董 琦，譚 亮，胡 娜,2，王洪倫,2*

1中國科學(xué)院西北高原生物研究所 中國科學(xué)院藏藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2青海省藏藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810008；3中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū)，是印加土著居民的主要傳統(tǒng)食物，具有5 000～7 000多年的食用和種植歷史[1]。藜麥具有豐富的營養(yǎng)價值，其富含總酚與黃酮醇，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)及抗癌活性[2,3]。20世紀(jì)60年代初，我國開始引進(jìn)藜麥資源。近幾年來，我國藜麥種植面積迅速擴(kuò)大，2019年全國藜麥種植面積估計超過2萬hm2，總產(chǎn)量可達(dá)到2～3萬噸[4]。藜麥麩皮(即藜麥的外種皮)中含有大量三萜皂苷，但皂苷味苦。食用藜麥之前常通過水洗或者研磨去除[5]，所以藜麥實(shí)際生產(chǎn)加工過程中會產(chǎn)生大量的藜麥麩皮，但目前對藜麥麩皮的利用僅是簡單加工處理用作飼料[6]，如果可以利用藜麥麩皮，就能提高藜麥的綜合利用價值。三萜皂苷具有抗炎、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化和抗糖尿病等活性[7,8]，除此之外，已有文獻(xiàn)報道藜麥麩皮中白蛋白具有抗氧化和ACE抑制活性[9]，其50%乙醇提取物通過激活抗氧化酶系統(tǒng)和阻斷TGF-β1途徑對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝損傷和纖維化具有保護(hù)作用[10]，同時有研究發(fā)現(xiàn)未加工藜麥中的多酚及皂苷提取物對α-葡萄糖苷酶均具有較高的抑制活性[11]。

目前有關(guān)藜麥麩皮總皂苷的超聲提取工藝尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。本實(shí)驗(yàn)以藜麥麩皮為實(shí)驗(yàn)材料，對超聲提取總皂苷的工藝進(jìn)行優(yōu)化。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇液料比、乙醇濃度、超聲時間和超聲溫度為自變量，以藜麥麩皮總皂苷的提取得率作為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到藜麥麩皮總皂苷的超聲提取最佳工藝。本實(shí)驗(yàn)同時考察了最佳提取工藝條件下提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。同時建立酶反應(yīng)動力學(xué)方程對其抑制動力學(xué)進(jìn)行分析，探討了藜麥麩皮提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)制，從而挖掘藜麥麩皮作為α-葡萄糖苷酶抑制劑的開發(fā)潛力，為藜麥麩皮的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

藜麥麩皮，粉末狀，是由白藜麥機(jī)械脫去的麩皮制得(由青海博基生物技術(shù)有限公司提供)。

α-葡萄糖苷酶(G5003，100UN，來源于酵母，美國Sigma公司)；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG，阿拉丁試劑(上海)有限公司)；阿卡波糖及齊墩果酸對照品(上海源葉科技有限公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-100B型超聲波清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)；EPOCH2型酶標(biāo)儀(BioTek公司)；BE-9010型恒溫振蕩器(THOMMO SHAKER)；Cary 300Bio型紫外-可見分光光度計(美國安捷倫公司)。

1.3 方法

1.3.1 總皂苷含量的測定

采用比色法測定總皂苷的含量[12]，并在此基礎(chǔ)上略做改動。準(zhǔn)確移取0.20 mL樣品溶液于10 mL具塞試管中，置于70 ℃水浴上揮去溶劑，分別依次加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，搖勻，置于60 ℃水浴加熱15 min，取出后立即用冷水冷卻數(shù)分鐘，加入4 mL乙酸乙酯，搖勻，以不加標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液的平行樣為空白，在560 nm下測定吸光值，重復(fù)3次，以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，得回歸方程為y= 11.892x+ 0.070 9，r= 0.999 6，結(jié)果顯示質(zhì)量在0.010 8～0.108 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算溶液中皂苷的濃度，然后根據(jù)公式計算出樣品中總皂苷的提取得率，按式(1)計算：

(1)

其中，C：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算溶液中總皂苷的質(zhì)量濃度(mg/mL)；d：稀釋倍數(shù)；V：定容體積(mL)；M：稱取的樣品質(zhì)量(g)。

1.3.2 藜麥麩皮皂苷提取工藝優(yōu)化

1.3.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取1.0 g藜麥麩皮粉末，選擇液料比、乙醇濃度、超聲時間和超聲溫度四個因素，以其中一項(xiàng)因素改變時，其他因素不變進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。各單因素變量分別是：液料比(5、10、15、20、25 mL/g)、乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%)，超聲時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)和超聲溫度(40、50、60、70、80 ℃)，提取次數(shù)均為3次。

1.3.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取液料比(A)、乙醇濃度(B)、超聲時間(C)和超聲溫度(D)為考察因素，以總皂苷提取得率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法進(jìn)行Box-Behnken中心組合設(shè)計，用Design Expert 8.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，進(jìn)而優(yōu)化藜麥麩皮總皂苷的提取工藝。

1.3.3α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

將藜麥麩皮總皂苷提取物配制成不同濃度的樣品溶液。采用參考文獻(xiàn)[13]方法并作適當(dāng)調(diào)整，以基于pNPG的體外評價模型進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)分為空白組、空白對照組、樣品空白組和樣品組，各反應(yīng)物在96孔板中加樣20 μL，每組3個平行，分別加入80 μL 0.1 mmol/L 磷酸緩沖溶液(pH6.8)，空白對照組和樣品空白組加入50 μL 0.1 mmol/L 磷酸緩沖溶液(pH6.8)，其他各組加入50 μLα-葡萄糖苷酶磷酸緩沖溶液(1 U/mL)，在恒溫振蕩器中37 ℃保溫30 min后取出，加入50 μL 0.5 mmol/L pNPG溶液，充分混勻，于37 ℃水浴反應(yīng)20 min，結(jié)束后加入50 μL 0.1 mol/L的Na2CO3溶液中止反應(yīng)。在405 nm處測定吸光值，根據(jù)式(2)計算出各樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率。以阿卡波糖為陽性對照，繪制藥物濃度與對酶的抑制率的關(guān)系曲線，求出相應(yīng)的IC50值。

(2)

其中，AC：空白組吸光值；AB：空白對照組吸光值；AS：樣品組吸光值；ASB：樣品空白組吸光值。

1.3.4α-葡萄糖苷酶抑制的抑制動力學(xué)分析

按照“1.3.3”方法分別測定不同濃度藜麥麩皮總皂苷提取物與酶濃度分別為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 U/mL時反應(yīng)的初速度，底物最終濃度為0.5 mmol/L，每個濃度做3個平行孔，以酶濃度[E](U/mL)為橫坐標(biāo)，反應(yīng)初速度ν(ΔOD/min)為縱坐標(biāo)作圖，利用圖的特征推斷酶的結(jié)合方式。藜麥麩皮總皂苷提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制類型由Linewaver-Burk方法確定[14]。配制不同濃度的藜麥麩皮總皂苷提取物，與濃度分別為0.125、0.25、0.5、1.0、2.5 mmol/L的底物溶液，混勻，加入1 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液，測定α-葡萄糖苷酶抑制的反應(yīng)速率V。按Lineweave-Burk方程，以底物濃度的倒數(shù)1/[S]為橫坐標(biāo)，1/V為縱坐標(biāo)繪制抑制作用動力學(xué)曲線，確定抑制類型。

1.3.5 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 液料比對提取得率的影響

改變液料比，而其他參數(shù)不變，探討液料比對藜麥麩皮總皂苷提取得率的影響。結(jié)果如圖1A所示。從圖中可以看出，在液料比為15 mL/g時總皂苷的提取得率達(dá)到最高。因此，選擇液料比為5、15、25 mL/g為響應(yīng)面設(shè)計的三個水平。

2.1.2 乙醇濃度對提取得率的影響

改變乙醇濃度，而其他參數(shù)不變，探討乙醇濃度對藜麥麩皮總皂苷提取得率的影響。結(jié)果如圖1B所示。從圖中可以看出，在乙醇濃度為80%時總皂苷的提取得率達(dá)到最高，而后隨著乙醇濃度的增加總皂苷提取得率有所降低。因此，選擇乙醇濃度為60%、80%、100%為響應(yīng)面設(shè)計的三個水平。

圖1 液料比(A)、乙醇濃度(B)、超聲時間(C)、超聲溫度(D)對藜麥麩皮皂苷提取得率的影響Fig.1 Effects of liquid-solid ratio (A),concentration of ethanol (B),ultrasonic time (C),ultrasonic temperature (D) on saponin extraction yield of quinoa bran

2.1.3 超聲時間對提取得率的影響

改變超聲時間，而其他參數(shù)不變，從而探討超聲時間對藜麥麩皮總皂苷提取得率的影響。結(jié)果如圖1C所示。從圖中可以看出，在超聲時間為1.5 h時總皂苷的提取得率達(dá)到最高，而后隨著超聲時間的增加總皂苷提取得率有所降低。因此，超聲時間為1.0、1.5、2.0 h為響應(yīng)面設(shè)計的三個水平。

2.1.4 超聲溫度對提取得率的影響

改變超聲溫度，而其他參數(shù)不變，從而探討超聲溫度對藜麥麩皮總皂苷提取得率的影響。結(jié)果如圖1D所示。從圖中可以看出，在超聲溫度為60 ℃時總皂苷的提取得率達(dá)到最高，而后隨著超聲溫度的增加總皂苷提取得率逐漸降低。因此，超聲溫度為40、60、80 ℃為響應(yīng)面設(shè)計的三個水平。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼如表1所示，以總皂苷提取得率為響應(yīng)值(Y)，響應(yīng)面設(shè)計方案及結(jié)果如表2所示。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平表

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

利用Design Expert 8.0.6 軟件對表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，獲得響應(yīng)面方差分析及顯著性結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面方差分析

因素交互作用對藜麥麩皮總皂苷提取得率的影響見圖2。以藜麥麩皮總皂苷提取得率為響應(yīng)值(Y)，得到總皂苷提取量對各影響因素的二次多項(xiàng)式回歸模型為：Y=2.20+0.071×A-0.14×B+0.094×C-0.38×D-0.060×AB+0.010×AC+ 0.072×AD-0.080×BC+0.027×BD-0.062×CD-0.33×A2-0.51×B2-0.44×C2-0.29×D2。

圖2 因素交互作用對藜麥麩皮總皂苷提取得率的影響Fig.2 Factors interaction effects on total saponins extraction yield from quinoa bran

經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析可知，該實(shí)驗(yàn)選用的模型極顯著(P<0.01)，表明模型選擇合適；失擬項(xiàng)P>0.05，說明該模型擬合度好。根據(jù)表3顯示，在此實(shí)驗(yàn)設(shè)計中，超聲溫度(D)對藜麥麩皮總皂苷提取得率的影響達(dá)到了極顯著水平(P< 0.01)。從顯著性檢驗(yàn)P值的大小可以得到各因素對藜麥麩皮總皂苷提取得率影響的順序?yàn)槌暅囟?D)> 乙醇濃度(B)> 超聲時間(C)>液料比(A)。

通過回歸模型求解方程，得到最佳的提取條件為：液料比15.52 mL/g，76.62%乙醇超聲提取，超聲時間1.59 h，超聲溫度46.46 ℃。結(jié)合到實(shí)際操作的局限性，對該條件進(jìn)一步的完善，即液料比15 mL/g，75%乙醇超聲提取，超聲時間1.5 h，超聲溫度45 ℃。經(jīng)過3次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，得到總皂苷提取得率為2.37% ± 0.022%，與預(yù)測值2.35%的相對誤差為0.85%，說明實(shí)際結(jié)果與預(yù)測值比較差異性較小，表明此響應(yīng)面法得到的回歸模型具有較好的可靠性。

2.3 藜麥麩皮提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

采用優(yōu)化后的提取工藝得到的藜麥麩皮總皂苷提取物，對α-葡萄糖苷酶抑制作用結(jié)果見圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，總皂苷提取物的抑制作用明顯強(qiáng)于陽性藥阿卡波糖(P< 0.05)，其IC50值分別為0.620 ± 0.057 mg/mL和0.851 ± 0.053 mg/mL。推測藜麥麩皮中皂苷類化合物可能是其發(fā)揮酶抑制作用的主要活性成分。已有研究表明藜麥麩皮中的黃酮和酚類物質(zhì)具有抑制糖苷酶作用[15]。而藜麥麩皮中皂苷類物質(zhì)對葡萄糖苷酶的抑制作用未見文獻(xiàn)報道，有望從其中分離得到安全、有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑。

圖3 總皂苷提取物(A)和阿卡波糖(B)對α-葡萄糖苷酶抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of total saponins extract (A) and acarbose (B) on the activity of α-glucosidase

2.4 藜麥麩皮總皂苷提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)制分析

在不同提取物濃度的存在下，改變酶的濃度，通過剩余酶活力對不同濃度的酶作圖得到一組直線(圖4)。所有的直線有很好的線性關(guān)系，且都經(jīng)過原點(diǎn)。另外，隨著提取物濃度的增加，直線的斜率在減小，說明藜麥麩皮提取物濃度的存在，沒有改變酶的數(shù)量，而是降低了酶的活性。因此，藜麥麩皮總皂苷提取物對α-葡糖糖苷酶的抑制作用是可逆的。

圖4 藜麥麩皮總皂苷提取物酶濃度與反應(yīng)初速率圖Fig.4 Relationship between enzyme concentration and initial reaction velocity of total saponins extract from quinoa bran

2.5 藜麥麩皮總皂苷提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學(xué)研究

為了評估總皂苷提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)制，進(jìn)行了酶動力學(xué)研究。按 Lineweaver-Burk雙倒曲線作圖法，分別作出藜麥麩皮總皂苷提取物和阿卡波糖酶抑制動力學(xué)曲線，確定抑制類型和抑制常數(shù)。如圖5和6所示，結(jié)果顯示總皂苷提取物濃度越大，直線斜率越大，而所有直線相交于第一象限，說明藜麥麩皮總皂苷提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用屬于混合競爭性抑制。而阿卡波糖所有直線與Y軸幾乎相交于一點(diǎn)，說明阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶屬于競爭性抑制，這與文獻(xiàn)報道一致[13]。

圖5 藜麥麩皮總皂苷提取物的Lineweaver-Burk雙倒曲線Fig.5 Lineweaver-Burk plot of total saponins extract from quinoa bran

圖6 阿卡波糖Lineweaver-Burk雙倒曲線Fig.6 Lineweaver-Burk plot of acarbose

3 結(jié)論

本文采用響應(yīng)面法優(yōu)化了藜麥麩皮超聲提取皂苷的最佳工藝為液料比15 mL/g，75%乙醇超聲提取，超聲時間1.5 h，超聲溫度45 ℃，得到總皂苷提取得率為2.370% ± 0.022%。該工藝條件簡單，操作控制容易，穩(wěn)定性好，克服了常規(guī)方法提取時間長需要加熱處理操作步驟繁瑣等缺點(diǎn)。

α-葡萄糖苷酶抑制活性實(shí)驗(yàn)表明，藜麥麩皮總皂苷提取物抑制活性明顯強(qiáng)于市售α-葡萄糖苷酶抑制劑阿卡波糖(P< 0.05) ，有望從其中分離得到安全、有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑。抑制機(jī)制和酶動力學(xué)研究表明，藜麥麩皮總皂苷提取物是一種可逆的混合性抑制類型，這為明確藜麥麩皮提取物的降低餐后血糖作用機(jī)制提供了參考，為其高值化利用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。此外，藜麥麩皮對α-葡萄糖苷酶抑制作用的活性物質(zhì)基礎(chǔ)以及體內(nèi)活性等可以通過分離制備和相關(guān)的動物模型的建立來進(jìn)一步研究。