王府潤，張圣良，孔凡棟，馬青云，謝晴宜，戴好富，陳 萍*，趙友興*

1海南大學(xué)園藝學(xué)院，?？?70228；2中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所?？谑袩釒烊划a(chǎn)物研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海南熱帶農(nóng)業(yè)資源研究院，?？?71101

在眾多真菌中，曲霉屬真菌作為海洋真菌中的優(yōu)勢菌株之一，有豐富的酶類，能夠產(chǎn)生多種類型的、具有生理活性的次級代謝產(chǎn)物[1]。曲霉屬真菌是一種絲狀真菌，在自然界廣泛存在，代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類型多樣，且具有多種生物活性[1]。海洋灰綠曲霉(Aspergillusglaucus)所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物灰綠霉素A是聚酮類的產(chǎn)物之一，目前聚酮類藥物在市場所占暢銷藥的比例高達(dá)20%[2]。在我們從海洋真菌中尋找活性代謝產(chǎn)物的過程中，對一株海口灣中華紫蛤共附生真菌AspergillusclavatonanicusHNMF114的活性代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，從中發(fā)現(xiàn)一些喹唑啉酮生物堿類化合物，部分化合物具有細(xì)菌群體感應(yīng)抑制活性[3]。本文繼續(xù)對真菌A.clavatonanicusHNMF114的非喹唑啉酮生物堿類次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究，測定了次生代謝產(chǎn)物的抗菌活性，以期豐富海洋真菌生物活性物質(zhì)類型。

1 材料與方法

1.1 菌株

海洋真菌Aspergillussp.HNMF114分離自海南文昌海域的中華紫蛤，菌落正面淺肉桂褐色，反面黃褐色。分生孢子頭初為棒形，少量生自氣生菌絲。GenBank登錄號為MK732953。現(xiàn)保藏于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所。

1.2 儀器和試劑

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA公司，日本)；核磁共振光譜儀(AVANCE-500，德國Bruker公司)；質(zhì)譜儀(Mi-cromassAutospec-Uitima TOF)；單人單面凈化工作臺(SW-CJ-1FD型蘇州凈化有限公司)；高效液相色譜儀(安捷倫1260分析型，美國安捷倫科技有限公司)；半制備高效液相色譜儀(SUM-MITP680A，戴安，美國)；酶標(biāo)儀(ELX-800，Bio Tex公司)；鼓風(fēng)干燥箱(上海智城分析儀器公司)；萬分之一電子天平(美國丹佛儀器公司)；pH計(jì)(瑞士梅特勒-托利多)；循環(huán)水真空泵(SHZ-D，鄭州予華儀器制造公司)；搖床(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備公司)；柱色譜硅膠和薄層色譜硅膠板(青島海洋化工廠產(chǎn)品)；氘代試劑購自Merck公司；色譜乙腈購自天津康科德公司；其他試劑均為重蒸工業(yè)試劑。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 PDA培養(yǎng)基

馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.5。

1.3.2 真菌二號

葡萄糖10 g，麥芽糖20 g，味精10 g，酵母膏3 g，玉米漿1 g，甘露醇20 g，MgSO40.3 g，KH2PO40.5 g，水1 L，pH 6.5。

1.3.3 酸水

0.1%三氟乙酸。

1.4 菌株發(fā)酵

將菌株在PDA培養(yǎng)皿培養(yǎng)三天，接種于裝有150 mL PDB培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，180 rpm，25 ℃搖3天，制成種子液。配制真菌二號培養(yǎng)基60 L，每瓶分裝300 mL于1 000 mL的三角瓶中。滅菌后將種子液接種于真菌二號培養(yǎng)基，每瓶1 mL，室溫靜置發(fā)酵30天。

1.5 提取與分離

發(fā)酵結(jié)束后，過濾，分離菌絲和發(fā)酵液，使用與發(fā)酵液同體積的乙酸乙酯分別萃取發(fā)酵液和破碎處理過的菌絲三次。合并萃取液并旋蒸，最終得到浸膏47.13 g。浸膏使用減壓硅膠柱(石油醚:乙酸乙酯)進(jìn)行分離，以8∶1→1∶2的梯度洗脫，分段收集。得到15個組分(Fr.1～Fr.15)。其中Fr.3(0.49 g)經(jīng)過反相硅膠柱色譜(甲醇/水，20%→100%)梯度洗脫后，得到了化合物9(15 mg)和1(7.8 mg)。Fr.11(2.37 g)經(jīng)過反相硅膠柱色譜(甲醇/水系統(tǒng)，20%→100%)，結(jié)合半制備HPLC(C18半制備柱，25%甲醇/酸水系統(tǒng))得到化合物3(4.1 mg，4 mL/min，tR=18.0 min)。Fr.4(1.01 g)經(jīng)過反相硅膠柱色譜(甲醇/水系統(tǒng)，30%→100%)梯度洗脫得到5個組分(Fr.4.1～Fr.4.5)，其中Fr.4.3經(jīng)過反相硅膠柱色譜(乙腈/水系統(tǒng)，20%→60%)得到化合物8(0.9 mg)。Fr.6(7.37 g)經(jīng)過反相硅膠柱色譜(甲醇/水系統(tǒng)，20%→70%)梯度洗脫后得到化合物4(45.7 mg)。Fr.14(1.33 g)經(jīng)過反相硅膠柱色譜(甲醇/水系統(tǒng)，10%→90%)梯度洗脫得到7個組分(Fr.14.1～Fr.14.7)，F(xiàn)r.14.5通過半制備HPLC(C18半制備柱，50%甲醇/水系統(tǒng))得到化合物6(1.5 mg，4 mL/min，tR=5.0 min)、7(2.1 mg，4 mL/min，tR=6.4 min)和5(5.5 mg，4 mL/min，tR=8.5 min)，F(xiàn)r.14.6經(jīng)過反相硅膠柱色譜(甲醇/水系統(tǒng)，20%→50%)，結(jié)合半制備HPLC(C18半制備柱，25%乙腈/酸水系統(tǒng))得到化合物2(3.5 mg，4 mL/min，tR=10.7 min)。

1.6 抑菌活性測試

采用96孔板微量法[4,5]，測定化合物對常見四種致病菌的抑制活性。這四種菌分別是金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，李斯特菌，大腸桿菌。將待測樣品溶液配制成100 μg/mL的溶液，置于4 ℃冰箱備用。無菌96孔板的第1列加入197.44 μL滅菌的LB液態(tài)培養(yǎng)基(0.3%牛肉膏，0.2%酵母浸粉，1%蛋白胨，0.5% NaCl，pH 7.5)，第2～12列加入100 μL滅菌的LB液態(tài)培養(yǎng)基。第1列加入2.56 μL待測化合物，混勻后，二次稀釋法[6]稀釋至11列，第11列不加菌作為陰性對照，第12列不加藥作為空白對照。取100 μL病原菌(1×108～2×108CFU/mL)加入至100 mL LB培養(yǎng)基中，混勻得病原菌菌液。取100 μL加入上述制備好的無菌96孔板的第1～10列及第12列。此時，第1～10孔內(nèi)濃度分別為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL。置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～22 h觀察結(jié)果，如該孔中呈渾濁狀態(tài)，說明相應(yīng)濃度的化合物無抗病菌活性。若孔內(nèi)澄清，說明小孔內(nèi)細(xì)菌被完全抑制生長，該濃度為化合物對該種病菌的最低藥物濃度(MIC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

圖1 化合物1的HMBC和COSY相關(guān)信號Fig.1 Key HMBC and COSY correlations of compound 1

表1 化合物1的1H NMR(500 MHz)和13C NMR(125 MHz)數(shù)據(jù)(CD3OD)

化合物2黃色油狀物；分子式為C22H20N4O2；ESI-MS：m/z395 [M+Na]+；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.17(1H，d，J= 7.9 Hz，H-7/7′)，7.11(1H，d，J= 7.8 Hz，H-4/4′)，6.87(1H，t，J= 7.5 Hz，H-5/5′)，6.78(1H，t，J= 7.5 Hz，H-6/6′)，6.40(1H，s，H-2/2′)，3.69(1H，s，H-11/11′)，2.51(1H，dd，J= 14.2，3.4 Hz，H-10a/10′a)，1.97(1H，dd，J= 14.2，5.8 Hz，H-10b/10′b)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：124.5(d，C-2/2′)，111.4(s，C-3/3′)，108.8(d，C-4/4′)，121.0(d，C-5/5′)，118.7(d，C-6/6′)，118.5(d，C-7/7′)，136.1(s，C-8/8′)，127.4(s，C-9/9′)，30.1(t，C-10/10′)，55.4(d，C-11/11′)，166.9(s，C-12/12′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道基本一致,故確定該化合物為Cyclo(L-Trp-L-Trp)。

化合物3黃色油狀物；分子式為C8H6N2O2；ESI-MS：m/z161 [M-H]-；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.83(1H，d，J= 7.5 Hz，H-5)，7.58(1H，t，J= 7.2 Hz，H-7)，7.12(1H，m，H-6)，7.12(1H，m，H-8)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：150.3(s，C-2)，162.9(s，C-4)，127.0(d，C-5)，122.4(d，C-6)，135.0(d，C-7)，115.4(d，C-8)，114.3(s，C-4a)，140.8(s，C-8a)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道基本一致，故確定該化合物為2,4(1H,3H)-quinazolinedione。

化合物4白色粉末狀物；分子式為C10H12O3；ESI-MS：m/z179 [M-H]-；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.26(1H，s，H-6′)，2.28(3H，s，H-1)，1.95(3H，s，H-8′)，1.85(3H，s，H-7′)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：26.1(q，C-1)，203.7(s，C-2)，113.4(s，C-1′)，162.0(s，C-2′)，111.2(s，C-3′)，161.1(s，C-4′)，116.3(s，C-5′)，130.8(d，C-6′)，7.9(q，C-7′)，16.2(q，C-8′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，故確定該化合物為clavatol。

化合物5黃色油狀物；分子式為C24H22O8；ESI-MS：m/z473 [M+Cl]-；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：6.94(1H，s，H-6/6′)，5.56(1H，s，H-3/3′)，3.89(3H，s，H-11/11′)，3.68(3H，s，H-13/13′)，2.64 (3H，s，H-12/12′)；13C-NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：161.5(s，C-2/2′)，87.5(d，C-3/3′)，169.5(s，C-4/4′)，138.4(s，C-5/5′)，111.7(d，C-6/6′)，59.3(s，C-7/7′)，107.7(s，C-8/8′)，152.9(s，C-9/9′)，106.8(s，C-10/10′)，56.8(q，C-11/11′)，23.6(q，C-12/12′)，56.2(q，C-13/13′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故確定該化合物為kotanin。

化合物6淡黃色油狀物；分子式為C22H18O8；ESI-MS：m/z409 [M-H]-；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：6.41(1H，s，H-6/6′)，5.33(1H，s，H-3/3′)，3.82(3H，s，H-11/11′)，2.45(3H，s，H-12/12′)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：170.0(s，C-2/2′)，85.1(d，C-3/3′)，154.3(s，C-4/4′)，135.8(s，C-5/5′)，118.3(d，C-6/6′)，156.4(s，C-7/7′)，109.1(s，C-8/8′)，162.1(s，C-9/9′)，107.1(s，C-10/10′)，56.3(q，C-11/11′)，23.3(q，C-12/12′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致，故確定該化合物為orlandin。

化合物7淡黃色油狀物；分子式為C23H20O8；ESI-MS：m/z423 [M-H]-；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：6.88(1H，s，H-6)，6.49(1H，s，H-6′)，5.52(1H，s，H-3)，5.34(1H，s，H-3′)，3.86(3H，s，H-11)，3.82(3H，s，H-11′)，3.64(3H，s，H-13)，2.61(3H，s，H-12)，2.45(3H，s，H-12′)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：162.1(s，C-2)，87.4(d，C-3)，170.1(s，C-4)，137.7(s，C-5)，111.6(d，C-6)，159.5(s，C-7)，107.0(s，C-8)，153.2(s，C-9)，109.8(s，C-10)，56.8(q，C-11)，23.6(q，C-12)，21.4(q，C-13)，161.8(s，C-2′)，87.4(d，C-3′)，169.6(s，C-4′)，136.9(s，C-5′)，111.2(d，C-6′)，159.5(s，C-7′)，105.4 (s，C-8′)，154.1(s，C-9′)，107.6(s，C-10′)，56.1(q，C-11′)，23.4(q，C-12′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，鑒定化合物為desmethylkotanin。

化合物8無色油狀物；分子式為C12H14N2O2；ESI-MS：m/z217 [M-H]-；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：8.31(1H，d，J= 7.7 Hz，H-2)，7.68(1H，d，J= 7.7 Hz，H-7)，7.76(1H，t，J= 7.7 Hz，H-8)，7.51(1H，t，J= 7.7 Hz，H-1)，4.57(1H，d，J= 3.7 Hz，H-9)，2.32(1H，m，H-10)，1.15(3H，d，J= 6.9 Hz，H-12)，0.92(3H，d，J= 6.8 Hz，H-11)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：135.0(d，C-1)，127.3(d，C-2)，126.9(s，C-3)，156.9(s，C-4)，148.5(s，C-5)，141.1(s，C-6)，126.8(d，C-7)，136.7(d，C-8)，75.5(d，C-9)，33.8(d，C-10)，19.3(q，C-11)，15.7(q，C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，故確定該化合物為(S)-2-(1-hydroxy-2,2-dimethylpropyl)quinazolin-4(3H)-one。

化合物9黃棕色油狀物；分子式為C14H16N2O3；ESI-MS：m/z259 [M-H]-；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：8.20(1H，d，J= 7.9 Hz，H-2)，7.82(1H，t，J= 7.9 Hz，H-8)，7.68(1H，d，J= 7.9 Hz，H-7)，7.53(1H，t，J= 7.9 Hz，H-1)，5.14(1H，d，J= 7.9 Hz，H-9)，2.30(1H，m，H-10)，2.16(3H，s，H-14)，1.06(3H，d，J= 6.6 Hz，H-12)，0.98(3H，d，J= 6.8 Hz，H-11)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：128.2(d，C-1)，127.2(d，C-2)，119.4(s，C-3)，160.5(s，C-4)，154.2(s，C-5)，146.0(s，C-6)，128.0(d，C-7)，136.0(d，C-8)，79.6(d，C-9)，33.1(d，C-10)，18.8(q，C-11)，18.4(q，C-12)，172.2(s，C-13)，20.6(q，C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，故確定該化合物(S)-2-methyl-1-(4-oxo-3,4-dihydroquinazolin-2-yl) propyl acetate。

2.2 抑菌活性測試結(jié)果

對分離得到的部分化合物分別進(jìn)行乙酰膽堿酯酶抑制活性和抑菌活性測試。乙酰膽堿酶沒有明顯活性。新化合物1對大腸桿菌的生長具有一定的抑制作用，最小抑菌濃度(MIC)為2 μg/mL?；衔?、9對金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用，最小抑制濃度分別為1 μg/mL和4 μg/mL?；衔?對枯草芽孢桿菌有一定的抑制作用，最小抑制濃度分別為8 μg/mL?；衔?、5、9對李斯特菌有一定的抑制作用，最小抑制濃度分別為4、4和8 μg/mL。見表2。

圖2 化合物1～9的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structures of compounds 1-9

表2 化合物1～9的MIC值

3 結(jié)論

本研究從真菌HNMF114發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到了9個化合物，包括1個新化合物，按照結(jié)構(gòu)類型可分為香豆素類、喹唑啉類和環(huán)二肽類等?？咕钚詼y試顯示新化合物1對大腸桿菌的生長具有較強(qiáng)的抑制作用，最小抑菌濃度(MIC)為2 μg/mL，化合物4、9對金黃色葡萄球菌有抑制作用。這些化合物沒有顯示乙酰膽堿酶抑制活性。有研究報(bào)道化合物5和6對尖孢鐮刀菌有明顯的抑制作用[16]。喹唑啉類化合物是一類重要的含氮稠雜環(huán)化合物，相關(guān)研究報(bào)道該化合物有抑制組織蛋白激酶C-θ[17]的活性以及鎮(zhèn)痛、抗炎[18]的作用。從海洋放線菌中發(fā)現(xiàn)的新異戊烯二酮哌嗪[19]與化合物2結(jié)構(gòu)類似，其中具有橋連結(jié)構(gòu)的nocardioazine A被證明是一個膜蛋白外排泵P-糖蛋白的非細(xì)胞毒性抑制劑。曲霉屬真菌被報(bào)道具有多種生物活性物質(zhì)，本研究團(tuán)隊(duì)在番木瓜中發(fā)現(xiàn)了曲霉等屬的一些真菌，并且部分真菌具有保鮮功效[20]。但因次生代謝產(chǎn)物非菌體生長必需物質(zhì)，故而產(chǎn)量較低，且對其具體生物合成途徑了解不夠，后期可結(jié)合基因組學(xué)、生物合成等技術(shù)對曲霉屬真菌次生代謝產(chǎn)物做深入挖掘，為合理開發(fā)利用熱帶生物附生真菌資源提供科學(xué)理論依據(jù)。

致謝：中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所在分離鑒定工作中提供的部分設(shè)備和幫助。