(xiàn)了小鼠死亡現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)期間共死亡5只小鼠，死亡率最高，為50%；MEs灌胃組，實(shí)驗(yàn)期間均有小鼠死亡現(xiàn)象，其中高劑量組與氟康唑組的死亡率相當(dāng)為10%，低劑量組與模型組的死亡率相當(dāng)為40%，可看出死亡率隨MEs劑量的升高而降低。

表2 不同處理對小鼠體征狀態(tài)及死亡率的影響

如表3所示，與正常組比較，模型組和MEs中、低劑量組的小鼠體重均有顯著性降低，與模型組比較，MEs高劑量組、氟康唑組體重具有顯著性恢復(fù)。脾臟指數(shù)中，與空白對照組相比，各組均有下降，模型組小鼠的脾臟指數(shù)具有顯著性降低；與模型組相比，氟康唑組、高劑量組小鼠具有顯著性恢復(fù)；心臟和脾臟指數(shù)均無明顯變化。

表3 不同處理對小鼠臟器指數(shù)及體重的影響

3.4 不同處理對小鼠組織病理學(xué)變化的影響

肝臟HE染色切片顯示，各組小鼠肝組織細(xì)胞核被染成藍(lán)色，肝細(xì)胞質(zhì)被染成粉紫色。模型組(B組)小鼠的肝細(xì)胞損傷病變嚴(yán)重，呈氣球樣，明顯腫脹變形，部分細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞質(zhì)區(qū)分不明顯，有炎性細(xì)胞浸潤，可見造模較成功。正常組(A組)小鼠肝臟內(nèi)部各組織排列清晰，肝細(xì)胞條索狀排列整齊疏松，未出現(xiàn)水腫，細(xì)胞間無明顯間隙，肝細(xì)胞排列緊密，中心靜脈內(nèi)皮結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞質(zhì)區(qū)分明顯，無炎性細(xì)胞浸潤。氟康唑組(C組)和高劑量組(D組)小鼠的肝臟細(xì)胞病變程度較輕，細(xì)胞形態(tài)較陰性對照組大幅度好轉(zhuǎn)，炎性細(xì)胞浸潤減少，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，雖然有輕度腫脹，但病變程度大幅度降低，細(xì)胞呈多面體單核，位于細(xì)胞中央；中劑量(E組)、低劑量(F組)小鼠肝細(xì)胞形態(tài)雖有小幅度好轉(zhuǎn)，但細(xì)胞間隙還是增大嚴(yán)重(圖3)。

圖3 小鼠肝臟切片 HE 染色后顯微照片(×400)Fig.3 Micrographs of mouse liver sections after HE staining (×400)注：A為正常組；B為感染組；C為感染后用90 mg/mL氟康唑治療組；D為感染后用90 mg/mL MEs治療組；E為感染后用60 mg/mL MEs治療組；F為感染后用30 mg/mL MEs治療組(下同)。紅箭頭標(biāo)注為中心靜脈。Note:A is the normal group;B is the infected group;C is the group treated with 90 mg/mL fluconazole after infection;D is the group treated with 90 mg/mL MEs after infection;E is the group treated with 60 mg/mL MEs after infection;and F is the group treated with 30 mg/mL MEs after infection (the same below).Red arrows are labeled as central veins.

脾臟HE染色切片顯示，正常組(A組)小鼠脾臟紅髓、白髓和邊緣區(qū)細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞形態(tài)的一致性，沒有出現(xiàn)細(xì)胞損傷的現(xiàn)象；模型組(B組)小鼠脾臟細(xì)胞白髓和紅髓之間界限不清晰，淋巴細(xì)胞排列疏松，細(xì)胞間隙明顯變大，紅髓區(qū)充血出血。氟康唑組(C組)和高劑量組(D組)小鼠，脾臟細(xì)胞的形態(tài)得到了明顯的改善，淋巴細(xì)胞間隙明顯減小，脾臟結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)正常，C組形態(tài)稍好于D組。中劑量(E組)、低劑量(F組)小鼠肝細(xì)胞較B組，形態(tài)雖有小幅度好轉(zhuǎn)，但病變依然明顯，細(xì)胞間隙明顯，紅髓充血出血明顯，E組形態(tài)明顯好于F組(見圖4)。

圖4 小鼠脾臟切片 HE 染色后顯微照片(×400)Fig.4 Micrographs of mouse spleen sections after HE staining (×400)注：紅箭頭標(biāo)注為紅髓；黃箭頭標(biāo)注為白髓。Note:Red arrows are labeled as red marrow;Yellow arrows are labeled as white marrow.

3.5 不同治療處理對小鼠總抗氧化(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量的影響

分析顯示，模型組中的總抗氧化能力和SOD活性較正常組顯著降低(P<0.05)，而MDA含量顯著升高。與模型組比較，氟康唑組和高劑量組的總抗氧化能力和SOD活性顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低。在中、低劑量組中各氧化指標(biāo)比模型組都有好轉(zhuǎn)但均無顯著性。

表4 不同處理對小鼠T-AOC、SOD、 MDA活性的影響

4 討論

隨著目前抗生素的濫用，病原真菌對現(xiàn)有藥物的耐藥性越來越嚴(yán)重，使真菌感染容易發(fā)生，難以控制且存在一定的副作用。如兩性霉素B有嚴(yán)重的腎毒性，氮唑類藥物存在嚴(yán)重的腎毒性與肝毒性[13]。因此,新型高效低毒抗真菌藥物的研發(fā)受到越來越多的關(guān)注。

在體外試驗(yàn)中，當(dāng)使用濃度為0.33 mg/mL MEs時，可以使酵母態(tài)白色念珠菌體皺縮凹陷，破裂致死，在體內(nèi)模型中，由于當(dāng)白色念珠菌感染后，小鼠機(jī)體遭受有害刺激，會引發(fā)機(jī)體內(nèi)部免疫系統(tǒng)的反應(yīng)，釋放大量免疫炎癥因子從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[14]。脾和肝分別是小鼠機(jī)體內(nèi)行使免疫及解毒的重要器官，在肝臟HE染色切片和脾臟HE染色切片觀察中發(fā)現(xiàn)模型組中小鼠的肝、脾內(nèi)細(xì)胞明顯腫脹變形，部分細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞質(zhì)區(qū)分不明顯，有大量炎性細(xì)胞浸潤，有明顯的組織損傷。在MEs灌胃組中這些損傷程度明顯改善，其中炎癥細(xì)胞減少顯著，且與MEs的劑量成正相關(guān)。說明MEs可以減輕臟器中的炎癥，從而恢復(fù)組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

同時，在白色念珠菌感染后也會導(dǎo)致小鼠體內(nèi)抗氧化失衡從而導(dǎo)致組織損傷?？寡趸胶庖环矫姘w內(nèi)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化的程度也就是自由基產(chǎn)生的水平，另一方面包括機(jī)體通過酶促反應(yīng)和氧化反應(yīng)。MDA[15]含量常常可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，而SOD[16]活性的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力，T-AOC[17]反映機(jī)體酶促及非酶促體系總的抗氧化水平高低，與健康程度存在密切聯(lián)系。與模型組小鼠相比90 mg/kg MEs治療后可以顯著降低體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，顯著提高SOD活性從而提高了小鼠體內(nèi)的T-AOC總抗氧化能力，同時在30 mg/kg和60 mg/kg劑量組中有稍有提高。總抗氧化能力的測定中也表明通過灌胃MEs治療后，可以幫助機(jī)體恢復(fù)正常的抗氧化水平，這也可能是減輕臟器病變程度的原因之一。

目前利用拮抗菌代謝物治療白色念珠菌感染已有大量報道，抗菌肽P3[18]是牛血紅蛋白源的一種人工合成的抗菌肽，能夠?qū)е掳咨钪榫霈F(xiàn)凹陷，突出和裂紋。鹽芽孢桿菌LAY[19]發(fā)酵上清液可拮抗白色念珠菌，且進(jìn)行PCR篩查中發(fā)現(xiàn)含有可產(chǎn)聚酮類化合物的基因，聚酮類化合物具有高的生物活性。Lei[6]等通過研究枯草芽孢桿菌代謝物伊枯草素發(fā)現(xiàn)，可以通過消除腎臟和腎臟的真菌負(fù)擔(dān)，減緩小鼠體重變化去逆轉(zhuǎn)白念珠菌感染所帶來的器官結(jié)構(gòu)和功能的損害。本研究結(jié)果與這些所報道的常見抗菌肽的作用效果相似，且MEs的提取方法與脂肽類物質(zhì)提取比較相似，但在實(shí)驗(yàn)室前期對BS-Z15的全基因組測序研究中[20]發(fā)現(xiàn)，BS-Z15枯草芽孢桿菌不含主流拮抗真菌基因的完整操縱子，如表面活性素、伊枯草素、芬枯草素等，所以我們推測MEs中的抑菌活性成分可能是新的脂肽類物質(zhì)。但具體成分及活性成分在體內(nèi)是否是直接抑制白色念珠菌的生長還待通過LC-MS、MS/MS、NMR及高通測序等技術(shù)進(jìn)一步研究。綜上所訴，BS-Z15發(fā)酵液中粗提的代謝產(chǎn)物體內(nèi)外抗白色念珠菌作用明顯。本研究為從枯草芽孢桿菌的代謝物中尋找新型抗真菌先導(dǎo)化合物提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。