牛衍龍，曹建民，王 禎，周海濤，張 靜，胡 戈，程鑫云，蔡博文

1贛南醫(yī)學(xué)院康復(fù)學(xué)院；2贛州市康復(fù)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，贛州 341000；3北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院，北京 100084；4北京聯(lián)合大學(xué)；5北京聯(lián)合大學(xué)生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101；6常州大學(xué)體育學(xué)院，常州 213164

心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)是心肌損傷后出現(xiàn)的以細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過度沉積、膠原成分比例失衡為特征的病理過程，與多種心臟疾病(心肌梗死、慢性心力衰竭、心房纖顫等)關(guān)系密切[1]。研究表明，過度的生理應(yīng)激可引發(fā)心肌組織炎癥反應(yīng)并導(dǎo)致心肌纖維化及心肌損傷[2]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)家族成員p38 MAPK，在病理或生理應(yīng)激下被激活后可通過磷酸化絲裂原和應(yīng)激蛋白激酶1(mitogen-and stress-activated protein kinase 1，MSK1)激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)[3]。NF-κB是炎癥反應(yīng)的主要調(diào)控因子，由同源與異源NF-κB/Rel蛋白二聚體構(gòu)成，活化后入核，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β，TGF-β1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)等促炎因子的表達(dá)，其中TGF-β1是機(jī)體肌肉組織纖維化主要誘導(dǎo)因子[4]。姜黃素是多年生植物姜黃中提取的生物活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗癌和神經(jīng)保護(hù)等多種生理和藥理活性[5]。課題組前期研究證實(shí)[6-8]，訓(xùn)練期間的姜黃素干預(yù)可以延緩和抑制過度運(yùn)動(dòng)應(yīng)激誘發(fā)的氧化應(yīng)激和運(yùn)動(dòng)性心肌損傷，同時(shí)可有效地抑制過度運(yùn)動(dòng)應(yīng)激誘發(fā)炎癥反應(yīng)，下調(diào)TGF-β1等促炎因子含量，改善運(yùn)動(dòng)性腎臟纖維化，保護(hù)腎臟功能/結(jié)構(gòu)。本研究采用6周遞增負(fù)荷跑臺(tái)訓(xùn)練建立長(zhǎng)時(shí)程、大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)致運(yùn)動(dòng)性臟器損傷動(dòng)物模型[9]，探究姜黃素通過調(diào)控p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白質(zhì)活化和表達(dá)，抑制心肌組織炎癥因子的合成，緩解長(zhǎng)時(shí)程、大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)所致心肌ECM過度沉積，進(jìn)而改善心肌纖維化的機(jī)制。

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

44只49天齡雄性SD大鼠，體重200～220 g，購(gòu)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，許可證編號(hào)：SCXK(京)2016-0010。標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境下飼養(yǎng)(溫度20～24 ℃，相對(duì)濕度50%～70%，晝夜交替各12 h)。基礎(chǔ)飼料由中華人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物飲用蒸餾水(不限制進(jìn)食量)。實(shí)驗(yàn)周期46天，遞增負(fù)荷訓(xùn)練42天。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

姜黃素(純度>99%，陜西源泰生物科技公司，批號(hào)：17012571)；羧甲基纖維素鈉(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；大鼠TGF-β1、TNF-α、IL-1β和心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponinc I，cTNI)ELISA試劑盒(美國(guó)Abcam公司，試劑盒批號(hào)：ab119558，ab100785，ab100768，ab246529)；p38 MAPK、p-p38 MAPK和NF-κB p65抗體(德國(guó)Sigma-aldrich公司，抗體批號(hào)：SAB4500491、M8177、SAB4502615)。

1.3 儀器

動(dòng)物跑臺(tái)(杭州段式制造廠)；7020 全自動(dòng)生化分析儀(HITACHI公司，日本)；Wellscan MK3 酶標(biāo)儀(雷博公司，美國(guó))；RM2016病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)；E100正置光學(xué)顯微鏡(Nikon公司，日本)；Pannoramic MIDI全自動(dòng)數(shù)字切片掃描系統(tǒng)(3D HISTECH公司，匈牙利)；Allegra 25R臺(tái)式高速離心機(jī)(Beckman Coulter公司，美國(guó))；NR-B17CC超低溫冰箱(Panasonnic 公司，日本)；ISO9001電子天秤(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；DY89-Ⅱ電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物訓(xùn)練與給藥

44只7周齡SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)4天后，隨機(jī)分組：對(duì)照組(control group，C組，12只)，模型組(model group，M組，16只)和姜黃素+模型組(curcumin+model group，CM組，16只)。C組安靜飼養(yǎng)，不進(jìn)行任何運(yùn)動(dòng)干預(yù)；M組、CM組采用6周遞增負(fù)荷跑臺(tái)訓(xùn)練(參考相關(guān)文獻(xiàn)[10]并結(jié)合前期研究[9])，具體方案如圖1。姜黃素以0.5%羧甲基纖維素鈉配制成懸濁液，CM組于每日訓(xùn)練前1 h進(jìn)行灌胃(200 mg/kg，5 mL/kg)[6-9]，其余組于同一時(shí)間點(diǎn)以等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃。

圖1 大鼠跑臺(tái)訓(xùn)練方案Fig.1 Treadmill modeling program of rat注：從第二周開始，每次訓(xùn)練初始速度為10 m/min，每5 min增加5 m/min，直到本周目標(biāo)強(qiáng)度。最后一周訓(xùn)練，大鼠若無法維持目標(biāo)強(qiáng)度，則運(yùn)動(dòng)至力竭。Note:Training started from 10 m/min and increased by 5 m/min every 5 min until the target speed of this week from 2nd week.During the last week of training,if the rats could not maintain the target speed,they would exercise to exhaustion.

2.2 取材與標(biāo)本制作

受訓(xùn)練強(qiáng)度等因素影響，M組、CM組大鼠均出現(xiàn)意外死亡，分別剩余13只、15只。

末次訓(xùn)練結(jié)束24 h，2%濃度的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，3 000 rpm離心10 min分離血清后放入-20 ℃冰箱保存待測(cè)?？焖俜蛛x心臟，置于預(yù)冷的生理鹽水中洗清血污。切取1 mm×1 mm×1 mm心尖處心肌組織，放入2.5%戊二醛制備透射電鏡樣品；另切取部分右心室心肌組織放入4%多聚甲醛固定；剩余心臟組織錫紙包裹后投入液氮暫存，而后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。

2.3 心肌組織病理學(xué)檢測(cè)

取出戊二醛固定液中的心肌組織，1×PBS和蒸餾水分別洗3次，1%鋨酸固定后蒸餾水洗3次，2%鈾染1 h，蒸餾水洗后(鋁箔中脫水)分別浸入梯度丙酮(30%、50%、70%、90%、無水丙酮)，滲透過程為樹脂：丙酮1∶3混合液1 h，樹脂：丙酮1∶1混合液2 h，樹脂：丙酮2∶1混合液過夜，經(jīng)過3次樹脂滲透后過夜，次日60 ℃烘箱高溫聚合，精修組織塊，切片機(jī)制成1 μm切片并撈至銅網(wǎng)中，透射電鏡觀察心臟超微結(jié)構(gòu)。

取出多聚甲醛固定液中的心肌組織，流水沖洗24 h，梯度乙醇(50%、70%、80%、90%、95%、無水乙醇)脫水，二甲苯透明后石蠟滲透，溫度保持在62 ℃，包埋機(jī)包埋，橫斷面切片(厚度為4 μm)烘干，HE染色觀察心臟組織病理學(xué)改變。

2.4 心肌組織纖維化程度檢測(cè)

心肌組織石蠟切片脫蠟至水，PAS染色液染色，脫水，封片。顯微鏡鏡檢，每個(gè)心肌組織標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)視野，采用ImageJ圖像分析系統(tǒng)分析心肌糖原容積分?jǐn)?shù)(心肌糖原容積分?jǐn)?shù)=視野內(nèi)糖原總面積/視野心肌組織總面積)，評(píng)定心肌纖維化程度。

2.5 心肌損傷及炎癥因子測(cè)定

酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清中心肌損傷因子cTNI和心肌組織中炎癥因子TGF-β1、TNF-α和IL-1β含量。

2.6 心臟組織蛋白質(zhì)表達(dá)量測(cè)定

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)心肌組織p38 MAPK、p-p38 MAPK和NF-κB p65蛋白質(zhì)表達(dá)。取心臟組織石蠟切片進(jìn)行脫蠟脫水、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、一抗與二抗孵育、DAB染色、復(fù)染細(xì)胞核、封片等操作，數(shù)字掃描儀進(jìn)行斷面全景掃描，計(jì)算組織化學(xué)評(píng)分[11]：細(xì)胞核陽(yáng)性由強(qiáng)至弱依次為深棕、棕黃、淺黃，藍(lán)色為陰性。H-score =(淺黃色細(xì)胞密度×1)+(棕黃色細(xì)胞密度×2) +(深棕色細(xì)胞密度×3)。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)果

3.1 大鼠體重變化

由圖2可知，實(shí)驗(yàn)正式開始前，各組大鼠體重組間無顯著性差異(P>0.05)；6周訓(xùn)練結(jié)束后，M組、CM組均顯著低于C組(P<0.01)，而組間無顯著差異(P>0.05)。

圖2 大鼠體重變化Fig.2 Weight changes of rats注：與C組比，##P<0.01。Note:Compared with group C,## P<0.01.

3.2 大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)變化

400倍光鏡下觀察大鼠右心室心肌組織形態(tài)。由圖3可知，C組心肌纖維橫紋清晰，排列整齊，肌細(xì)胞邊界明確，細(xì)胞質(zhì)呈紅色，細(xì)胞核呈深藍(lán)色且分布相對(duì)均勻，無明顯炎癥浸潤(rùn)。M組心肌纖維出現(xiàn)斷裂，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮現(xiàn)象，細(xì)胞邊界模糊不清，并有炎癥浸潤(rùn)、結(jié)締組織增生。CM組無明顯異常，與C組相似。

圖3 大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化(HE,×400)Fig.3 Pathological changes in myocardial tissue of rats(HE,×400)

6 000倍透射電鏡下觀察大鼠心肌纖維超微結(jié)構(gòu)。由圖4可知，C組肌絲束結(jié)構(gòu)正常，A帶、I帶、H帶和Z帶分布正常，線粒體結(jié)構(gòu)正常；M組肌纖維線粒體嵴短縮，并由部分出現(xiàn)空泡變性。CM組與C組相似。

圖4 大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)(TEM,×6000)Fig.4 Ultrastructure of rat myocardial tissue(TEM,×6000)

3.3 大鼠心肌組織ECM沉積

400倍光鏡下觀察PAS染色后心肌組織，并計(jì)算心肌糖原容積分?jǐn)?shù)。由圖5、表1可知，大鼠心肌糖原容積分?jǐn)?shù)，M、CM組顯著高于C組(P<0.01，P<0.05)，CM組顯著低于M組(P<0.05)。

圖5 大鼠心肌組織ECM沉積情況(PAS ×400)Fig.5 ECM deposition in myocardial tissue of rats(PAS ×400)

表1 大鼠心肌組織糖原容積分?jǐn)?shù)

3.4 大鼠心肌組織炎癥因子的含量變化

由表2可知，血清中心肌損傷因子cTNI含量：M組顯著高于C組(P<0.01)，CM組顯著低于M組(P<0.01)；心肌組織TGF-β1含量：M、CM組顯著高于C組(P<0.01)，CM組顯著低于M組(P<0.01)；TNF-α：M、CM組顯著高于C組(P<0.01，P<0.05)，CM組顯著低于M組(P<0.01)；IL-1β：M、CM組顯著高于C組(P<0.01)，CM組顯著低于M組(P<0.05)。

表2 大鼠心肌損傷標(biāo)志物及炎癥因子含量

3.5 大鼠心肌組織相關(guān)信號(hào)通路蛋白質(zhì)表達(dá)

選取400倍光鏡視野并計(jì)算相關(guān)信號(hào)通路蛋白質(zhì)的組織化學(xué)評(píng)分(H-Score)，由圖6、表3可知：p38 MAPK，各組間無顯著性差異(P>0.05)；p-p38 MAPK，M組顯著高于C和CM組(P<0.01)；而p-p38 MAPK/p38 MAPK，M組較C和CM組有升高趨勢(shì)，但組間無顯著性差異(P>0.05)；NF-κB p65，M組顯著高于C組(P<0.01)，而CM組顯著低于M組(P<0.05)。

表3 大鼠心肌組織相關(guān)信號(hào)通路蛋白質(zhì)表達(dá)(H-score)

圖6 大鼠心肌組織相關(guān)信號(hào)通路蛋白質(zhì)表達(dá)水平Fig.6 Expression of signaling pathway proteins in myocardial tissue of rats

4 討論

長(zhǎng)時(shí)程、過度的運(yùn)動(dòng)應(yīng)激使得心臟長(zhǎng)時(shí)間保持較高的心輸出量，心室長(zhǎng)期過度擴(kuò)張引發(fā)心肌纖維化，并逐漸發(fā)展成為慢性心肌損傷，心率失常風(fēng)險(xiǎn)明顯增加[12]。Breuckmann等[13]利用磁共振延遲釓強(qiáng)化技術(shù)發(fā)現(xiàn)馬拉松運(yùn)動(dòng)愛好者心肌纖維化發(fā)病率較高，易于普通人發(fā)生心肌損傷。Rao[10]造模長(zhǎng)時(shí)程、大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)致大鼠心肌損傷發(fā)現(xiàn)，過度運(yùn)動(dòng)應(yīng)激破壞了心肌組織ECM的合成與降解間的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，ECM沉積加劇，誘發(fā)心肌纖維化，同時(shí)血液中心肌損傷標(biāo)志物cTNI濃度增加，心臟功能/組織形態(tài)/超微結(jié)構(gòu)異常。體重變化可以反映運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)機(jī)體的影響。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠由于訓(xùn)練強(qiáng)度超出機(jī)體所能承受的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷，大量消耗能量物質(zhì)，體重較對(duì)照組明顯下降，同時(shí)心肌糖原容積分?jǐn)?shù)增加，血清cTNI含量顯著升高，心肌組織形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)亦發(fā)生病理性改變。說明本研究所采用6周跑臺(tái)遞增負(fù)荷訓(xùn)練方案由于過度運(yùn)動(dòng)應(yīng)激使得大鼠心肌組織ECM過度沉積及反應(yīng)性心肌纖維化，進(jìn)而引發(fā)心肌功能/結(jié)構(gòu)損傷。以上結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。

慢性炎癥反應(yīng)的累積效應(yīng)可引發(fā)心肌纖維化[14]。MAPKs族中主要成員p38 MAPK可以在轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)或蛋白質(zhì)合成，在炎癥、細(xì)胞凋亡等應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Aschar-Sobbi等[12]發(fā)現(xiàn)小鼠在6周大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，p38 MAPK表達(dá)增加，小鼠心房出現(xiàn)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，炎癥因子TNF-α、IL-1β表達(dá)增加，心肌纖維化，同時(shí)再以p38 MAPK抑制劑干預(yù)后運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的心房纖顫和纖維化得到抑制。NF-κB作為快速誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子在機(jī)體炎癥反應(yīng)中發(fā)揮主要作用，調(diào)控TGF-β1、TNF-α等炎癥因子表達(dá)[15]。Stambe等[16]研究發(fā)現(xiàn)阻斷p38 MAPK活化，可有效抑制腎組織的炎癥損傷。TGF-β1是心肌纖維化主要誘導(dǎo)因子，過度表達(dá)可破壞心肌組織ECM合成與降解平衡：①誘導(dǎo)smad復(fù)合物的形成與入核，調(diào)控目標(biāo)基因激活成纖維細(xì)胞，合成大量膠原蛋白等ECM組分，導(dǎo)致ECM過度沉積；②通過增強(qiáng)TIMP-1的表達(dá)，抑制MMP的活性，使ECM降解減少[17]。姜黃作用廣泛，常被用于香料、食品添加劑和草藥。姜黃素作為姜黃中具有生物活性的多酚提取物，對(duì)人體的健康益處主要體現(xiàn)在抑制炎癥和抗氧化等方面[18]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織中p38 MAPK及p-p38 MAPK/p38 MAPK雖未出現(xiàn)顯著性變化，但呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而p-p38 MAPK及NF-κB p65蛋白質(zhì)表達(dá)顯著上升，心肌纖維化因子TGF-β1及相關(guān)炎癥因子含量升高，心肌ECM過度沉積；而訓(xùn)練過程中施以姜黃素干預(yù)后，與模型組比較，大鼠心肌p38 MAPK及p-p38 MAPK/p38 MAPK雖未出現(xiàn)顯著性變化，但呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，p-p38 MAPK、NF-κB p65蛋白質(zhì)表達(dá)顯著下調(diào)，TGF-β1及相關(guān)炎癥因子等含量隨之降低，心肌ECM沉積得到緩解；同時(shí)心臟功能/組織形態(tài)/超微結(jié)構(gòu)均得到有效改善。Topcu-Tarladacalisir等[19]對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠進(jìn)行姜黃素干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK磷酸化水平下降，恢復(fù)MAPKs的免疫反應(yīng)特性，減輕炎癥反應(yīng)及脂質(zhì)過氧化程度。本課題組前期研究證實(shí)[8]，姜黃素可有效地抑制過度運(yùn)動(dòng)應(yīng)激導(dǎo)致的大鼠腎臟炎癥反應(yīng)，下調(diào)TGF-β1等促炎因子含量，恢復(fù)ECM合成與降解平衡。綜上可知，長(zhǎng)期大強(qiáng)度訓(xùn)練過程中補(bǔ)充姜黃素可有效阻斷運(yùn)動(dòng)性心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展，其可能機(jī)制為姜黃素通過抑制心肌組織內(nèi)p38 MAPK的過度活化，下調(diào)NF-κB p65的蛋白質(zhì)表達(dá)，降低炎癥因子特別是心肌纖維化誘導(dǎo)因子TGF-β1的合成與分泌，改善ECM合成與降解間的平衡，緩解心肌纖維化。

由此可見，姜黃素可以通過調(diào)控p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路，有效抑制長(zhǎng)時(shí)程、大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)大鼠心肌炎癥反應(yīng)，緩解心肌纖維化，保護(hù)心臟結(jié)構(gòu)/功能。