劉友花，李 健，王 丹，解福雙，郭志剛

浙江清華長三角研究院，嘉興 314000

玉米大斑病又稱枯葉病，分布廣泛，染病后葉枯死，導(dǎo)致減產(chǎn)，是目前玉米生產(chǎn)中經(jīng)常遇到的主要葉斑病害之一，給中國玉米種植業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失[1]。目前主要用來防治該病的農(nóng)藥常為化學(xué)農(nóng)藥，而化學(xué)農(nóng)藥一方面會使菌株產(chǎn)生多種防御機(jī)制，產(chǎn)生新的耐藥株，另一方面影響食品安全，危害人類健康，因此研發(fā)高效、低毒、無殘留的生物農(nóng)藥勢在必行[2-4]。博落回屬(Macleaya)植物隸屬罌粟科，是生于海拔150～830 m的丘陵或低山林、灌叢或草叢間的多年生草本植物，全株含有乳黃色毒醬汁，來源豐富，分布廣泛，民間常用作殺蛆。中國植物志記載了博落回(M.cordata)和小果博落回(M.microcarpa)兩種，有清熱解毒，殺蟲止癢的作用[5-7]。目前，關(guān)于博落回的研究主要集中在國內(nèi)，且主要集中在博落回粗提取物或者主要成分的殺蟲活性方面的研究[8-10]，鮮有對博落回中單體化合物抑制玉米大斑病的活性探討。本文將報道這些生物堿類成分的提取分離方法、結(jié)構(gòu)鑒定以及體外抗玉米大斑病的活性研究。

1 材料與方法

1.1 材料

博落回粗粉于2017年8月1日購置長沙上禾生物有限公司，由郭志剛教授鑒定，標(biāo)本存放于浙江清華長三角研究院1801標(biāo)本柜。

1.2 儀器和試劑

柱色譜正相硅膠(200～300目)為青島海洋化工廠生產(chǎn)。

分析制備用HPLC儀器為LC-20A型液相色譜儀(日本島津公司)；MPLC采用Dr Flash-S分離純化系統(tǒng)(蘇州匯通有限公司的)，色譜柱為ODS(C18，MB 100 40～75 μm，F(xiàn)uji，日本)；ESI-MS 采用Agilent 1200-1600 MS,以甲醇為溶劑，直接進(jìn)樣測定；1H和13C NMR譜采用Bruker核磁共振儀，以TMS為內(nèi)標(biāo)。

1.3 實驗方法

1.3.1 提取和分離

博落回莖粗粉20 kg，用75%乙醇回流提取2次，每次2 h，料液比為1∶20，得到乙醇提取液經(jīng)過減壓濃縮后依次用石油醚和乙酸乙酯萃取3～4次，經(jīng)HPLC檢測石油醚部位提取物和乙酸乙酯部位提取物成分類似，故合并，共得到140 g，記為M。

將M組分經(jīng)正相硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯[100∶0→0∶100(V/V，下同)]逐步增加梯度洗脫，每收集2 L為一餾分，經(jīng)TLC檢查合并，得到組分M1～M8，經(jīng)過活性跟蹤的方法確定了M1、M4、M5以及M6共4個組分具有抗玉米大斑病的活性。

M1(13 g)采用1.5倍200～300目的硅膠拌樣，18倍硅膠填充正相硅膠柱，石油醚/乙酸乙酯(93∶7)等梯度洗脫，每份收集50 mL，收集各流份后經(jīng)過TLC板檢查合并，得到M1-1～M1-7共7個組份，將這7個組分進(jìn)行抗玉米大斑病活性檢測，得到M1-2具有微弱活性，然后將M1-2重結(jié)晶得到化合物7(15 mg)。

M4(31 g)經(jīng)過MPLC分離，甲醇-水(40∶70→100∶0)梯度洗脫，流速8 mL/min，每份收集200 mL，收集各流份后經(jīng)過TLC板檢查合并，得到M4-1～ M4-10共10個組份，將這10個組分進(jìn)行抗玉米大斑病活性篩選，得到M4-4和M4-6共2個組分具有活性。其中M4-4經(jīng)過HPLC 76%(流速為 6 mL/min)的甲醇-水得到組分M4-4-1～M4-4-8共8個組分，將這些組分采用TLC板以及HPLC分析驗純以及活性追蹤，得到化合物1(25 mg，tR=41 min)和2(35 mg，tR=62 min)，另外將M4-4-1進(jìn)一步用70%(流速為 5 mL/min)的甲醇-水純化得到化合物8(20 mg，tR=21 min)，經(jīng)過活性追蹤得到化合物8具有顯著的抗玉米大斑病的活性。M4-6經(jīng)過HPLC 71%(流速為 5 mL/min)的甲醇-水得到組分M4-6-1～ M4-6-8共8個組分，將這些組分采用TLC板以及HPLC分析驗純和活性追蹤得到化合物3(15 mg，tR=64 min)和4(20 mg，tR=73 min)。

M5(28 g)經(jīng)過MPLC分離，甲醇-水(40∶70→100∶0)梯度洗脫，流速8 mL/min，每份收集250 mL，收集各流份后經(jīng)過TLC板檢查合并，得到M5-1～ M5-9共9個組份，將這9個組分進(jìn)行活性追蹤篩選，得到M5-5組分具有抗玉米大斑病活性，然后M5-5經(jīng)過HPLC 71%(流速為5 mL/min)的甲醇-水得到化合物5(10 mg，tR=54 min)和6(8 mg，tR=72 min)。

1.3.2 抗玉米大斑病活性測試

按照Xu等[11]的濾紙片瓊脂糖擴(kuò)散法測定化合物1～8。在含有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中接種10 μL玉米大斑病的分子孢子，涂布均勻，然后在同一培養(yǎng)皿上將滅菌紙盤(直徑6 mm)置于真菌接種劑周圍，每個紙盤含有31.25 μg的測試樣品、陽性對照(吡唑醚菌酯)以及相當(dāng)體積的丙酮，每個藥量重復(fù)3次，在30 ℃黑暗條件下生長3天后，觀察抑菌圈的大小。然后將具有明顯抑菌圈的化合物用48孔培養(yǎng)板進(jìn)行玉米大斑病孢子萌發(fā)研究，用于這些實驗的分生孢子是從生長在PDA上的3天齡真菌培養(yǎng)基中收集的。收集分生孢子用1/2馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB∶水=1∶1)稀釋懸浮液計數(shù)并立即用于生物測定。將供試樣品溶解并用丙酮∶水=1∶1稀釋得到兩倍的梯度濃度，并將5 μL樣品添加到含有95 μL孢子懸浮液中。從而獲得9.76到312.50 μg/mL的最終濃度，在旋轉(zhuǎn)搖床上以150 rpm，30 ℃下培養(yǎng)48 h后使用光學(xué)顯微鏡對萌發(fā)和未萌發(fā)的分生孢子進(jìn)行計數(shù)，并計算孢子發(fā)芽率。當(dāng)芽管長度為孢子直徑的1.5倍時認(rèn)為孢子萌發(fā)。對每種濃度進(jìn)行三個重復(fù)并在每個重復(fù)中計數(shù)200多個分生孢子。以吡唑醚菌酯為陽性對照，丙酮∶水=1∶1為陰性對照。用logistic劑量-反應(yīng)曲線(GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件)進(jìn)行非線性回歸分析得到IC50值。

2 實驗結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1黃色粉末;分子式C22H19NO5；ESI-MS：m/z378 [M+H]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.54(1H，s，H-1)，7.11(1H，s，H-4)，6.86(1H，d，J=8.2 Hz，H-9)，7.33(1H，d，J=8.2 Hz，H-10)，7.49(1H，d，J=8.6 Hz，H-11)，7.68(1H，d，J=8.6 Hz，H-12)，6.06(2H，s，H-13)，6.03(2H，s，H-14)，4.47(1H，dd，J=10.0，4.9 Hz，H-6)，1.80(1H，m，H-1′a)，1.57(1H，dt，J=14.4，4.8 Hz，H-1′b)，3.80(2H，m，H-2′)，2.69(3H，s，N-CH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：99.9(C-1)，147.1(C-2)，148.5(C-3)，104.6(C-4)，127.1(C-4a)，139.0(C-4b)，56.8(C-6)，125.6(C-6a)，144.3(C-7)，147.6(C-8)，107.5(C-9)，116.7(C-10)，116.9(C-10a)，123.9(C-10b)，124.3(C-11)，120.1(C-12)，131.1(C-12a)，101.4(C-13)，101.1(C-14)，43.0(N-CH3)，35.2(C-1′)，61.6(C-2′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]基本一致，故確定化合物1為6-(2-羥基乙基)-5，6-二氫血根堿(結(jié)構(gòu)見圖1)。

圖1 化合物1～8的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds 1-8

化合物2黃色粉末;分子式C23H19NO6；ESI-MS：m/z406 [M+H]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.54(1H，s，H-1)，7.09(1H，s，H-4)，4.82(1H，dd，J=8.7，6.7 Hz，H-6)，6.86(1H，d，J=8.2 Hz，H-9)，7.34(1H，d，J=8.2 Hz，H-10)，7.47(1H，d，J=8.6 Hz，H-11)，7.69(1H，d，J=8.6 Hz，H-12)，6.05(2H，s，H-13)，6.04(2H，s，H-14)，2.41(2H，m，H-1′)，1.57(1H，dt，J=14.4，4.8 Hz，H-1′b)，3.80(2H，m，H-2′)，2.65(3H，s，N-CH3)，3.67(3H，s，2′-OCH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：101.6(C-1)，147.6(C-2)，147.1(C-3)，104.3(C-4)，127.6(C-4a)，139.2(C-4b)，54.7(C-6)，125.8(C-6a)，147.6(C-7)，144.5(C-8)，107.7(C-9)，116.5(C-10)，115.6(C-10a)，124.0(C-10b)，123.2(C-11)，120.0(C-12)，131.0(C-12a)，100.8(C-13)，101.0(C-14)，43.1(N-CH3)，38.8(C-1′)，171.8(C-2′)，51.5(2′-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]基本一致，故確定化合物2為6-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-5，6-二氫血根堿。

化合物3黃色粉末;分子式C23H19NO5；ESI-MS：m/z390 [M+H]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.52(1H，s，H-1)，7.10(1H，s，H-4)，4.87(1H，dd，J=10.5，4.2 Hz，H-6)，6.86(1H，d，J=8.2 Hz，H-9)，7.33(1H，d，J=8.2 Hz，H-10)，7.48(1H，d，J=8.6 Hz，H-11)，7.70(1H，d，J=8.6 Hz，H-12)，6.05(2H，s，H-13)，6.03(2H，s，H-14)，2.64(1H，m，H-1′a)，2.30(1H，dd，J=15.2，4.2 Hz，H-1′b)，2.06(3H，s，H-3′)，2.65(3H，s，N-CH3)；13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ：104.4(C-1)，147.6(C-2)，148.2(C-3)，100.6(C-4)，125.7(C-4a)，139.3(C-4b)，54.5(C-6)，127.5(C-6a)，144.3(C-7)，147.2(C-8)，107.6(C-9)，116.1(C-10)，124.0(C-10a)，123.5(C-10b)，116.5(C-11)，120.0(C-12)，131.0(C-12a)，101.6(C-13)，101.1(C-14)，43.1(N-CH3)，46.6(C-1′)，207.2(C-2′)，31.3(C-3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]基本一致，故確定化合物3為6-丙酮基二氫血根堿。

化合物4黃色粉末;分子式C24H23NO5；ESI-MS：m/z406 [M+H]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.51(1H，s，H-1)，7.10(1H，s，H-4)，5.04(1H，dd，J=11.2，3.7 Hz，H-6)，6.96(1H，d，J=8.6 Hz，H-9)，7.54(1H，d，J=8.6 Hz，H-10)，7.51(1H，d，J=8.6 Hz，H-11)，7.71(1H，d，J=8.6 Hz，H-12)，6.04(2H，s，H-13)，2.58(1H，dd，J=14.9，11.3 Hz，H-1′a)，2.26(1H，dd，J=14.9，3.7 Hz，H-1′b)，2.06(3H，s，H-3′)，2.64(3H，s，N-CH3)，3.96(3H，s，7-OCH3)，3.93(3H，s，8-OCH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：104.5(C-1)，147.6(C-2)，148.2(C-3)，100.6(C-4)，128.2(C-4a)，139.3(C-4b)，54.9(C-6)，127.4(C-6a)，145.5(C-7)，152.1(C-8)，111.5(C-9)，118.8(C-10)，124.8(C-10a)，123.8(C-10b)，119.8(C-11)，123.3(C-12)，131.1(C-12a)，101.0(C-13)，61.0(7-OCH3)，55.8(8-OCH3)，42.8(N-CH3)，46.9(C-1′)，207.6(C-2′)，31.1(C-3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]基本一致，故確定化合物4為6-丙酮基白屈菜紅堿。

化合物5黃色粉末;分子式C20H15NO6；ESI-MS：m/z366 [M+H]+。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ：7.19(1H，s，H-1)，7.06(1H，s，H-4)，6.50(1H，d，J=8.0 Hz，H-9)，6.60(1H，d，J=8.0 Hz，H-10)，7.28(1H，d，J=8.6 Hz，H-11)，7.73(1H，d，J=8.6 Hz，H-12)，6.08(2H，s，H-13)，6.00(2H，s，H-14)，8.18(1H，s，H-CHO)，2.99(3H，s，N-CH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：99.0(C-1)，149.5(C-2)，148.5(C-3)，101.6(C-4)，135.9(C-4a)，134.6(C-4b)，165.4(C-6)，148.2(C-6a)，137.5(C-7)，150.3(C-8)，104.4(C-9)，123.4(C-10)，121.7(C-10a)，128.7(C-10b)，127.5(C-11)，127.8(C-12)，131.4(C-12a)，101.6(C-13)，101.6(C-14)，33.0(N-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]基本一致，故確定化合物5該化合物為isointegriamide。

化合物6黃色粉末;分子式C21H19NO6；ESI-MS：m/z382 [M+H]+。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ：7.19(1H，s，H-1)，7.06(1H，s，H-4)，6.50(1H，d，J=8.0 Hz，H-9)，6.59(1H，d，J=8.0 Hz，H-10)，7.31(1H，d，J=8.7 Hz，H-11)，7.72(1H，d，J=8.6 Hz，H-12)，6.08(2H，s，H-13)，8.18(1H，s，H-CHO)，3.91(3H，s，7-OCH3)，3.90(3H，s，8-OCH3)，2.99(3H，s，N-CH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：99.2(C-1)，149.3(C-2)，148.1(C-3)，104.0(C-4)，135.7(C-4a)，128.7(C-4b)，164.7(C-6)，146.8(C-6a)，135.8(C-7)，152.1(C-8)，104.3(C-9)，125.1(C-10)，118.7(C-10a)，133.4(C-10b)，127.4(C-11)，127.5(C-12)，131.3(C-12a)，101.5(C-13)，61.2(7-OCH3)，55.9(8-OCH3)，33.1(N-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]基本一致，故確定化合物6為arnottianamide.

化合物7淡黃色粉末;分子式C20H15NO4；ESI-MS：m/z334 [M+H]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.07(1H，s，H-1)，7.66(1H，s，H-4)，4.18(2H，s，H-6)，6.82(1H，d，J=8.1，H-9)，7.26(1H，d，J=8.1 Hz，H-10)，7.44(1H，d，J=8.6 Hz，H-11)，7.65(1H，d，J=8.6 Hz，H-12)，6.01(2H，s，H-13)，5.99(2H，s，H-14)，2.59(3H，s，N-CH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：104.2(C-1)，147.9(C-2)，147.4(C-3)，100.6(C-4)，126.4(C-4a)，147.0(C-4b)，48.5(C-6)，113.5(C-6a)，142.4(C-7)，144.5(C-8)，107.9(C-9)，116.1(C-10)，127.1(C-10a)，124.3(C-10b)，120.2(C-11)，123.8(C-12)，130.7(C-12a)，100.9(C-13)，101.2(C-14)，41.6(N-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]基本一致，故確定化合物7為二氫血根堿。

2.2 抗玉米大斑病活性篩選

對從博落回莖中分離得到的8個單體化合物進(jìn)行抗玉米大斑病活性測試，化合物1～7在31.25 μg/紙片劑量下對玉米大斑病無活性，而化合物8能明顯觀察到抑菌區(qū)。然后對化合物8進(jìn)行玉米大斑病孢子萌發(fā)實驗，化合物8表現(xiàn)出比陽性對照吡唑醚菌酯(IC50=18.0 ± 0.5 μg/mL)更強(qiáng)的活性，其IC50值為12.0 ± 0.1 μg/mL。

3 結(jié)論

本研究采用活性追蹤的方法以及正反相硅膠和HPLC等分離技術(shù)對博落回莖中的生物堿類成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究，共分離鑒定了8個生物堿類化合物，其中化合物1、2、5、6首次從博落回莖中分離得到。在抗玉米大斑病活性篩選測試中，化合物8表現(xiàn)出明顯的抑菌活性，而化合物1～7在31.25 μg/紙片劑量未表現(xiàn)出明顯的抑菌活性。然后化合物8在玉米大斑病孢子萌發(fā)實驗中，表現(xiàn)出比陽性對照吡唑醚菌酯(IC50=18.0 ± 0.5 μg/mL)更強(qiáng)的活性，其IC50值為12.0 ± 0.1 μg/mL。其中化合物8(白屈菜紅堿)首次報道抗玉米大斑病的活性，強(qiáng)于陽性對照(吡唑醚菌酯)，而吡唑醚菌酯是一種廣泛用于農(nóng)業(yè)上控制植物病原真菌的新型殺菌劑。其他化合物未表現(xiàn)明顯的抗玉米大斑病活性,這與以往沒有文獻(xiàn)報道這些化合物具有抗植物病原真菌活性保持一致。白屈菜紅堿具有抗植物病原菌的活性，如抗番茄灰霉病[20]、水稻綠膿桿菌[21]等植物病原菌，而抑制水稻綠膿桿菌的可能機(jī)制是使其細(xì)胞壁變薄破裂以及破壞菌絲膜孢子活性氧積累，從而導(dǎo)致病原真菌凋亡。

以上研究初步表明白屈菜紅堿可用作防治玉米大斑病的一種潛在新型生物農(nóng)藥，為開發(fā)新型生物農(nóng)藥的原料提供了一種可能，但是還需要進(jìn)一步的機(jī)理機(jī)制研究來闡明白屈菜紅堿抗玉米大斑病等植物病原真菌機(jī)制的特定靶標(biāo)，從而有助于新型生物農(nóng)藥的潛在研發(fā)及利用。