洪茜茜，耿樹香，張銀志，孫秀蘭，徐德平*

1江南大學食品學院，無錫 214122；2云南省林業(yè)科學院，昆明 650201

核桃分心木(Diaphragma Juglandis Fructus,DJF)，又稱核桃隔膜、核桃瓣膜。核桃分心木的傳統(tǒng)藥用用途包括治療和預防糖尿病[1,2]、腎虛、腹瀉和泌尿生殖系統(tǒng)疾病。體內外研究發(fā)現(xiàn)除了傳統(tǒng)的補腎作用外，分心木還具有鎮(zhèn)靜催眠[3]、抗氧化[4,5]、抗炎[6]、抗腫瘤[7]等作用，可應用于保健食品、醫(yī)藥等相關領域的產品開發(fā)。

在全球范圍內，大約10%～15%的成年人患有慢性失眠，而另外25%～35%的人則患有短暫性或偶發(fā)性睡眠障礙[8]。除了影響日常生活質量和工作效率外，這些障礙還會導致各種健康和社會經濟問題[9]。在失眠的傳統(tǒng)治療方法中，藥物治療是最常用，如苯二氮卓類藥物和非苯二氮卓類藥物等處方藥會發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用以改善患者的病情；但是，長期使用可能會導致習慣化和戒斷癥狀[10,11]。面對這些限制，人們傾向于尋求有效安全且副作用更少的天然藥物來治療或減輕失眠癥狀。

目前針對分心木鎮(zhèn)靜催眠活性研究多集中于粗提物，未能定位到具體功能成分。Zhao[12]發(fā)現(xiàn)分心木水提物能縮短戊巴比妥鈉誘導的小鼠入睡潛伏時間、延長睡眠持續(xù)時間、趨勢性降低自主活動。本文利用小鼠曠場實驗和戊巴比妥鈉誘導的睡眠實驗指導分離方向，通過柱層析和薄層色譜逐步分離出具有鎮(zhèn)靜催眠活性的單體化合物，核磁共振技術鑒定其結構。研究結果可為核桃分心木資源的開發(fā)利用提供理論依據，增加核桃資源附加值。

1 材料與試劑

1.1 材料及試劑

核桃分心木(云南省林業(yè)科學院)。

無水乙醇、濃硫酸、茴香醛、冰醋酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；戊巴比妥鈉(成都貝斯特試劑有限公司)；艾司唑侖(常州四藥制藥有限公司)。

SPF級雄性ICR小鼠(維通利華實驗動物技術有限公司)。

1.2 設備及儀器

AB-8型(天津南開大學化學工廠)；ODS填料(Nacalai Tosoh Inc)；MCI GEL填料(Mitsubishi Chemical Corporation)。核磁共振儀(Avance 500 MHz,Bruer公司)；DS-2CD2TDY-14mm型網絡攝像機(杭州?？低晹?shù)字技術股份有限公司)； Ethovision 11.5行為學計算機軟件分析系統(tǒng)(Intetro 曠場，諾達斯信息技術責任有限公司)。

2 方法

2.1 核桃分心木提取物制備及粗分離

稱取核桃分心木10 kg，粉碎后過40目篩，置于100 L提取罐，按1∶10(kg∶L)料液質量體積比加入體積分數(shù)70%乙醇，60 ℃條件下攪拌提取4 h，過濾，取濾液，濾渣按上述方法再次醇提，收集濾液并與第一次濾液合并，減壓濃縮至適宜體積，即為分心木乙醇提取物，-20 ℃下冷凍保存。分心木醇提后的濾渣中水提兩次，收集濾液減壓濃縮至膏狀物，即為分心木水提物。

取適量分心木水提物，加入3倍體積的無水乙醇，并且不斷攪拌使得濃縮液充分醇沉，靜置過夜，水提醇沉相(A)經干燥得到固態(tài)顆粒于-20 ℃下冷凍保存，水提醇溶相減壓濃縮至適宜體積和醇提物合并，即為分心木混合提取物。取適量分心木混合提取物上AB-8型大孔樹脂柱(10 cm×150 cm)，依次用水和30%、50%、70%的乙醇進行梯度洗脫，薄層色譜法(thin-layer chromatography，TLC)跟蹤監(jiān)測洗脫液中的成分，并根據TLC檢測結果將具有相同成分的洗脫液合并，將洗脫液分成B(水洗脫)、C(30%和50%洗脫)和D(70%洗脫)3個部分。分別減壓濃縮后，-20 ℃下冷凍保存。

2.2 核桃分心木粗組分鎮(zhèn)靜催眠功效的研究

將60只SPF級4周齡雄性ICR小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為6組，每組10只。空白組和試驗組以1.0 g/kg·bw劑量分別灌胃溶劑、A、B、C、D，陽性對照組以2 mg/kg·bw艾司唑侖灌胃。連續(xù)灌胃14天后，展開試驗。試驗在25 ℃左右安靜環(huán)境下進行。

2.2.1 曠場實驗

使用由4個活動空間組成的4個單元(每個單元50 cm×50 cm×38 cm)的曠場迷宮進行實驗，每次檢測4只鼠。實驗前用酒精將曠場空間擦干凈，樣品組給藥30 min后(陽性對照組給藥15 min)開始實驗。實驗時輕輕抓住鼠尾，將鼠放在每個單元曠場迷宮的中間，讓小鼠在迷宮內適應5 min，之后點擊軟件開始按鈕激活軟件，跟蹤鼠移動路徑，以10 min內運動平均速度、運動時間和中央區(qū)域停留時間為指標，使用EthoVision XT 11軟件進行數(shù)據分析。每次試驗結束，清理尿液和糞便，并使用5%～10%的乙醇噴灑在迷宮底面和內壁，用紙巾擦拭干凈，消除小鼠遺留的氣味后再測試下一組小鼠，避免氣味和殘留物對下一只小鼠的影響[13]。

2.2.2 直接觀察睡眠實驗

曠場實驗結束次日晚進行直接睡眠觀察。灌胃30 min后，監(jiān)控攝像觀察并記錄灌胃后12 h內各組小鼠的睡眠時間[14]。

2.2.3 戊巴比妥鈉誘導的睡眠實驗

在正式實驗前先進行預實驗確定戊巴比妥鈉腹腔注射劑量，以腹腔注射后全部小鼠入睡且睡眠持續(xù)時間適中的劑量為標準，并以此劑量(為50 mg/kg·bw)進行正式實驗。小鼠末次灌胃30 min后通過腹腔注射戊巴比妥鈉誘導睡眠，小鼠睡眠潛伏期記錄為戊巴比妥鈉注射后至翻正反射消失的時間，以翻正反射消失至再次出現(xiàn)的時間記錄為小鼠睡眠時間[15]，觀察各組潛伏期是否縮短，睡眠時間是否延長。

2.3 大孔樹脂洗脫活性組分的分離及鎮(zhèn)靜催眠功能的測定

將具有鎮(zhèn)靜催眠功能的B組分上樣到MCI柱(5 cm×100 cm)，依次用水，10%、30%和50%的乙醇進行梯度洗脫，流速15 mL/min，自動收集器每管20 mL收集洗脫液，用TCL法跟蹤監(jiān)測洗脫液中的成分，并根據Rf值和顯色反應的結果合并相同組分，得到B-1(水洗脫)、B-2(10%和30%洗脫)、B-3(50%洗脫)三個組分。

2.4 MCI柱洗脫組分鎮(zhèn)靜催眠功效的研究

按2.2方法對MCI柱分離得到的B-1、B-2、B-3組分進行動物試驗，分析各組分鎮(zhèn)靜催眠的作用。

2.5 具有鎮(zhèn)靜催眠活性的單一成分的分離與結構鑒定

將具有鎮(zhèn)靜催眠功能的B-1組分反復上樣到ODS色譜柱，直至得到4個單體成分，用重水(D2O)或氘代二甲亞砜(DMSO-d6)溶解進行1H NMR和13C NMR等光譜數(shù)據分析，確定其結構。

2.6 單體化合物鎮(zhèn)靜催眠的功效

將單體化合物按“2.2”的方法進行動物試驗，判定其鎮(zhèn)靜催眠的功效。

2.7 數(shù)據分析

數(shù)據表示為平均值±標準誤差(SEM)。使用SPSS 20軟件單向方差分析(ANOVA)對數(shù)據進行統(tǒng)計評估。P< 0.05被認為具有統(tǒng)計學顯著性。

3 結果

3.1 大孔樹脂粗組分鎮(zhèn)靜催眠活性分析

3.1.1 鎮(zhèn)靜活性分析

從表1曠場實驗表明，與空白組相比，陽性對照組和B組均顯著降低了小鼠的運動速度和運動時間(P<0.05)，其中陽性對照組顯著降低增加了小鼠在中央區(qū)域的停留時間(P<0.05)。而其他組分較之空白組沒有統(tǒng)計學差異。

表1 核桃分心木粗組分對小鼠運動速度、運動時間以及中央區(qū)域停留時間的影響

3.1.2 催眠活性分析

如表2所示，從灌胃后12 h內睡眠總時長來看，各實驗組較之空白組均有所增加，且僅B組和陽性對照組極顯著(P< 0.01)。另外，戊巴比妥鈉誘導的睡眠實驗結果表明，B組和陽性對照組分別使睡眠潛伏期縮短了24.62%(P<0.05)和25.88%(P<0.05)，同時令睡眠時長延長了61.49%(P<0.05)和254.19%(P< 0.01)。

表2 核桃分心木粗組分對小鼠自然情況12 h睡眠時長、戊巴比妥鈉誘導睡眠的潛伏期和睡眠時間的影響

由上述結果可知，B組為分心木中鎮(zhèn)靜催眠的活性部位，對其進行進一步的分離。

續(xù)表2(Continued Tab.2)

3.2 MCI洗脫各組分鎮(zhèn)靜催眠活性分析

3.2.1 鎮(zhèn)靜活性分析

由表3可知，與空白組相比，B-1組雖未顯著降低小鼠的運動速度(降低了15.87%)，但使得運動時間減少了17.17%(P<0.05)，中央區(qū)域的停留時間增加了57.85%(P<0.05)。

表3 MCI洗脫各組分對小鼠運動速度、運動時間以及中央區(qū)域停留時間的影響

3.2.2 催眠活性分析

如表4所示，從灌胃后12 h內睡眠總時長來看，B-1、B-2、陽性對照組的睡眠總時長分別增加了36.4%(P<0.05)、11.99%、49.77%(P<0.01)，而B-3組睡眠時長有所降低。B-1組和陽性對照組分別使睡眠潛伏期縮短了21.87%(P<0.05)和27.21%(P<0.05)，同時令睡眠時長延長了49.09%(P<0.05)和281.30%(P< 0.01)。

表4 MCI洗脫各組分對小鼠自然情況12 h睡眠時長、戊巴比妥鈉誘導睡眠的潛伏期和睡眠時間的影響

綜合上述結果，B-1組為鎮(zhèn)靜催眠的有效組分，對其進行進一步的分離純化。

3.3 單體化合物的鑒定

具有鎮(zhèn)靜催眠活性的B-1組分經進一步的分離得到4個單體化合物。

化合物1白色無定形粉末，易溶于水;從1H NMR(500 MHz，D2O)譜可見，氫信號集中在3～4之間，且無端基氫信號，故推測為糖類化合物。13C NMR譜共顯示6個碳信號，結合135DEPT可見，無端基碳信號，且δC62.9(C-1)、72.6(C-2)、74.1(C-3)、70.0(C-4)、71.1(C-5)、62.4(C-6)。經文獻對比[16,17]，分析該化合物為2-羥甲基-四氫吡喃-3，4，5-三醇，又稱1，5-脫水-D-葡萄糖醇。

化合物2白色無定形粉末，易溶于水;從1H NMR(500 MHz，D2O)譜可見，共有5個氫信號，其中δH6.63(1H，s)、4.07(1H，s)、3.86(1H，s，J= 4.0 Hz)、2.79(1H，d，J=15.0 Hz)、2.63(1H，dd，J=8.0,7.5 Hz)，其中δH4.07為連氧碳的氫信號，δH2.79和2.63為-CH2-的氫信號；13C NMR譜共顯示4個碳信號，分別為δC181.2(-COOH)、135.5、70.2、42.5。135DEPT譜圖可知，δC135.5為-CH-的碳信號，根據化學位移推斷-CH-以雙鍵與亞氨基相連，δC70.2為連氧碳信號，δC42.5為-CH2-的碳信號。經文獻對比[18]，分析該化合物為3-羥基-4-亞氨基丁酸。

化合物3淡黃色粉末，可溶于水、乙醇和甲醇;從1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)譜可見，δH4.38(1H，d，J=4.5 Hz)為葡萄糖上的端基H信號，δH3.15(1H，t，J= 8.5 Hz)，δH3.00(1H，t，J= 8.5 Hz)表明有2個-CH-，δH3.07～4.38為糖上的H信號，1.06(3H，m)，1.01(3H，m)表明有2個甲基存在，δH4.17(1H，t，J= 4.0 Hz)表明存在-OH，且相鄰碳上有氫；13C NMR譜共顯示10個碳信號，δ100.79為葡萄糖端基碳信號，δC77.8、73.5、70.3、69.1、61.2為葡萄糖的其余碳信號，δC76.8、76.7為-CH-的碳信號，δC19.1、14.7為-CH3信號。通過端基碳信號和氫信號的偶合常數(shù)表明葡萄糖為α構型。經文獻對比[19]，分析該化合物為(1′-甲基-2′-羥基)丙烷-O-α-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物4白色粉末，易溶于水、乙醇等，不溶于氯仿;從1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)譜可知，δH6.84(1H，d，J= 8.5 Hz)和7.01(1H，d，J= 7.0 Hz)為連有羥基碳的鄰位碳上的氫。δH5.45(1H，d，J= 5.0 Hz)和5.14(1H，d，J= 5.0 Hz)為兩個葡萄糖端基H信號，葡萄糖6＇位上的兩個質子分別在δH3.50和3.54，δH3.18～3.44為糖上的其他質子信號。13C NMR譜顯示共有22個碳信號，其中12個碳為糖中的碳，且δC101.5和103.5為端基碳信號。δC148.8、149.0、153.3為萘環(huán)上的連氧碳信號，δC126.9和128.0為兩苯環(huán)連接處的碳信號，δC109.3～115.7為萘環(huán)上的-CH-信號。通過端基碳信號和氫信號的偶合常數(shù)表明兩個葡萄糖均為β構型。經文獻對比[20]，分析該化合物為6-羥基萘基-1，2-(2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)。

3.4 單體化合物鎮(zhèn)靜催眠活性分析

3.4.1 鎮(zhèn)靜活性分析

單體化合物的鎮(zhèn)靜結果見表5。與空白組相比，化合物1、3、4未表現(xiàn)出顯著性差異；化合物2則顯著降低了小鼠的運動速度和運動時間(P<0.05)，增加了小鼠在中央區(qū)域的停留時間(P<0.01)。

表5 單體化合物對小鼠運動速度、運動時間以及中央區(qū)域停留時間的影響

3.4.2 催眠活性分析

如表6所示，化合物1和2以及陽性對照組12 h內的睡眠總時長較之空白組均有所增加，且具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。戊巴比妥鈉誘導的睡眠實驗結果表明，化合物1未能縮短潛伏期，但可延長睡眠時間；化合物2使睡眠潛伏期縮短了24.62%(P<0.05)，且使睡眠時長延長了61.49%(P<0.05)?；衔?相較于空白組無明顯差異。化合物4雖使得小鼠睡眠潛伏期縮短，但對其睡眠時長幾乎無影響。

表6 單體化合物對小鼠自然情況12 h睡眠時長、戊巴比妥鈉誘導睡眠的潛伏期和睡眠時間的影響

綜上所述，化合物1僅具有延長小鼠睡眠時間的功能，而化合物2則具有鎮(zhèn)靜催眠活性。

4 討論與結論

目前已被明確研究的天然鎮(zhèn)靜催眠成分有糖類，類黃酮，木脂類和香豆素以及皂苷等[21]，含有糖類、黃酮類、木脂素類、酚類、皂苷類的分心木可能在鎮(zhèn)靜催眠方面具有良好的療效。本研究探討了核桃分心木的鎮(zhèn)靜催眠作用及其功效成分。在評估鎮(zhèn)靜和催眠活性的藥理學方法中，曠場實驗和戊巴比妥鈉誘導的睡眠實驗是兩種經典的行為方法。在曠場實驗中測得的小鼠平均運動速度、時間等通常被認為是控制睡眠活動的重要指標[22]。本研究表明，化合物2能減少正常小鼠的平均運動速度以及時間，增加在中央區(qū)域停留的時間。此外，戊巴比妥鈉(短期鎮(zhèn)靜劑和催眠藥)誘發(fā)的睡眠試驗中獲得的潛伏期和睡眠持續(xù)時間也通常用作評估物質鎮(zhèn)靜催眠作用的指標[23]?；衔?未能縮短潛伏期，但可延長睡眠持續(xù)時間；化合物2可縮短睡眠潛伏期，延長睡眠持續(xù)時長。且兩者均能增加自然條件下小鼠12 h內的睡眠時長。其中化合物2(3-羥基-4-亞氨基丁酸)具有顯著鎮(zhèn)靜催眠的活性，可能是因為其結構與γ-氨基丁酸類似，因而具有類似的活性。

據報道，具有鎮(zhèn)靜催眠功能活性的中藥有效成分發(fā)揮作用的機理有：(1)調節(jié)中樞神經遞質。神經遞質不僅在正常的睡眠清醒節(jié)律調節(jié)中起著重要作用，而且在紊亂的過程中也發(fā)揮著重要的作用。如五味子乙素B通過增加下丘腦5-HT和γ-氨基丁酸水平在對氯苯丙氨酸致失眠大鼠模型中發(fā)揮催眠作用[24]。(2)影響睡眠相關細胞因子，如膽囊收縮素、食欲素和其他內源性物質。曾雪愛等發(fā)現(xiàn)松郁安神方的鎮(zhèn)靜催眠作用機制可能與調節(jié)下丘腦內源性睡眠促進物質PGD2含量有關[25]。故化合物1和2可能是通過以上2種途徑發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用，具體是哪種作用機制有待進一步研究。

核桃分心木提取物大孔樹脂水洗脫組分具有鎮(zhèn)靜催眠的活性，該組分經MCI分離后，有效組分集中在MCI水洗脫物中，對其進一步分離得到4個單體化合物，分別為2-羥甲基-四氫吡喃-3，4，5-三醇(1)、3-羥基-4-亞氨基丁酸(2)、(1′-甲基-2′-羥基)丙烷-O-α-D-吡喃葡萄糖苷(3)、6-羥基萘基-1，2-(2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)(4)。本文通過動物實驗初步判斷2-羥甲基-四氫吡喃-3，4，5-三醇僅具有延長小鼠睡眠時間的功效，3-羥基-4-亞氨基丁酸則具有鎮(zhèn)靜催眠的功能活性。上述研究為分心木應用于治療失眠提供了理論支持，為其后續(xù)的保健食品藥品的開發(fā)、鎮(zhèn)靜催眠功效的臨床應用奠定了基礎。