王娟霞，譚有珍，郭明鑫，史可欣，吳 霞，馮毅凡

廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心，廣州 510006

隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，肥胖發(fā)生率不斷上升，目前這一問題已經(jīng)開始涉及發(fā)展中國家和第三世界國家，成為全球公共衛(wèi)生問題[1]。肥胖是一種機(jī)體脂肪組織積累過多的狀態(tài)，根據(jù)脂肪組織在體內(nèi)蓄積的部位不同分為脂肪型肥胖和腹型肥胖。研究發(fā)現(xiàn)肥胖患者內(nèi)臟脂肪組織中的巨噬細(xì)胞(ATMs)有明顯的浸潤現(xiàn)象和大量促炎細(xì)胞因子的表達(dá)[2]，這些細(xì)胞表型呈現(xiàn)出一種從M2轉(zhuǎn)變?yōu)镸1(炎性)的特殊狀態(tài)，此狀態(tài)會(huì)加速脂肪組織慢性炎癥的發(fā)生，并使ATMs內(nèi)的NLRP3表達(dá)增加，其表達(dá)增加會(huì)激活下游GDF3的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)MAOA等兒茶酚胺水解酶的水平[3]，最終引起脂肪組織中兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量減少，脂質(zhì)分解能力降低，產(chǎn)生脂肪蓄積，造成腹型肥胖。

知母總皂苷(saponins fromAnemarrhenaasphodeloidesBge.，SAa B)是從知母中提取分離出的含量最為豐富的有效成分[4]，具有降糖[5]、抗炎[6]、抗氧化[7]、抗血栓[8]、改善抑郁[9]等藥理活性。本課題組前期初步研究發(fā)現(xiàn)，SAa B對(duì)糖尿病大鼠具有降糖降脂等作用[10]，而糖尿病與肥胖、脂質(zhì)代謝有著密切的關(guān)系[11]，然而，SAa B對(duì)肥胖是否具有干預(yù)作用目前尚不清楚，缺乏藥理作用機(jī)制研究。因此，本研究通過高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6J雄性小鼠肥胖模型，考察SAa B對(duì)肥胖小鼠的干預(yù)作用及脂肪組織中相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，以期闡釋其調(diào)節(jié)肥胖的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6J雄性小鼠，48只，3周齡，體質(zhì)量18.0 ± 2.0 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2018-0002，飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(粵)2017-0125。本研究所涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，編號(hào)gdpulacspf2017156。

1.2 藥物與試劑

知母總皂苷粉末，實(shí)驗(yàn)室自制，含量大于80%；氯吉蘭(美國TargetMol公司，批號(hào)17780755)；60%脂肪熱量高脂飼料(美國Research Diets公司，批號(hào)D16492)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司，貨號(hào)#K1622)；SYBRGreen PCR試劑盒(貨號(hào)G3008)；BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)G2026);核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3,貨號(hào)GB15101);單胺氧化酶A(MAOA,貨號(hào)GB11026);β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體(貨號(hào)GB12001);辣根酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(貨號(hào)GB23303)均購自武漢Servicebio公司；試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器設(shè)備

ACCU-CHEK Performa血糖儀(德國Roche公司)；URIT-8021A全自動(dòng)生化分析儀(常州銳品精密儀器有限公司)；LCT-200小動(dòng)物CT儀(日本ALOCA公司)；D3024R臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)(中國DragonLab公司)；Stepone plus熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(美國Thermo公司)；Rt2100c酶標(biāo)檢測(cè)儀(美國Rayto公司)；DYCZ-24DN 雙垂直電泳儀，DYCZ-40D轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一儀器廠)；V300掃描儀(日本EPSON公司)；AlphaEaseFC灰度分析軟件(美國AlphaInnotech公司)；Adobe PhotoShop圖像分析軟件(美國Adobe公司)；Nikon Eclipse E100正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司)。

2 方法

2.1 肥胖模型建立及分組干預(yù)

48只雄性C57BL/6J小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組和實(shí)驗(yàn)組，正常組給予標(biāo)準(zhǔn)普通飼料，實(shí)驗(yàn)組給予高脂飼料，喂養(yǎng)7周，每天記錄小鼠體重。造模結(jié)束后，將肥胖模型復(fù)制成功[12,13]的小鼠隨機(jī)分為氯吉蘭組、知母總皂苷低、中、高劑量組(SAa B-L、SAa B-M、SAa B-H)和模型組，繼續(xù)給予高脂飼料，同時(shí)分別腹腔注射氯吉蘭3 mg/kg和SAa B 30、60、90 mg/kg，每日1次，正常組和模型組腹腔注射等體積生理鹽水，持續(xù)給藥7周。

2.2 肥胖小鼠相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

各組小鼠在實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，不禁水，尾靜脈采血，用血糖儀測(cè)定各組小鼠空腹血糖值。眼內(nèi)眥靜脈采血，低溫靜置10 min，于4 ℃條件下3 000 rpm離心15 min，取上層血清，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組小鼠血脂水平，測(cè)定步驟嚴(yán)格按總膽固醇(TC)，甘油三酯(TG)，高、低密度脂蛋白膽固醇(HDL-C、LDL-C)試劑盒說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用水合氯醛將各組小鼠麻醉后頸椎脫位處死，解剖采集腹部內(nèi)壁脂肪，冷生理鹽水洗凈，濾紙吸干后稱重。

2.3 小動(dòng)物CT活體影像技術(shù)(Micro CT)

給藥結(jié)束后，用水合氯醛麻醉小鼠，將麻醉后的各組小鼠裝入holder后放入小動(dòng)物CT儀，確定掃描視野，選擇掃描模式，進(jìn)行scout掃描，得到樣本的二維圖片，在二維圖片上選擇掃描范圍后，進(jìn)行CT掃描，掃描結(jié)束后瀏覽斷層圖片，選定ROI，用Latheta v3.61選擇脂肪進(jìn)行分析。

2.4 脂肪組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)

取各組小鼠脂肪組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，進(jìn)行脫水后石蠟包埋，切片，用蘇木素-伊紅(HE)染色，封片并在光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠脂肪組織病理形態(tài)學(xué)變化。

2.5 Real-time PCR檢測(cè)小鼠脂肪組織中GDF3、Caspase-1、IL-1β mRNA的表達(dá)

嚴(yán)格按照操作手冊(cè)，采用trizol提取各組小鼠脂肪組織中的RNA，使用Nanodrop 2000檢測(cè)RNA純度，以提取的mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，檢測(cè)生長分化因子3(GDF3)、天冬氨酸蛋白水解酶1(Caspase-1)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的相對(duì)表達(dá)量，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物運(yùn)用2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因的表達(dá)量。目的基因引物由武漢塞維爾生物科技有限公司合成，引物信息見表1。反應(yīng)體系為2×Taq MasterMix 12.5 μL，上游和下游引物各2.0 μL，cDNA2.5 μL，無RNA/DNA酶水8.0 μL。反應(yīng)條件為95 ℃維持10 min，95 ℃預(yù)變性15 s，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸34 s，重復(fù)循環(huán)40次。

表1 Real-time PCR引物序列

2.6 Western blot法檢測(cè)小鼠脂肪組織中NLRP3、MAOA蛋白表達(dá)

取各組小鼠脂肪組織，置于冰上破碎勻漿，加入RIPA蛋白裂解液充分裂解后15 000 rpm離心5 min，取上清并用BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)所需樣本體積，按4∶1比例加入蛋白上樣緩沖液，混勻后沸水浴變性15 min。配制分離膠和濃縮膠，用SDS-PAGE分離變性的蛋白，并轉(zhuǎn)移至PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后，1×TBST等滲緩沖溶液洗去奶粉溶液，按抗體說明書加入相應(yīng)的NLRP3、MAOA蛋白一抗(1∶1 000)，4 ℃條件下孵育過夜，1×TBST洗膜3次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗(1∶3 000)，室溫脫色搖床上搖動(dòng)封閉30 min，用化學(xué)發(fā)光試劑ECL發(fā)光液潤濕，將膠片掃描存檔并用Alpha軟件處理系統(tǒng)分析蛋白灰度值并計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 知母總皂苷對(duì)肥胖小鼠相關(guān)指標(biāo)的影響

與正常組比較，模型組小鼠給藥前體質(zhì)量和脂肪重量均明顯增高(P< 0.05)，表明高脂飼料長期喂養(yǎng)的小鼠產(chǎn)生肥胖，模型組末次給藥后小鼠體質(zhì)量較正常組明顯增高(P< 0.05)，表明實(shí)驗(yàn)過程中肥胖小鼠模型穩(wěn)定；與模型組比較，氯吉蘭組與SAa B三個(gè)劑量組末次給藥后小鼠體質(zhì)量明顯降低(P< 0.05)，氯吉蘭組與SAa B-M、SAa B-H組末次給藥后小鼠脂肪重量明顯降低(P< 0.05)(見表2)。

表2 知母總皂苷對(duì)肥胖小鼠體質(zhì)量和脂肪分布的影響

肥胖主要由于長期能量平衡失衡所致體內(nèi)脂肪異常分布或堆積過多，并伴隨血糖和血脂異常[14]。與正常組比較，模型組小鼠空腹血糖值、TC、TG、LDL-C水平均明顯升高(P< 0.05)，HDL-C水平明顯降低(P< 0.05)，表明肥胖小鼠體內(nèi)血糖、血脂代謝出現(xiàn)紊亂；與模型組比較，氯吉蘭組和SAa B-H組小鼠空腹血糖值明顯降低(P< 0.05)，氯吉蘭組和SAa B-M、SAa B-H組TC水平明顯降低(P< 0.05)，氯吉蘭組和SAa B三個(gè)劑量組TG，LDL-C水平均明顯降低(P< 0.05)，氯吉蘭組和SAa B-M、SAa B-H組HDL-C水平明顯升高(P< 0.05)(見表3)。

表3 知母總皂苷對(duì)肥胖小鼠空腹血糖、血脂水平的影響

3.2 知母總皂苷對(duì)肥胖小鼠腹部脂肪的影響

與正常組觀察比較，模型組小鼠下腹腔內(nèi)壁脂肪組織明顯增加(圖1中粉色部分)，氯吉蘭組與SAa B-M、SAa B-H組小鼠下腹腔內(nèi)壁脂肪組織減少(見圖1)。

圖1 小鼠下腹部CT橫截圖Fig.1 CT cross-sectional of lower abdomen of mice注：圖中白色為骨頭；藍(lán)色為肌肉組織；粉色為下腹腔內(nèi)壁脂肪組織；黃色為皮下脂肪。A：正常組；B：模型組；C：氯吉蘭組；D～F：知母總皂苷低、中、高劑量組；下同。Note:White is bone;Blue is muscle;Pink is adipose tissue lining the lower abdominal cavity;Yellow is subcutaneous fat.A:Control group;B:Model group;C:Clorgiline group;D-F:SAa B-L,SAa B-M,SAa B-H;The same below.

3.3 知母總皂苷對(duì)肥胖小鼠脂肪組織病理改善情況

正常組小鼠脂肪組織細(xì)胞排列緊密，大小均勻，未見明顯異常；模型組肥胖小鼠脂肪組織細(xì)胞大小不均勻，少量細(xì)胞胞質(zhì)斷裂，鄰近脂滴空泡融合成大空泡，提示脂肪組織細(xì)胞損傷；與模型組比較，氯吉蘭組和SAa B各劑量組肥胖小鼠脂肪組織細(xì)胞損傷均有不同程度的改善，脂肪空泡體積變小，其中SAa B-H組肥胖小鼠脂肪組織病理狀態(tài)改善程度明顯，表明SAa B能改善肥胖小鼠脂肪組織病理形態(tài)學(xué)變化(見圖2)。

圖2 知母總皂苷對(duì)肥胖小鼠脂肪組織病理學(xué)的影響(HE，×200)Fig.2 Effect of SAa B on adipose tissue histopathology of obese mice (HE,×200)

3.4 知母總皂苷對(duì)肥胖小鼠脂肪組織中GDF3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達(dá)的影響

各組小鼠脂肪組織中GDF3、Caspase-1和IL-1β的mRNA表達(dá)水平結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠脂肪組織中GDF3、Caspase-1和IL-1β的mRNA表達(dá)水平明顯升高(P< 0.05)；與模型組比較，氯吉蘭組和SAa B-M、SAa B-H組小鼠脂肪組織中GDF3mRNA表達(dá)水平明顯降低(P< 0.05)，氯吉蘭組和SAa B-H組小鼠脂肪組織中Caspase-1和IL-1βmRNA表達(dá)水平明顯降低(P< 0.05)，該結(jié)果表明SAa B-H可抑制肥胖小鼠脂肪組織中GDF3、Caspase-1和IL-1βmRNA的表達(dá)水平(見表4)。

表4 知母總皂苷對(duì)肥胖小鼠脂肪組織中GDF3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達(dá)的影響

3.5 知母總皂苷對(duì)肥胖小鼠脂肪組織中NLRP3、MAOA蛋白表達(dá)的影響

各組小鼠脂肪組織中NLRP3、MAOA蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠脂肪組織中NLRP3和MAOA蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，氯吉蘭組和SAa B-M、SAa B-H組小鼠脂肪組織中NLRP3蛋白表達(dá)水平明顯降低(P< 0.05)，氯吉蘭組和SAa B三個(gè)劑量組小鼠脂肪組織中MAOA蛋白表達(dá)水平明顯降低(P< 0.05)，且呈劑量依賴性，該結(jié)果表明SAa B-M、SAa B-H可抑制肥胖小鼠脂肪組織中NLRP3、MAOA蛋白的表達(dá)水平(見圖3)。

圖3 知母總皂苷對(duì)肥胖小鼠脂肪組織NLRP3、MAOA蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of SAa B on the expression levels of NLRP3,MAOA protein in adipose tissue of obese mice n =8)

4 討論

脂肪組織是機(jī)體的重要器官，其主要功能是儲(chǔ)存和分泌脂肪酸(FFAs)，平衡機(jī)體血糖和血脂，還會(huì)分泌各種激素和細(xì)胞因子，影響能量代謝，參與炎癥反應(yīng)[15,16]。研究表明，隨著年齡的增大，炎癥和胰島素抵抗發(fā)病率升高，從而引起脂肪組織機(jī)能衰退，產(chǎn)生腹部和內(nèi)臟周圍脂肪聚積，進(jìn)而導(dǎo)致腹型肥胖[17]。在本研究中長期高脂飲食引起小鼠體質(zhì)量增加，血糖、TC、TG、LDL-C升高，HDL-C降低，腹部周圍脂肪蓄積，造成腹型肥胖。

本課題組前期實(shí)驗(yàn)[18]及Fu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，SAa B可降低血漿中膽固醇及低密度脂蛋白水平，并具有降血糖的功效，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過SAa B干預(yù)肥胖小鼠模型發(fā)現(xiàn)，SAa B-H組肥胖小鼠的體質(zhì)量降低，腹部周圍脂肪減少，空腹血糖值和血清中TC、TG、LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，脂肪組織病理狀態(tài)改善，與上述研究結(jié)果一致。

大量脂肪蓄積會(huì)引起脂肪本身降解并且產(chǎn)生游離脂肪酸(FFAs)，產(chǎn)生的FFAs會(huì)刺激脂肪組織中的巨噬細(xì)胞生成神經(jīng)酰胺，誘導(dǎo)局部組織炎癥反應(yīng)，從而加快肥胖的發(fā)展[20-22]。NLRP3能夠調(diào)控機(jī)體慢性炎癥反應(yīng)[23]，其可被FFAs等代謝產(chǎn)物激活[24]，在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪組織中NLRP3、GDF3、Caspase-1表達(dá)水平上調(diào)，進(jìn)而上調(diào)兒茶酚胺類水解酶的表達(dá)和IL-1β水平，而兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，是體內(nèi)最重要的脂肪分解刺激激素[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，肥胖小鼠脂肪組織中GDF3、Caspase-1、IL-1β、NLRP3、MAOA的表達(dá)上調(diào)，在SAa B治療7周后，SAa B-M、SAa B-H組小鼠脂肪組織中GDF3mRNA表達(dá)水平降低，SAa B-H組小鼠脂肪組織中Caspase-1、IL-1βmRNA表達(dá)水平降低；SAa B-M、SAa B-H組小鼠脂肪組織中NLRP3蛋白表達(dá)水平降低，SAa B-L、SAa B-M、SAa B-H小鼠脂肪組織中MAOA蛋白表達(dá)水平降低，以上結(jié)果表明，SAa B能夠干預(yù)肥胖小鼠脂肪組織炎癥的發(fā)生，降低兒茶酚胺類水解酶的表達(dá)，進(jìn)而提高脂肪組織中兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平，改善脂類分解能力。

綜上所述，SAa B可以降低肥胖小鼠的體質(zhì)量和脂肪重量，改善肥胖引起的血糖血脂代謝紊亂和脂肪組織的病理狀態(tài)，能夠增強(qiáng)肥胖小鼠的脂質(zhì)分解能力，緩解肥胖癥狀，其作用機(jī)制可能是通過NLRP3-神經(jīng)遞質(zhì)通路抑制兒茶酚胺類水解酶的分泌和炎性因子表達(dá)，提高脂質(zhì)分解能力和減輕炎癥反應(yīng)，在后續(xù)的研究中可通過基因沉默、基因敲除等技術(shù)做進(jìn)一步驗(yàn)證，為中藥對(duì)肥胖癥的預(yù)防和治療提供新的理論依據(jù)。