李 丹，馮靖雯，陳鴻平，劉友平，胡 媛

成都中醫(yī)藥大學西南特色中藥資源國家重點實驗室 中藥標準化教育部重點實驗室，成都 611137

番石榴葉為桃金娘科植物番石榴(PsidiumguajavaLinn.)的干燥葉，主要分布于廣東、廣西、四川、云南、福建及臺灣[1]等地，具有燥濕健脾，清熱解毒、澀腸止瀉、消炎止血之功效[2-8]?，F(xiàn)代研究表明，番石榴葉的主要有效成分包括黃酮類(番石榴苷、異槲皮苷、金絲桃苷、瑞諾苷、萹蓄苷、槲皮素)、三萜類，具有降血糖、抗氧化、抑菌等作用[9-12]。

目前，番石榴葉未被收錄在2020版《中國藥典》，但被《廣西中藥材標準》(1990年版)[4]、《廣東省中藥材標準第一冊》(2004年版)[3]、《湖南省中藥材標準》(2009年版)[6]、湖南省中藥飲片炮制規(guī)范(2010版)[8]、《廣西壯藥質(zhì)量標準》(第二卷 2011年版)[5]、《福建省中藥飲片炮制規(guī)范》(2012版)[2]、《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》(2015年版)[7]收載，是地方標準收載藥材。上述標準僅對番石榴葉中槲皮素進行了定性的薄層鑒定。關于番石榴葉藥材質(zhì)量方面的研究分析方法主要以大類成分含量及多成分定量為主[13-15]，難以全面反映藥材質(zhì)量。同時，番石榴作為重要的經(jīng)濟果木，資源豐富，但產(chǎn)地不一，亦難以控制番石榴葉的質(zhì)量。綜上，番石榴葉的質(zhì)量標準和質(zhì)量評價研究尚不完善，并亟待解決。

中藥指紋圖譜是一種評價中藥材以及中藥制劑半成品質(zhì)量的真實性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性的綜合、可量化的鑒定手段，現(xiàn)多用于評價中藥材質(zhì)量[16-19]。課題組前期建立了番石榴葉黃酮類成分一測多評法[20]，為番石榴葉質(zhì)量控制提供了一定的基礎。本研究以番石榴葉為研究對象，收集了31批不同產(chǎn)地的番石榴葉樣品進行指紋圖譜研究，采用相似度評價、聚類分析、主成分分析和正交偏最小二乘法-判別分析研究番石榴葉質(zhì)量與產(chǎn)地的相關性，為番石榴葉的質(zhì)量評價及質(zhì)量標準研究提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀；Zorbax SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm；Agilent 公司)；BN3000型萬分之一電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；CP2000型十萬分子一電子天平(德國Sartorius公司)；UPTUO-I-1000TE優(yōu)普系列超純水機(成都純水科技有限公司)；SG8200HDT型超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

鞣花酸(批號：CHB190126、成都克洛瑪生物科技有限公司)；金絲桃苷(批號：CHB190107、成都克洛瑪生物科技有限公司)；異槲皮苷(批號：CHB180628，成都克洛瑪生物科技有限公司)；瑞諾苷(批號：CHB200621，成都克洛瑪生物科技有限公司)、番石榴苷(批號：CHB190126，成都克洛瑪生物科技有限公司)；萹蓄苷(批號：CHB180802，成都克洛瑪生物科技有限公司)；乙腈(色譜純，美國TEDIA有限公司)；甲醇；無水乙醇( 分析純，成都市科龍化工試劑廠)。

1.3 藥材

收集不同產(chǎn)地番石榴葉31批，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學嚴鑄云教授鑒定為桃金娘科番石榴屬植物番石榴(PsidiumguajavaLinn．)的葉。詳細信息見表1。

表1 不同產(chǎn)地番石榴葉樣品信息

續(xù)表1(Continued Tab.1)

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)；梯度洗脫(0～2 min，5% A；2～15 min，5%→13.5% A；15～40 min，13.5% A；40～65 min，13.5%→21.3% A；65～70 min，21.3%→5% A)；進樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：254 nm。

2.2 對照品溶液制備

分別精密稱定鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷、萹蓄苷對照品適量，加甲醇制成含19.35 μg/mL鞣花酸、82.40 μg/mL金絲桃苷、82.40 μg/mL異槲皮苷、37.60 μg/mL瑞諾苷、75.12 μg/mL番石榴苷、81.52 μg/mL萹蓄苷混合對照品，即得。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱定各產(chǎn)地番石榴葉粉末約1.0 g(過四號篩),置于錐形瓶中，加入60%乙醇25 mL,超聲30 min，濾過，用0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗

取混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別平行測定6次，測得各共有峰相對保留時間的RSD均≤0.155%，相對峰面積均≤0.255%，表明儀器精密度良好(見表2、3)。

表2 混合對照品共有峰的相對保留時間

表3 混合對照品共有峰的相對峰面積

續(xù)表3(Continued Tab.3)

2.4.2 重復性試驗

取樣品S24適量，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，測得各共有峰相對保留時間的RSD均≤0.952%，相對峰面積均≤4.732%(見表4、5)。

表4 番石榴葉藥材樣品S24 HPLC圖譜共有峰相對保留時間(重復性)

表5 番石榴葉藥材樣品S24HPLC圖譜共有峰相對峰面積(重復性)

續(xù)表5(Continued Tab.5)

2.4.3 穩(wěn)定性試驗

取樣品S24適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12 h進樣，按“2.1”項下色譜條件，測得各共有峰相對保留時間的RSD均≤1.867%，相對峰面積均≤4.918%(見表6、7)。

表6 番石榴葉藥材樣品S24 HPLC圖譜共有峰相對保留時間(穩(wěn)定性)

表7 番石榴葉藥材樣品S24HPLC圖譜共有峰相對峰面積(穩(wěn)定性)

續(xù)表7(Continued Tab.7)

2.5 指紋圖譜相似度分析

取不同產(chǎn)地的31批番石榴葉進行指紋圖譜檢測，將結(jié)果導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012版)，選擇平均數(shù)為對照圖譜生成方法進行指紋圖譜相似度分析，在分析檢驗下，以R對照圖譜作為參照圖譜進行相似度計算(見表8)。31批番石榴葉藥材中與R對照指紋圖譜的相似度為0.720～0.928，其中大于0.9有10批，大于0.8有21批。相似度結(jié)果表明不同產(chǎn)地番石榴葉指紋圖譜存在差異。31批番石榴葉色譜峰圖見圖1。不同產(chǎn)地番石榴葉的對照指紋圖譜可檢出14個共有峰，通過對照品(見圖2)指認，確定9號峰為鞣花酸，10號峰為金絲桃苷，11號峰為異槲皮苷，12號峰為瑞諾苷，13號峰為番石榴苷，14號峰為萹蓄苷。以峰面積較大、峰形較好且保留時間居中的9號峰作為參照峰，計算其他各共有峰和參照峰的峰面積比值即相對峰面積(見表9)。

表8 番石榴葉指紋圖譜相似度評價結(jié)果

續(xù)表8(Continued Tab.8)

表9 31批番石榴葉指紋圖譜中共有特征峰的相對峰面積

圖1 31批番石榴葉HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint of 31 batches of Psidii Guajavae Folium注：9-鞣花酸；10-金絲桃苷；11-異槲皮苷；12-瑞諾苷；13-番石榴苷；14-萹蓄苷(下同)。Note:9-Ellagic acid;10-Hyperoside;11-Isoquercitroside;12-Reynoutrin;13-Guaijaverin;14-Avicularin (the same below).

圖2 混合對照品的HPLC圖Fig.2 HPLC chart of mixed reference substance

通過相似度對比發(fā)現(xiàn)相似度小于0.8的番石榴葉樣品主要產(chǎn)自廣西、廣東，相似度大于0.9的番石榴葉樣品主要產(chǎn)自四川、云南，說明不同產(chǎn)地番石榴葉樣品差異大。通過對比兩類的主要色譜峰峰面積發(fā)現(xiàn)產(chǎn)自廣東、廣西番石榴葉樣品中9號峰鞣花酸、10號峰金絲桃苷、11號峰異槲皮苷、12號峰瑞諾苷、13號峰番石榴苷、14號峰萹蓄苷的平均峰面積均小于產(chǎn)自四川、云南的番石榴葉樣品。

2.6 化學模式識別分析

2.6.1 聚類分析

為全面分析不同產(chǎn)地番石榴葉樣品質(zhì)量的影響，以14個共有峰峰面積作為變量，運用SPSS20.0軟件對31批番石榴葉樣品進行系統(tǒng)聚類分析，采用組間聯(lián)接聚類法，度量標準為Pearson相關性，結(jié)果見圖3。31個樣品被分為三大類，3個分類中，四川米易、德昌，云南麗江聚為一類；廣西玉林、南寧、崇左、百色，廣東信宜、廣州、汕頭，海南?？诰蹫橐活?；上述2類番石榴葉的地理位置分別相近，各自聚為一類，說明不同產(chǎn)地的番石榴葉藥材可以通過聚類分析對番石榴葉樣品進行分類質(zhì)量品質(zhì)評價。

圖3 番石榴葉的系統(tǒng)聚類分析Fig.3 System cluster analysis of Psidii Guajavae Folium

2.6.2 主成分分析及正交偏最小二乘法判別分析

主成分分析法(principal component analysis)是一種通過降維技術(shù)把多個變量化為少數(shù)幾個主成分(綜合變量)的統(tǒng)計分析方法。這些主成分能夠反映原始變量的絕大部分信息，它們通常表示為原始變量的某種線性組合。正交偏最小二乘判別分析(orthogonal PLS-DA，OPLS-DA)是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計方法，其最大的特點是可以除自變量X中與分類變量Y無關的數(shù)據(jù)變異，使分類信息主要集中在一個主成分，使模型更簡單和易于解釋，其判別效果及主成分得分圖的可視化效果更加明顯。

以14個共有峰峰面積為變量，采用SIMCA(14.1)軟件對31批番石榴葉樣品進行PCA，結(jié)果提取到2個具有最大特征制得主成分(PC)，總貢獻率為55.1%，其中PC1貢獻率為37.2%，貢獻率最大；PC2貢獻率為17.9%。由前2個主要成分建立坐標系，得到31批番石榴葉的PCA得分圖 (圖4)，由圖4可見，大部分樣品均在95%可信區(qū)間，且能分為兩類。其中大部分廣東、廣西、福建、海南番石榴葉樣品聚為一類，四川、云南聚為一類，與聚類分析結(jié)果一致。據(jù)中國地理分布圖及行政區(qū)劃發(fā)現(xiàn)四川、云南位于以大興安嶺、太行山脈、巫山及雪峰山的界限的第二階梯(平均海拔1 000～2 000 m)，屬于西南地區(qū)；廣西、廣東、福建海南位于以大興安嶺、太行山脈、巫山及雪峰山為界限的第三階梯(平均海拔500 m以下)，屬于沿海地區(qū)。綜上，2個主要成分能反映不同產(chǎn)地番石榴葉的主要特征，提示沿海地區(qū)和西南地區(qū)的番石榴葉在化學成分含量上存在差異。

圖4 不同番石榴葉樣品的PCA得分Fig.4 PCA scores of different Psidii Guajavae Folium samples

依據(jù)PCA結(jié)果，對不同分布地區(qū)的2組樣品進行OPLS-DA分析。OPLS-DA模型，R2Y(cum)=0.895，Q2(cum)=0.842，均大于0.5，說明模型穩(wěn)定可靠，可用于不同產(chǎn)地樣品的區(qū)分。從圖5可以發(fā)現(xiàn)，數(shù)據(jù)的分類算法中OPLS-DA的效果較好，可使兩類樣本完全分開，相互之間沒有樣本出現(xiàn)交叉的情況，少部分樣品在95%可信區(qū)間外。

圖5 不同番石榴葉樣品OPLS-DA得分圖Fig.5 OPLS-DA scores of different Psidii Guajavae Folium samples

對OPLS-DA變量重要性投影值(variable importance in the projection，VIP)進行分析(見圖6)，VIP值越大的變量(至少大于1)對分類的貢獻越大。采用VIP>1.0作為標準篩選出對模型貢獻較大的變量，分別為峰9、12、11、4、13、3、10，這些成分是引起番石榴葉因產(chǎn)地差異導致成分差異的主要標志性成分，其余峰VIP值<1，對樣品產(chǎn)地區(qū)分影響較小。

圖6 番石榴葉14個共有峰的VIP值Fig.6 VIP values of 14 common peaks of Psidii Guajavae Folium注：1～14：峰1～14。Note:1～14:Peak 1～14.

2.7 多成分含量測定

2.7.1 系統(tǒng)適應性

取混合對照品溶液、供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷與其相鄰色譜峰的分離度大于1.5(見圖2)。

2.7.2 線性關系考察

精密移取各對照品溶液，至5 mL容量瓶中，加甲醇配制成鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷的混合對照品溶液，濃度分別為38.69、164.80、164.80、75.20、150.24 μg/mL，作為標曲最高濃度。精密移取混合對照品溶液1 mL，置2 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋并定容至刻度線，混勻。按照上述方法，依次制備得到不同濃度的混合對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進樣，以對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線及線性回歸方程(見表10)。

表10 線性回歸方程及相關系數(shù)

2.7.3 精密度考察

根據(jù)“2.4.1”項下精密度考察試驗，測得鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷的峰面積RSD值分別為1.51%、1.50%、1.50%、1.51%、1.49%，表明儀器精密度良好。

2.7.4 重復性考察

根據(jù)“2.4.2”項下重復性考察試驗，測得鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷的峰面積RSD值分別為2.17%、0.85%、0.90%、2.05%、1.31%，表明該方法重復性良好。

2.7.5 穩(wěn)定性考察

根據(jù)“2.4.3”項下穩(wěn)定性考察試驗，測得鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷的峰面積RSD值分別1.14%、0.18%、0.36%、0.66%、2.37%，表明該供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.6 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的S24番石榴葉藥材6份，每份0.5 g，分別精密加入與樣品中含量相當?shù)镊坊ㄋ?、金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷對照品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，計算各成分的平均加樣回收率，結(jié)果鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷平均加樣回收率分別為100.18%、98.17%、97.36%、100.64%、98.40%，RSD值分別為3.50%、2.99%、3.13%、4.29%、2.05%。

2.7.7 樣品含量測定

根據(jù)“2.3”項下方法制備番石榴葉藥材供試品溶液，每批平行3份，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄數(shù)據(jù)。測得鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷的百分含量，具體結(jié)果見表11。

表11 31批番石榴葉藥材多成分含量測定結(jié)果(n=3)

續(xù)表11(Continued Tab.11)

3 討論

參照課題組前期研究[20]，確定提取方法為60%乙醇超聲提取30 min，流動體系為乙腈-0.2%磷酸水，色譜柱(Zorbax SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫35 ℃，進樣體積10 μL。同時，考察波長(230、254、360 nm)及流動體系不同比例梯度洗脫對番石榴葉HPLC指紋圖譜的影響。結(jié)果，本試驗確定的色譜條件下，番石榴葉樣品溶液峰數(shù)最多，HPLC基線平穩(wěn)，峰形及分離度較好。

本試驗收集了具有地域代表的番石榴葉藥材，包括廣東、廣西、福建、海南、四川，保證了番石榴葉指紋圖譜的廣泛性。采用相似度評價對番石榴葉HPLC指紋圖譜進行分析，發(fā)現(xiàn)31批番石榴葉的HPLC指紋圖譜相似度存在一定差異，不同產(chǎn)地的番石榴葉藥材質(zhì)量受地域影響。

聚類分析與主成分分析結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn)31批番石榴葉樣品主要分為兩類，廣西、廣東、福建、海南聚為一類，四川、云南聚為一類。根據(jù)中國地理分布圖及行政區(qū)劃發(fā)現(xiàn)四川、云南位于以大興安嶺、太行山脈、巫山及雪峰山的界限的第二階梯(平均海拔1 000～2 000 m)，屬于西南地區(qū)；廣西、廣東、福建海南位于以大興安嶺、太行山脈、巫山及雪峰山為界限的第三階梯(平均海拔500 m以下)，屬于沿海地區(qū)。利用正交偏最小二乘判別分析，發(fā)現(xiàn)引起此兩類產(chǎn)地番石榴葉差異的7中主要成分，并鑒定出鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷5種成分。通過對番石榴葉樣品中鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮素、瑞諾苷、番石榴苷進行定量分析，發(fā)現(xiàn)沿海地區(qū)(廣東、廣西、福建、海南)的5種成分含量均低于西南地區(qū)(四川、云南)，且有顯著性差異(見圖7)。綜上，番石榴葉的次生代謝產(chǎn)物呈明顯的地域差異，提示番石榴葉的藥材質(zhì)量與其生長環(huán)境密切相關，可能受當?shù)氐臍夂驐l件和環(huán)境因素影響，其具體影響因素還需進一步調(diào)查研究。

圖7 31批不同產(chǎn)地番石榴葉藥材的平均質(zhì)量分數(shù)Fig.7 The average mass fraction of 31 batches of Psidii Guajavae Folium from different origins

本研究以番石榴葉為對象，采用高效液相色譜法，建立了番石榴葉藥材的化學指紋圖譜，測定了番石榴葉藥材中鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷5種化學成分的含量，并結(jié)合化學計量學方法分析了31批不同產(chǎn)地的番石榴葉藥材，發(fā)現(xiàn)番石榴葉藥材質(zhì)量受地域影響。所建立的方法簡便、準確，為番石榴葉藥材的質(zhì)量控制及質(zhì)量標準的建立提供了方法及數(shù)據(jù)參考。