李曉潔，李豐名，徐良雄，李 玲*，彭永宏,*

1華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510631；2惠州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，惠州 516007

病原真菌侵染是導(dǎo)致采后果蔬腐爛的主要原因之一[1]，不僅造成重大經(jīng)濟(jì)損失，部分真菌還會(huì)產(chǎn)生真菌毒素，對(duì)人的生命安全造成潛在威脅[2]?？拐婢鷦┑氖褂每梢源蟠笠种撇珊蠊卟『Φ陌l(fā)生和發(fā)展[3,4]，然而，越來越多的研究和實(shí)踐表明殺菌劑的大規(guī)模長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致病原菌耐藥性增強(qiáng)[5]。同時(shí)，隨著人們對(duì)健康和環(huán)保的意識(shí)不斷提高，更安全、低毒和低殘留的新型天然抗真菌劑的研發(fā)越來越受到關(guān)注[6]。

鐮刀菌屬真菌是一類廣泛分布的真菌，既可產(chǎn)伏馬霉素、T-2毒素等真菌毒素，也可產(chǎn)生物堿、肽、酰胺、萜類、醌類和吡喃酮類等結(jié)構(gòu)多樣且具潛在藥用價(jià)值的代謝產(chǎn)物[7]。在前期植物內(nèi)生菌的抗菌活性篩選中，發(fā)現(xiàn)一株植物內(nèi)生鐮刀菌Fusariumsp.HU0174大米發(fā)酵物對(duì)柑橘綠霉拮抗活性較好。為此，采用天然產(chǎn)物化學(xué)方法對(duì)該菌大米發(fā)酵物中的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離、鑒定和抗真菌活性評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 菌種

鐮刀菌Fusariumsp.HU0174由惠州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院徐良雄副研究員等于2018年5月分離自惠州市惠東縣黃埠圩附近的樸樹(CeltissinensisPers.)枝條，經(jīng)ITS測(cè)序比對(duì)和形態(tài)觀察鑒定為鐮刀菌屬(Fusariumsp.)真菌，現(xiàn)保藏于惠州學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室菌種庫(kù)。植物病原菌柑橘綠霉(Penicilliumdigitatum)和新月彎孢霉(Curvularialunata)由中國(guó)科學(xué)院華南植物園段學(xué)武研究員贈(zèng)予，黑曲霉(Aspergillusniger)和黃曲霉(A.flavus)由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定。

1.2 儀器和試劑

YMP200中壓快速純化制備系統(tǒng)(天津博納艾杰爾公司)；LC-16P高效液相色譜儀和LC-MS-8040電噴霧質(zhì)譜儀(日本Shimadzu公司)；Quantum-I核磁共振波譜儀(武漢中科牛津波譜公司)；Bio TOF IIIQ高分辨質(zhì)譜儀(德國(guó)Bruker公司)；IP-digi300/3+數(shù)字全自動(dòng)旋光儀(上海儀邁儀器科技有限公司)。甲醇等分析純?cè)噭?天津大茂化學(xué)試劑廠)；核磁用氘代試劑(美國(guó)劍橋公司)；柱層析硅膠(青島基億達(dá)硅膠試劑有限公司)；C18反相硅膠(日本富士硅化學(xué)株式會(huì)社)；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(瑞典Amersham Biosciences公司)?？拐婢鷦┌倏傻?40%)(江蘇龍燈化學(xué)有限公司)。

1.3 菌株的發(fā)酵

挑取活化好的菌株菌絲于3 mL PDB培養(yǎng)基，28 ℃、150 rpm培養(yǎng)3天，制得一級(jí)種子液；取2 mL一級(jí)種子液轉(zhuǎn)移至200 mL PDB培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)3天，制得二級(jí)種子液；取5 mL二級(jí)種子液均勻接種于大米固體培養(yǎng)基(含60 g大米和60 g自來水)，28 ℃黑暗靜置培養(yǎng)56天。

1.4 提取與分離

發(fā)酵物以95%乙醇浸提3次，提取液過濾后濃縮除去乙醇后分別以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取。經(jīng)抗柑橘綠霉活性評(píng)價(jià)后，在活性追蹤的指導(dǎo)下對(duì)具活性的乙酸乙酯萃取部位的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離和純化。所得乙酸乙酯部(81.2 g)進(jìn)行正相硅膠(100～200目)柱層析，石油醚-丙酮(100∶0→50∶50)梯度洗脫得流份Fr.1～12。流份Fr.4經(jīng)HPLC純化，60%甲醇水洗脫得化合物6(32.6 mg，tR= 19.4 min)。流份Fr.8經(jīng)中壓反相硅膠柱層析，甲醇-水(40%→90%)梯度洗脫得流份Fr.8-1～ Fr.8-20。流份Fr.8-4經(jīng)HPLC純化，50%甲醇水洗脫得化合物7(9.4 mg，tR= 12.0 min)；流份Fr.8-20經(jīng)HPLC純化，80%甲醇水洗脫得化合物2(12.6 mg，tR= 67.0 min)和5(6.9 mg，tR= 44.0 min)。流份Fr.9經(jīng)大孔吸附樹脂柱層析，40%、60%和90%乙醇-水依次洗脫，得到流份Fr.9-1～6。流份Fr.9-5經(jīng)HPLC純化，82%甲醇水洗脫得到化合物3(7.4 mg，tR= 37.2 min)、4(3.8 mg，tR= 30.4 min)和1(6.5 mg，tR= 19.0 min)。

1.5 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

單體化合物以氘代溶劑溶解，采集其核磁共振數(shù)據(jù)；以色譜甲醇溶解，直接進(jìn)樣采集其電噴霧質(zhì)譜數(shù)據(jù)。通過綜合分析其波譜數(shù)據(jù)并比對(duì)文獻(xiàn)，鑒定化合物結(jié)構(gòu)。

1.6 抗真菌活性測(cè)試

采用濾紙片瓊脂擴(kuò)散法評(píng)價(jià)單體化合物的抗真菌活性。測(cè)試真菌孢子以無菌水稀釋至約1×106個(gè)/mL，均勻涂布于PDA培養(yǎng)基上；化合物以甲醇溶解后加至濾紙片上，每濾紙片載樣量為200 μg，以百可得為陽(yáng)性對(duì)照，載樣量分別為0.30、0.15、0.078、0.039 μg，甲醇為陰性對(duì)照。定期觀察測(cè)試菌生長(zhǎng)情況，并測(cè)量抑菌圈半徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

HR-ESI-MS結(jié)果顯示該化合物的分子式為C43H69O11N7。其13C NMR譜(氘代甲醇為溶劑)檢測(cè)到43個(gè)碳信號(hào)，其中包括8個(gè)酯羰基碳信號(hào)(δC177.7、176.0、175.3、174.1、173.4、173.2、173.0、172.1)；6個(gè)鄰位或?qū)ξ蝗〈江h(huán)的碳信號(hào)[δC157.4、131.4(2C)、128.7、116.3(2C)]；8個(gè)連氧或氮的碳信號(hào)(δC77.4、68.3、60.2、59.7、55.8、55.0、51.6、51.1)。1H NMR譜顯示該化合物存在對(duì)位取代苯環(huán)上質(zhì)子信號(hào)[δH7.04(2H，d，J= 8.6 Hz)、6.70(2H，d，J= 8.6 Hz)]；存在8個(gè)連在雜原子上的質(zhì)子信號(hào)[δH4.83(1H，m)，4.58(1H，t，J= 7.5 Hz)，4.33(1H，d，J= 7.4 Hz)，4.31(1H，d，J= 8.1 Hz)，4.22(1H，t，J= 6.6 Hz)，4.18(1H，d，J= 7.4 Hz)，4.14(1H，m)，3.85(1H，d，J= 8.4 Hz)]，7個(gè)甲基質(zhì)子信號(hào)[δH1.46(3H，d，J= 7.4 Hz)，1.42(3H，d，J= 6.9 Hz)，1.33(3H，s)，1.01(3H，d，J= 6.7 Hz)，0.92(3H，t，J= 6.5 Hz)，0.88(3H，d，J= 6.9 Hz)，0.84(3H，t，J= 7.4 Hz，3H)]，此外，在δH1.31～1.20存在12個(gè)長(zhǎng)鏈烷烴質(zhì)子信號(hào)。結(jié)合上述13C NMR譜和1H NMR譜分析結(jié)果，推測(cè)該化合物可能是由6個(gè)氨基酸與1個(gè)脂肪酸鏈組成的寡酯肽。環(huán)肽薄層層析特征顯色結(jié)果還顯示該化合物為環(huán)肽[8]。通過對(duì)比化合物1與同時(shí)分離自該菌的acuminatum B(3)的13C NMR譜數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，兩者氨基酸殘基和酯羰基相關(guān)碳信號(hào)基本一致，但化合物1在δC30.6附近比acuminatum B少2個(gè)碳信號(hào)，δH1.31～1.20區(qū)間中也少4個(gè)質(zhì)子信號(hào)，且HR-ESI-MS顯示其分子量比acuminatum B少28 Da。此外，采用氘代DMSO采集的1D NMR數(shù)據(jù)(見表1)和1H-1H COSY、HMBC相關(guān)譜(見圖2)進(jìn)一步驗(yàn)證了上述判斷，說明化合物1的酯基部分為3-羥基-4-甲基-十二烷酸(3-hydroxy-4-methyldodecanoic acid，HMDA)?；谄渑cacuminatums A～C(2～4)具有相同的生源，以及相近的比旋光度值，推測(cè)它們的立體構(gòu)型相同，化合物1化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示，是一個(gè)新的acuminatum類衍生物，命名為acuminatum D?；衔?的詳細(xì)結(jié)構(gòu)鑒定原始圖譜可從本刊官網(wǎng)免費(fèi)下載(www.trcw.ac.cn)。

圖1 化合物1～7的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds 1-7

圖2 化合物1的1H-1H COSY和關(guān)鍵HMBC相關(guān)Fig.2 1H-1H COSY and key HMBC correlations of compound 1

表1 化合物1的1H(400 MHz)和13C(100 MHz)NMR數(shù)據(jù)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

922[M+Cl]-。1H NMR(400 MHz，CD3OD)：D-allo-Thr：δ4.30(1H，d，J= 8.0 Hz，H-2)，4.16(1H，m，H-3)，1.29(3H，d，J= 6.3 Hz，H-4)；L-Ala-1：δ4.35(1H，q，J= 7.0 Hz，H-2)，1.40(3H，d，J= 7.0 Hz，H-3)；D-Ala-2：δ4.15(1H，q，J= 7.3 Hz，H-2)，1.44(3H，d，J= 7.3 Hz，H-3)；L-Gln：δ4.21(1H，t，J= 7.6 Hz，H-2)，2.22(2H，m，H-4)，2.05(2H，m，H-3)；D-Tyr：δ7.02(2H，d，J= 8.5 Hz，H-5，9)，6.68(2H，d，J= 8.5 Hz，H-6，8)，4.55(1H，t，J= 7.6 Hz，H-2)，2.98(1H，dd，J= 13.6，7.6 Hz，H-3)，2.90(1H，dd，J= 13.6，7.6 Hz，H-3)；L-Leu：δ4.30(1H，d，J= 8.0 Hz，H-2)，1.76(2H，m，H-3)，1.44(1H，m，H-4)，0.90(3H，d，J= 6.4 Hz，H-5)，0.83(3H，d，J= 6.9 Hz，4-CH3)；HMTA：δ4.77(1H，m，H-3)，2.59(1H，m，H-2)，2.53(1H，m，H-2)，1.77(1H，m，H-4)，1.59(1H，m，H-5)，1.27～1.23(16H，m，H-6～13)，1.10(1H，m，H-5)，0.98(3H，d，J= 6.8 Hz，4-CH3)，0.89(3H，t，J= 7.1 Hz，H-14)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)：D-allo-Thr：δ173.2(C-1)，68.4(C-3)，60.4(C-2)，20.9(C-4)；L-Ala-1：δ176.0(C-1)，51.1(C-2)，17.6(C-3)；L-Ala-2：δ175.3(C-1)，51.6(C-2)，17.1(C-3)；L-Gln：δ177.8(CONH2)，173.8(C-1)，54.9(C-2)，32.7(C-4)，27.8(C-3)；D-Tyr：δ174.0(C-1)，157.3(C-7)，131.4(C-5，9)，128.7(C-4)，116.2(C-6，8)，55.7(C-2)，38.5(C-3)；L-Leu：δ172.9(C-1)，53.5(C-2)，40.7(C-3)，25.7(C-4)，23.0(4-CH3)，22.5(C-5)；HMTA：δ172.0(C-1)，77.4(C-3)，39.4(C-2)，36.1(C-4)，33.5(C-5)，33.1(C-12)，30.9(C-7)，30.8(C-8)，30.8(C-9)，30.7(C-10)，30.5(C-11)，27.2(C-6)，23.7(C-13)，16.0(4-CH3)，14.4(C-14)。對(duì)比文獻(xiàn)[9-12]，化合物2鑒定為acuminatum A。

化合物5白色粉末；ESI-MS：m/z784[M+H]+，806[M+Na]+，782[M-H]-。1H NMR(400 MHz，CD3OD)Me Phe-1/2/3：δ7.27(4H，d，J= 4.2 Hz，H-5，6，8，9)，7.20(1H，dt，J= 8.4，4.2 Hz，H-7)，5.80(1H，dd，J= 12.8，4.6 Hz，H-2)，3.41(1H，dd，J= 14.9，4.6 Hz，H-3)，3.16(3H，s，H-10)，3.06(1H，dd，J= 14.9，12.8 Hz，H-3)，Leu-1/2/3：δ4.87(1H，m，H-2′)，1.81(1H，m，H-3′)，0.86(3H，d，J= 6.7 Hz，H-4′)，0.29(3H，d，J= 6.7 Hz，H-5′)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)：Me Phe-1/2/3：δ173.2(C-1)，138.0(C-4)，129.8(C-5、6、8、9)，128.0(C-1)，57.9(C-2)，35.4(C-3)，31.2(C-10)。對(duì)比文獻(xiàn)[15]，化合物5鑒定為白僵菌素。

化合物6白色固體；ESI-MS：m/z262[M+H]+，284[M+Na]+，260[M-H]-，557[2M+Cl]-。1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ7.33(1H，m，H-14)，7.33(1H，m，H-15)，7.32(1H，m，H-13)，7.14(1H，d，J= 3.4 Hz，H-16)，7.13(1H，d，J= 2.3 Hz，H-12)，4.40(1H，t，J= 4.5 Hz，H-3)，3.28(1H，dd，J= 18.6，4.5 Hz，H-10)，3.20(1H，dd，J= 18.6，4.5 Hz，H-10)，3.02(3H，s，H-17)，2.97(3H，d，J= 2.2 Hz，H-6)，2.31(1H，m，H-7)，0.85(1H，d，J= 7.1 Hz，H-8)，0.77(1H，d，J= 6.5 Hz，H-9)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ167.4(C-2)，165.7(C-5)，134.3(C-11)，129.9(C-12)，129.9(C-16)，129.4(C-13)，129.4(C-15)，128.3(C-14)，81.4(C-6)，62.9(C-3)，37.2(C-10)，32.6(C-17)，29.8(C-7)，18.7(C-8)，15.3(C-9)。對(duì)比文獻(xiàn)[16]，化合物6鑒定為白僵菌酮。

化合物7黃色粉末；ESI-MS：m/z160[M-H]-。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：8.06(1H，dd，J=7.1，1.7 Hz，H-4)，7.94(1H，s，H-2)，7.43(1H，dd，J= 7.1，1.6 Hz，H-7)，7.17(1H，dd，J= 7.1，1.4 Hz，H-5)，7.17(1H，dd，J= 7.1，1.4 Hz，H-6)；13C NMR：(100 MHz，CD3OD)δ：169.3(C-8)，138.2(C-7a)，133.4(C-2)，127.6(C-3a)，123.6(C-6)，122.3(C-5)，122.0(C-4)，112.9(C-7)，108.8(C-3)。對(duì)比文獻(xiàn)[17]，化合物7鑒定為吲哚-3-羧酸。

2.2 抗真菌活性

濾紙片瓊脂擴(kuò)散法評(píng)價(jià)結(jié)果顯示(見表2)，載樣量為200 μg時(shí)，化合物acuminatums A～D(1～4)對(duì)柑橘綠霉和新月彎孢霉顯示出較強(qiáng)的抑制效果，而對(duì)黑曲霉和黃曲霉無明顯抑制活性，其余化合物對(duì)所有測(cè)試的真菌均無明顯抑制作用。

表2 化合物1～4的抗真菌活性(抑菌圈半徑，mm)

3 討論

環(huán)肽類微生物源抗真菌劑具有易降解、低殘留的特點(diǎn)，其中納他霉素(natamycin)已經(jīng)作為天然抑菌劑在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)廣泛應(yīng)用食品領(lǐng)域。環(huán)酯肽類化合物具有抗菌、抗腫瘤等生物活性[18]，越來越引起人們的廣泛關(guān)注。環(huán)酯肽類化合物在抗細(xì)菌活性方面研究較為成熟，有些已經(jīng)用于臨床，其中包括抗生素粘菌素(colistin)和達(dá)托霉素(daptomycin)可分別用于治療多重耐藥性革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌引起是疾病[19,20]。在抗真菌活性方面研究相對(duì)較少，其中包括clavariopsins A和B對(duì)白色念珠菌、煙曲霉和黑曲霉表現(xiàn)出抑制作用，MIC值分別為8、4和16 μg/mL[20,21]；verlamelins A和B對(duì)芒果炭疽病菌表現(xiàn)較強(qiáng)的抑制作用，其MIC值分別為4.9和9.8 μg/mL[22]。有研究表明acuminatum B、C對(duì)蘋果黑星菌、蘋果鏈核盤菌和水稻旋胞腔菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的拮抗活性[13]，且表現(xiàn)出相同的MIC值，分別為1、1、10 μg/mL，同時(shí)acuminatum B同系物fusaripeptide A對(duì)白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌以及煙曲霉都表現(xiàn)很強(qiáng)的抑制作用，IC50為0.11～0.24 μM，略低于兩性霉素B[23]。

本研究從樸樹內(nèi)生鐮刀菌Fusariumsp.HU0174大米發(fā)酵物的乙酸乙酯部位分離鑒定了7個(gè)化合物，包括5個(gè)環(huán)酯肽和2個(gè)雜環(huán)類化合物，其中化合物1為新化合物，豐富了鐮刀菌次生代謝產(chǎn)物的多樣性?？拐婢钚越Y(jié)果顯示，環(huán)酯肽類化合物acuminatum A～D(1～4)在200 μg時(shí)對(duì)柑橘綠霉和新月彎孢霉有抑制作用，但是對(duì)黑曲霉和黃曲霉均無抑制活性，說明化合物acuminatum類環(huán)酯肽的真菌拮抗活性具有較強(qiáng)的特異性，初步闡明了鐮刀菌Fusariumsp.HU0174的抗真菌活性物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)新型微生物源的抗真菌劑的研發(fā)具有一定的參考價(jià)值。