呂 磊，李 瑤，王永園，金 濤，鐘 勇

0 引 言

大強(qiáng)度超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可誘發(fā)心肌缺血缺氧。近年研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)可以通過(guò)反復(fù)短暫、高強(qiáng)度的間歇性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性保護(hù)作用，從而使心肌對(duì)后續(xù)長(zhǎng)時(shí)間的缺血、缺氧產(chǎn)生耐受，減輕心肌損傷。研究證實(shí)，運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)能減少缺血后心梗面積，改善缺血后心功能，減少心律失常，還可能改善心肌細(xì)胞能量代謝[1]。既往研究表明，細(xì)胞凋亡參與了運(yùn)動(dòng)性心肌損傷，運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)能通過(guò)上調(diào)凋亡相關(guān)基因Bcl-2和下調(diào)Bax的表達(dá)，減少動(dòng)脈硬化大鼠急性心肌缺血所致的心肌細(xì)胞凋亡[2]。一氧化氮(NO)能改變線粒體通透性，阻斷含半胱氨酸蛋白水解酶(caspase)的激活，減少凋亡信號(hào)的釋放，從而減少細(xì)胞凋亡[3]。然而，運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)所致心肌細(xì)胞凋亡的作用及其具體機(jī)制尚未明確。本研究觀察運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)對(duì)一次性運(yùn)動(dòng)力竭大鼠心肌形態(tài)改變、氧化應(yīng)激水平、心肌細(xì)胞凋亡和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的影響，初步探討其相關(guān)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性Sprague Dawley大鼠21只，體重150～170 g，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(SPF級(jí))，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(滬)2018-0006。大鼠分籠飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度(22±2)℃，濕度(50±5)%，標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)大鼠飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食，純凈水自由飲用，自然光照，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，進(jìn)行跑臺(tái)適應(yīng)性訓(xùn)練(跑臺(tái)速度15 m/min，坡度0°)，每天訓(xùn)練15 min，共5 d。本研究動(dòng)物操作方法遵循國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例和細(xì)則，動(dòng)物處置方法均符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)號(hào):2018JLHZXKT-001)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和模型建立參照文獻(xiàn)[4]，適應(yīng)性訓(xùn)練后，將大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：安靜對(duì)照組(不運(yùn)動(dòng))、運(yùn)動(dòng)力竭組和運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)組，每組7只。一次性力竭運(yùn)動(dòng)模型參照文獻(xiàn)[5]標(biāo)準(zhǔn)建立，大鼠在跑臺(tái)上進(jìn)行持續(xù)性運(yùn)動(dòng)(跑臺(tái)速度30 m/min，坡度0°)，直至力竭。判斷力竭狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)為: 大鼠伏臥于跑道，雙眼無(wú)光，四肢癱軟，聲、光等外界刺激均不能使其繼續(xù)運(yùn)動(dòng)，翻轉(zhuǎn)后無(wú)法翻正[6]。運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)組大鼠在跑臺(tái)上進(jìn)行重復(fù)4次的間歇性運(yùn)動(dòng)(跑臺(tái)速度28～30 m/min)，每次運(yùn)動(dòng)15 min、休息15 min，30 min后行一次性力竭運(yùn)動(dòng)。

1.3 HE染色觀察心肌形態(tài)改變力竭運(yùn)動(dòng)后，留取大鼠新鮮左心室心尖部，4%多聚甲醛溶液固定，修剪脫水后石蠟包埋，標(biāo)本按4～5 μm連續(xù)切片脫蠟至水后進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，鏡下觀察大鼠心肌組織改變。

1.4 TUNEL染色法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)大鼠新鮮左室心肌組織固定后制作石蠟切片，常規(guī)方法脫蠟水化，按原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL)凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Roche公司)說(shuō)明進(jìn)行心肌細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)。熒光顯微鏡下正常心肌細(xì)胞細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡心肌細(xì)胞細(xì)胞核呈綠色(TUNEL陽(yáng)性)。隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)非重疊高倍鏡視野(×400)下凋亡心肌細(xì)胞數(shù)和心肌細(xì)胞總數(shù)，兩者的比值即為心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)和一氧化氮測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取靜脈血，1500×g離心5 min，留取上清，4 ℃保存。嚴(yán)格按試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)步驟操作，硫代巴比妥酸比色法在532 nm處測(cè)定丙二醛(MDA)含量，黃嘌呤氧化酶法在450 nm處測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)含量，比色法在550 nm處測(cè)定一氧化氮(NO)含量。

1.6 Western blot法測(cè)定大鼠心肌內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)水平力竭運(yùn)動(dòng)后，留取大鼠左心室心肌組織，液氮冷凍后-80℃保存。取大鼠心肌組織在組織裂解液中勻漿并離心，提取心肌組織總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量。取蛋白40 μg，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜后分別用eNOS一抗(1∶1000，美國(guó)CST公司)，內(nèi)參GAPDH抗體(1∶2500，美國(guó)CST公司)封閉，4 ℃過(guò)夜。再用辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗(1∶5000稀釋)室溫封閉，孵育2 h。使用Gel Doc2000凝膠圖像專(zhuān)用軟件(Bio-Rad公司)對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行分析，測(cè)積分吸光度值，以目的條帶與GAPDH條帶灰度值的比值表示結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 心肌組織HE染色結(jié)果光鏡下，安靜對(duì)照組大鼠心肌纖維、膠原纖維等紅染，染色均勻，結(jié)構(gòu)清楚，心肌纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，無(wú)水腫，心肌細(xì)胞排列規(guī)則，細(xì)胞核藍(lán)染。運(yùn)動(dòng)力竭組大鼠心肌細(xì)胞染色欠均，排列較紊亂，部分肌纖維斷裂、排列紊亂和局限性間質(zhì)水腫。運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)組大鼠心肌染色比較均勻，少量心肌纖維排列紊亂、腫脹。見(jiàn)圖1。

a：安靜對(duì)照組；b：運(yùn)動(dòng)力竭組；c：運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)組

2.2 心肌細(xì)胞TUNEL染色及心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較安靜對(duì)照組大鼠未見(jiàn)心肌細(xì)胞凋亡，運(yùn)動(dòng)力竭組和運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)組均可見(jiàn)凋亡細(xì)胞，見(jiàn)圖2。運(yùn)動(dòng)力竭組凋亡指數(shù)為(12.48±2.88)%，運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)組凋亡指數(shù)為(3.51±0.78)%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

a：安靜對(duì)照組，未見(jiàn)凋亡心肌細(xì)胞；b：運(yùn)動(dòng)力竭組，可見(jiàn)凋亡細(xì)胞；c：運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)組，僅見(jiàn)少許凋亡心肌細(xì)胞

2.3 各組大鼠SOD活性、MDA含量和NO含量運(yùn)動(dòng)力竭組大鼠血清MDA含量較安靜對(duì)照組明顯升高，SOD活性和NO含量降低(P<0.05)。運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)后，MDA含量下降，SOD活性和NO含量均高于運(yùn)動(dòng)力竭組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠SOD活性、MDA含量和NO含量比較

2.4 運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)對(duì)大鼠心肌組織中eNOS蛋白表達(dá)的影響Western blot法測(cè)定結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)力竭組eNOS蛋白表達(dá)(0.56±0.17)較安靜對(duì)照組(1.00±0.12)下降，而運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)組(1.91±0.22)顯著高于運(yùn)動(dòng)力竭組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)增加了大鼠心肌組織中eNOS的蛋白表達(dá)水平。見(jiàn)圖3。

GAPDH(內(nèi)參)：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

3 討 論

反復(fù)短暫的高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，即運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)，可通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)源性保護(hù)作用，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)隨后高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)的耐受性，減少機(jī)體損傷。研究表明，運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)可明顯降低大強(qiáng)度力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)心肌肌鈣蛋白I和N端腦鈉肽激素原的濃度，保護(hù)心肌[7]。運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)對(duì)心肌保護(hù)作用分早期保護(hù)和晚期保護(hù)兩個(gè)時(shí)相，早期保護(hù)更為明顯[8]。本研究觀察光鏡下心肌細(xì)胞的病理改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)力竭組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，伴部分肌纖維斷裂和局限性間質(zhì)水腫，而運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)后再進(jìn)行力竭運(yùn)動(dòng)，心肌細(xì)胞損傷較輕，提示運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)減輕了力竭運(yùn)動(dòng)所致大鼠心肌的組織病理改變。

SOD是調(diào)節(jié)過(guò)氧化水平、清除過(guò)氧化物的主要酶，通過(guò)催化超氧陰離子的歧化反應(yīng)，抑制超氧自由基的連鎖反應(yīng)，有效減緩機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度，降低機(jī)體氧化應(yīng)激損傷，是機(jī)體重要的氧自由基清除劑。MDA是氧自由基攻擊細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸，產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化作用的產(chǎn)物之一，可反映體內(nèi)氧自由基活性[9-10]。本研究結(jié)果顯示，大鼠力竭運(yùn)動(dòng)后血清SOD活性較安靜對(duì)照組明顯降低，MDA含量顯著增加，運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)組與運(yùn)動(dòng)力竭組比較，SOD活性升高，MDA含量下降，提示力竭運(yùn)動(dòng)增加了機(jī)體氧化應(yīng)激水平，而運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)提高抗氧化酶活性，使機(jī)體對(duì)活性氧產(chǎn)生適應(yīng)能力，減少因機(jī)體組織缺血缺氧所致的氧自由基生成。

本研究進(jìn)一步觀察了運(yùn)動(dòng)力竭組和運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)組大鼠心肌凋亡指數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)組顯著低于運(yùn)動(dòng)力竭組，提示一次性力竭運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，而運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)能減少心肌凋亡。力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡可能與氧自由基過(guò)度生成和細(xì)胞能量代謝障礙有關(guān)。力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)心肌細(xì)胞缺血缺氧，氧自由基大量生成，葡萄糖和脂質(zhì)過(guò)氧化，細(xì)胞膜損傷，蛋白質(zhì)氧化和核內(nèi)DNA鏈斷裂，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[11]。此外，力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)心肌缺血缺氧，抑制線粒體氧化磷酸化，ATP生成減少，細(xì)胞能量代謝障礙，鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能被抑制，胞漿和線粒體鈣超載，通過(guò)激活磷脂酶破壞細(xì)胞膜和激活蛋白酶使蛋白分解，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[12]。

NO是一種舒張血管的小分子化學(xué)物質(zhì)，廣泛存在于多種組織細(xì)胞中，通過(guò)升高環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷含量誘導(dǎo)平滑肌舒張，在人體心腦血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和炎癥免疫反應(yīng)中參與生理和病理過(guò)程。生理濃度水平NO參與調(diào)節(jié)血管通透性和血管張力、穩(wěn)定血壓等生理過(guò)程。缺氧時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO，激活鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶增加細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷水平，通過(guò)降低血管平滑肌中鈣離子水平，擴(kuò)張血管平滑肌[13]。NO還能通過(guò)減少凋亡信號(hào)的釋放來(lái)減少細(xì)胞凋亡[3]。一氧化氮合酶(NOS)是一氧化氮合成的關(guān)鍵酶，eNOS也稱(chēng)為NOS3，為鈣離子依賴性酶，以L-精氨酸為底物，在血管內(nèi)利用氧催化產(chǎn)生NO，參與生理調(diào)控，在維持血管穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞功能中起重要作用[14]。既往研究表明，短期平板運(yùn)動(dòng)能顯著增加大鼠腦血管和主動(dòng)脈中eNOS的表達(dá)[15]，長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能增加慢性心衰大鼠左室eNOS的活性[16]。本研究表明，與安靜對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)力竭組NO和心肌組織eNOS表達(dá)水平均下降，而運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)能上調(diào)心肌組織eNOS的表達(dá)水平，增加NO濃度，抑制心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)能減輕一次性力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌損傷所致心肌細(xì)胞凋亡和自由基釋放，eNOS可能參與這一保護(hù)作用。