楊寶嘉，曾政權(quán)，宋 玉，郝小江，李順林*

1中國科學(xué)院昆明植物研究所 植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201；2中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3陜西師范大學(xué)，西安 710062

菊科Compositae天名精屬Carpesium植物在世界范圍內(nèi)約有21種，大部分均分布在亞洲和歐洲[1]。天名精(CarpesiumabrotanoidesL.)作為多年生草本的傳統(tǒng)中藥材，被中國、韓國、日本等東南亞國家長期用于治療各種疾病[2]。《本草綱目》對(duì)天名精有記載，甘、寒、無毒；主治吐血，咽喉腫塞，痰涎壅滯，風(fēng)毒瘰疬，疔瘡腫毒，蛔蟲、蟯蟲[3]。國內(nèi)外報(bào)道，該植物富含單萜、倍半萜、二萜和酚類等特征成分，且多具有有效的消炎、抗真菌、抗寄生蟲、抗腫瘤和抗病毒等藥理活性[4-6]。萜類化合物具有豐富的結(jié)構(gòu)類型和多樣的生物活性，比如倍半萜、單萜等化合物，它們?yōu)橄葘?dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)新藥研發(fā)有著重要的應(yīng)用價(jià)值[7]。

為進(jìn)一步研究天名精植物的化學(xué)資源，繼續(xù)尋找具有生物活性的化學(xué)成分。本研究對(duì)其石油醚提取物的化學(xué)成分及體外抗腫瘤活性進(jìn)行探尋，可為傳統(tǒng)中藥材在抗腫瘤活性領(lǐng)域的開發(fā)與利用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Bruker AV 500 MHz、600 MHz或800 MHz核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo))；Agilent UPLC/Q-Tof 液質(zhì)聯(lián)用儀；島津HPLC-20 AT；色譜柱為Capecell Pack MG II(4.6 mm×250 mm,5 μm)，Shim-Pack GIS(10 mm×250 mm，5 μm)；Multiskan FC-Thermo多功能酶標(biāo)儀。

硅膠、GF 254薄層層析硅膠板(青島海洋化工廠)；反相填料Lichroprep RP-18 gel(40-63 μm)(德國默克公司)；MCI填料MCI-gel-CHP-20 P(日本三菱公司)；凝膠Sephadex LH-20(Pharmacia公司)。顯色劑為10%硫酸乙醇和5%香草醛，均勻噴灑后加熱至顯色。

天名精于2019年10月購自安徽亳州市焦城區(qū)昌升中藥材市場(chǎng)，經(jīng)中國科學(xué)院昆明植物研究所雷立公研究員鑒定為CarpesiumabrotanoidesL.的全草，標(biāo)本(No.H20191027)現(xiàn)保存于中國科學(xué)院昆明植物研究所植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 細(xì)胞株

白血病(HL60)、肺癌(A549)、肝癌(SMMC7721)、乳腺癌(MCF7)以及結(jié)腸癌(SW480)均由中國科學(xué)院昆明植物研究所天然藥物活性篩選中心提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 提取分離

干燥的天名精全草10 kg，粉碎后甲醇加熱回流浸提三次，合并浸提液、減壓蒸餾濃縮，得到甲醇浸膏。此浸膏經(jīng)水混懸后，依次用石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取。將石油醚萃取物250.7 g以體積比1∶1拌硅膠(200～300目)進(jìn)行柱層析，石油醚/丙酮(100∶1→1∶1)梯度洗脫，得到六組分(Fr.1～6)。

Fr.3組分14.7 g經(jīng)MCI層析柱，甲醇-水(30%→100%)梯度洗脫，得到七部分(Fr.3.1～3.7)。Fr.3.3經(jīng)二氯甲烷/甲醇(1∶1，V/V)Sephadex LH-20凝膠分離，再經(jīng)半制備HPLC純化(80%甲醇水，保留時(shí)間10.5 min)，得到化合物1(6.1 mg)。Fr.3.4經(jīng)硅膠柱分離，以石油醚/乙酸乙酯(25∶1→5∶1)梯度洗脫，再經(jīng)半制備HPLC純化(38%乙腈水，保留時(shí)間35 min)，得到化合物5(3.2 mg)。Fr.3.6經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析、RP-C18和甲醇Sephadex LH-20凝膠純化，得到化合物4(10.9 mg)、7(5.6 mg)。

Fr.5組分49.0 g經(jīng)MCI層析柱，甲醇-水(10%→100%)梯度洗脫，得到五部分(Fr.5.1～5.5)。Fr.5.1經(jīng)過石油醚/丙酮(30∶1→5∶1)梯度洗脫，再經(jīng)半制備HPLC純化(50%乙腈水，保留時(shí)間10、12 min)，得到化合物3(4.2 mg)、6(4.3 mg)。Fr.5.2經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析和甲醇凝膠分離，再經(jīng)半制備HPLC純化(35%乙腈水，保留時(shí)間31 min)，得到化合物8(4.1 mg)。Fr.5.3經(jīng)過石油醚/丙酮(25∶1→5∶1)梯度洗脫，再經(jīng)半制備HPLC純化(50%甲醇水，保留時(shí)間65 min)，得到化合物9(4.3 mg)。Fr 5.4 經(jīng)甲醇凝膠分離和半制備HPLC純化(49%乙腈水，保留時(shí)間11.5 min)，得到化合物2(2.8 mg)。

1.3.2 細(xì)胞毒活性測(cè)試-MTS法

用含10%的胎牛血清培養(yǎng)液(DMEM或RMPI 1640)配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔3 000～15 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積100 μL，細(xì)胞需提前12～24 h接種培養(yǎng)?；衔镉肈MSO溶解，將單體化合物配制為40 μM濃度進(jìn)行初篩，每孔終體積為200 μL，每個(gè)處理均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。37 ℃培養(yǎng)48 h后，貼壁細(xì)胞棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加MTS溶液20 μL和培養(yǎng)液100 μL；懸浮細(xì)胞棄100 μL培養(yǎng)上清液，每孔加20 μL的MTS溶液；設(shè)3個(gè)空白復(fù)孔(MTS溶液20 μL和培養(yǎng)液100 μL的混合液)，繼續(xù)孵育2～4 h，使反應(yīng)充分進(jìn)行后測(cè)定光吸收值(OD)。選擇492 nm波長，多功能酶標(biāo)儀讀取各孔OD值。順鉑(DDP)和紫杉醇(taxol)為陽性化合物。每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次，按如下公式計(jì)算數(shù)據(jù)，用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

抑制率=[(空白組平均OD值-實(shí)驗(yàn)組OD

值)/空白組平均OD值]×100%

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1無色油狀物；ESI-MS：m/z361 [M+Na]+，分子式C18H26O6；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.89(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5)，6.70(1H，s，H-2)，6.64(1H，dd，J= 8.0，1.8 Hz，H-6)，4.45(4H，dd，J= 18.7，12.0 Hz，H-9，H-10)，2.57(2H，m，H-2′，H-2′′)，2.27(3H，s，7-CH3)，1.12(12H，d，J= 7.0 Hz，3′，3′′，3′，3′′-CH3)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：140.1(s，C-1)，118.6(d，C-2)，156.6(s，C-3)，118.7(s，C-4)，126.5(d，C-5)，120.5(d，C-6)，21.0(q，C-7)，78.8(s，C-8)，67.3(t，C-9，C-10)，177.5(s，C-1′，1′′)，33.9(d，C-2′，C-2′′)，18.8(q，C-3′，3′，3′′，3′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道一致，故鑒定為8-hydroxy-9,10-diisobutyryloxy-thymol。

就這樣，在唐人街，他結(jié)識(shí)了很多熱心朋友，他們會(huì)告訴李先生哪里有最適合老人休閑的地方，哪里有李先生會(huì)喜歡的特色小吃，哪里有最近的便利店等等。有了他們，李先生就像多了很多雙眼睛。有什么不懂和需要，他在華人社區(qū)里聊上一圈，就全解決了。

化合物3無色油狀物；ESI-MS：m/z189 [M+Na]+，分子式C10H14O2；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.00(1H，d，J= 7.4 Hz，H-5)，6.73(1H，d，J= 8.2 Hz，H-6)，6.71(1H，s，H-2)，3.94(1H，dd，J= 9.7，3.8 Hz，H-9a)，3.72(1H，dd，J= 9.7，7.8 Hz，H-9b)，3.21(1H，m，H-8)，2.28(3H，s，7-CH3)，1.31(3H，d，J= 7.3 Hz，10-CH3)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：137.9(s，C-1)，117.7(d，C-2),154.7(s，C-3)，127.5(s，C-4)，127.6(d，C-5)，121.4(d，C-6)，20.9(q，C-7)，36.6(d，C-8)，69.6(t，C-9)，15.7(q，C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道一致，故鑒定為9-hydroxy-thymol。

化合物5無色油狀物；ESI-MS：m/z237 [M-H]-，分子式C13H18O4；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.84(1H，d，J= 7.8 Hz，H-5)，6.73(1H，s，H-2)，6.66(1H，d，J= 7.8 Hz，H-6)，4.22(2H，d，J= 11.6 Hz，H-9a，H-10a)，3.84(2H，d，J= 11.6 Hz，H-9b，H-10b)，2.28(3H，s，7-CH3)，1.56(3H，s，2′-CH3)，1.51(3H，s，3′-CH3)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：140.2(s，C-1)，118.8(d，C-2)，156.7(s，C-3)，118.4(s，C-4)，124.9(d，C-5)，120.5(d，C-6)，21.0(q，C-7)，72.2(s，C-8)，68.0(t，C-9,C-10)，98.7(s，C-1′)，17.7(q，2′)，29.2(q，C-3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道一致，故鑒定為8-hydroxy-9,10-dioxy-isopropylidene-thymol。

化合物6無色油狀物；ESI-MS：m/z231 [M+Na]+，分子式C13H20O2；1H NMR(800 MHz，CDCl3)δ：6.54(1H，dd，J= 15.8，10.2 Hz，H-7)，6.10(1H，d，J= 15.8 Hz，H-8)，5.63(1H，d，J= 3.0，1.5 Hz，H-4)，4.27(1H，s，H-3)，2.50(1H，d，J= 10.2 Hz，H-6)，2.26(3H，s，10-CH3)，1.84(1H，dd，J= 13.5，6.0 Hz，H-2b)，1.64(3H，s，13-CH3)，1.41(1H，dd，J= 13.6，6.4 Hz，H-2a)，1.03(3H，s，11-CH3)，0.89(3H，s，12-CH3)；13C NMR(200 MHz，CDCl3)δ：33.9(s，C-1)，43.8(t，C-2)，65.5(d，C-3)，125.8(d，C-4)，135.5(s，C-5)，54.3(d，C-6)，147.1(d，C-7)，133.6(d，C-8)，198.0(s，C-9)，27.2(q，C-10)，29.3(q，C-11)，24.7(q，C-12)，22.7(q，C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致，故鑒定為(3R,6R,7E)-3-hydroxy-4,7-megastigmadien-9-one。

化合物7無色油狀物；ESI-MS：m/z247 [M+Na]+，分子式C13H20O3；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.92(1H，s，H-2)，5.87(1H，dd，J= 15.6，5.4 Hz，H-8)，5.79(1H，d，J= 15.6 Hz，H-7)，4.42(1H，m，H-9)，2.45(1H，d，J= 17.0 Hz，H-6a)，2.25(1H，d，J= 17.0 Hz，H-6b)，1.90(3H，s，13-CH3)，1.30(3H，d，J= 6.4 Hz，10-CH3)，1.08(3H，s，12-CH3)，1.00(3H，s，11-CH3)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：198.0(s，C-1)，126.9(d，C-2)，162.55(s，C-3)，79.1(s，C-4)，41.2(s，C-5)，49.7(s，C-6)，135.7(d，C-7)，129.0(d，C-8)，68.0(d，C-9)，23.8(q，C-10)，22.9(q，C-11)，24.1(q，C-12),18.9(q，C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致，故鑒定為blumenol A。

化合物9無色油狀物；ESI-MS：m/z219 [M+Na]+，分子式C11H16O3；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.69(1H，s，H-10)，4.33(1H，qt，H-5)，1.40～2.56(4H，m，H-4a，H-4b，H-6a，H-6b)，1.78(3H，s，7-CH3)，1.47(3H，s，2-CH3)，1.27(3H，s，1-CH3)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：26.40(q，C-1)，27.0(q，C-2)，35.9(s，C-3)，45.6(t，C-4)，66.9(d，C-5)，47.14(t，C-6)，30.7(q，C-7)，86.6(s，C-8)，172.1(s，C-9)，113.0(d，C-10)，182.4(s，C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致，故鑒定為loliolide。

圖1 化合物1～9的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1-9

2.2 抗腫瘤活性

經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研顯示，天名精屬植物中萜類化合物具有顯著的生物活性，為此本文選取分離得到的單萜類、倍半萜類化合物分別對(duì)白血病(HL60)、肺癌(A549)、肝癌(SMMC7721)、乳腺癌(MCF7)和結(jié)腸癌(SW480)這常規(guī)五株癌細(xì)胞進(jìn)行了體外細(xì)胞毒活性篩選。

研究結(jié)果顯示，這些化合物在40 μM濃度下，對(duì)以上五株人腫瘤細(xì)胞具有弱的細(xì)胞毒活性。其中，化合物2、8對(duì)MCF7、SW480細(xì)胞的增殖具有一定抑制作用，化合物2抑制作用表現(xiàn)較明顯，其對(duì)人腫瘤細(xì)胞株MCF7、SW480的抑制率分別為71.97%±2.73%和81.25%±1.21%(見表1)。

表1 40 μM化合物對(duì)常規(guī)五株細(xì)胞的細(xì)胞毒活性

3 結(jié)論

我國地域廣闊，擁有豐富的菊科植物資源，為我們對(duì)菊科植物進(jìn)行深入研究提供了豐富的物質(zhì)資源。而天名精屬植物由于其化學(xué)成分多樣性與藥用價(jià)值高等特點(diǎn)，一直是天然產(chǎn)物的研究熱點(diǎn)。

目前，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)天名精石油醚部位的化學(xué)成分及藥理作用研究相對(duì)較少。為進(jìn)一步明確該植物化學(xué)資源，我們對(duì)其化學(xué)成分展開了系統(tǒng)研究，從該植物中首次分離得到9個(gè)化合物(包括5個(gè)薄荷烷型單萜、3個(gè)無內(nèi)酯環(huán)倍半萜、1個(gè)降倍半萜內(nèi)酯)，化合物3～8為首次從該屬植物分離得到。采用MTS法評(píng)價(jià)上述化合物的抗腫瘤活性，結(jié)果表明單萜類化合物和倍半萜類化合物均具有一定的細(xì)胞毒活性。其中，首次發(fā)現(xiàn)化合物4、8對(duì)白血病(HL60)、肺癌(A549)、肝癌(SMMC7721)、乳腺癌(MCF7)以及結(jié)腸癌(SW480)這五株人腫瘤細(xì)胞的增殖具有弱的抑制作用；同樣化合物9也表現(xiàn)出弱的抑制作用，與前人研究結(jié)果基本一致[17-19]。此外，首次發(fā)現(xiàn)化合物2對(duì)MCF7、SW480兩株癌細(xì)胞的增殖具有較明顯的抑制作用，濃度為40 μM時(shí)其抑制率分別為72%和81%；根據(jù)初步的構(gòu)效關(guān)系分析，薄荷烷型單萜類化合物9位的羥基可能是活性增效基團(tuán)。本文首次揭示了天名精中抑制乳腺癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞的活性成分，為天名精資源進(jìn)一步的藥物開發(fā)與利用奠定了基礎(chǔ)。