許丹丹，汪佳佳，郭 霜，張飛雪，劉秀芬**

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學(xué)院糖尿病心腦血管病變湖北省重點實驗室)

膜內(nèi)皮蛋白(endoglin)又稱CD105，是一種跨膜糖蛋白，對維持血管內(nèi)皮的正常功能至關(guān)重要，它也是轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)超家族的Ⅲ型輔助受體。根據(jù)目前的研究分析，endoglin可能成為診斷心血管疾病的有效標(biāo)志物以及預(yù)防治療心血管疾病的潛在靶點[1]。在妊娠中期，endoglin-null老鼠死于血管生成缺陷和嚴(yán)重心血管異常,而endoglin雜合子(endoglin+/-)的小鼠有一個正常的壽命[2]。基于此，我們制作了endoglin基因敲除雜合子小鼠，為心血管疾病的研究提供動物疾病模型。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

CD105單克隆抗體購自美國CST公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體購自武漢谷歌公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG購自Biosharp公司；RIPA組織裂解液(RIPA)購自美國CST公司；二喹啉甲(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司；苯甲基磺酰氟(PMSF)購自碧云天公司；蛋白酶抑制劑購自美國Thermo Fisher公司；超敏型化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影液購自武漢愛博泰克公司；PCR儀、Universal HoodⅡ-凝膠成像系統(tǒng)和PowerPac Basic垂直電泳儀購自美國Bio-Rad公司；低溫高速離心機購自德國Eppendorf公司；多功能酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司。

1.2 小鼠的飼養(yǎng)與繁殖

Endoglin+/-小鼠由北京維通達生物技術(shù)有限公司制作，在湖北科技學(xué)院醫(yī)藥研究院SPF動物房中繁殖擴群。屏障內(nèi)環(huán)境均符合國家對實驗動物環(huán)境設(shè)施的要求：溫度(23±3)℃，相對濕度(50±15)%。在飼養(yǎng)過程中，墊料、籠等器具均進行高壓真空滅菌；為了避免高溫高壓對飼料營養(yǎng)的損傷，本實驗采用鈷60輻射消毒飼料；飲水經(jīng)高壓達到純凈無菌要求，小鼠自由飲水；為保證小鼠居住環(huán)境的潔凈度，墊料48h更換一次。最初引進10只雌性和6只雄性endoglin+/-小鼠，母鼠妊娠期為21d左右，和正常小鼠妊娠期一致。哺乳期為28～30d，幼鼠在約1個月斷奶后打耳號標(biāo)記并剪尾鑒定。性成熟期為60d左右，大量繁殖時采用兩只雌鼠和一只雄鼠合籠。

1.3 小鼠的基因型鑒定

引進小鼠均為endoglin+/-小鼠，根據(jù)孟德爾遺傳定律，配對繁殖的后代有3種基因型：野生型、雜合子以及純合子，但純合子在胚齡11d時死亡，所以出生的后代只有兩種基因型，需要對子代野生型和雜合子進行基因型鑒定。

1.3.1 鼠尾DNA提取

小鼠斷奶后，切取尾尖長度2～3mm，放入0.6mL EP管中。管中加入組織裂解液50～100μL，樣品在恒溫混勻器中250r/min，56℃，恒溫震蕩4h或過夜，使鼠尾得以徹底消化裂解。將裂解完全的樣品置于PCR儀上，設(shè)置程序：①95℃，10min；②4℃保存。

上述制得的裂解樣品可以直接作為PCR擴增的DNA模板溶液，20μL的反應(yīng)體系，需要加本裂解樣品0.2～1μL作為DNA模板。

1.3.2 PCR反應(yīng)及瓊脂糖凝膠電泳

(1)PCR反應(yīng)：鑒定引物序列由維通達生物技術(shù)有限公司提供，由上海生工合成。引物序列：上游引物，5’-ACCCTGGCTCTTACCTTCCTTCC-3’；下游引物，5’-CTCGCAGATGTTTGAGGTGAGGTAG-3’。Endoglin+/-僅有600bp的條帶，野生型僅有1 700bp的條帶。

(2)PCR反應(yīng)體系(20μL)：2×Taq PCR Mix，10μL；滅菌ddH2O，8.7μL；10μmol/L上游引物，1μL；10μmol/L下游引物，1μL；模板DNA，0.3μL。

使用PCR擴增儀進行Touchdown循環(huán)擴增，擴增參數(shù)設(shè)定：95℃預(yù)變性4min；95℃變性20s，64℃復(fù)性25s，72℃延伸30s，38個循環(huán)；最后72℃延伸2min；4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)瓊脂糖凝膠電泳:將PCR反應(yīng)終產(chǎn)物7μL于2%的瓊脂糖凝膠中進行電泳分析。然后依據(jù)瓊脂糖凝膠基因型600bp和1 700bp片段大小分辨出各類基因型小鼠。

1.4 Endoglin基因在心肌中的表達

分別取野生型和敲除鼠的心臟組織，通過Western blotting檢測endoglin蛋白的表達水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 小鼠基因型鑒定的結(jié)果

從圖1可以看出3、9、10、11、12、13、16、17、18、21、22全部都呈現(xiàn)出一條1 700bp的條帶，為野生型(wild type，WT)；1、2、4、5、6、8、14、15、19、20、23、24全部呈現(xiàn)出一條600bp的條帶，為endoglin+/-；而7號沒得到任何條帶，需要進一步確定。

M代表marker；數(shù)字代表小鼠的編號圖1 Endoglin基因敲除小鼠基因型的鑒定

2.2 Endoglin基因在心肌中的表達情況

隨機選取兩只endoglin+/-敲除鼠和兩只同窩WT小鼠，取其心肌組織進行蛋白電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩只WT小鼠的CD105蛋白的表達量都明顯高于兩只endoglin+/-敲除鼠(P<0.05)，見圖2～3。

圖2 Endoglin基因在心肌中的表達

與WT組比較，*P<0.05，n=6圖3 WB結(jié)果的灰度值分析

3 討 論

基因敲除技術(shù)常常用于建立某種特定基因缺失的生物模型，從而進行相關(guān)的研究。利用基因敲除小鼠研究某一基因的生物學(xué)功能也已經(jīng)引起許多研究者的關(guān)注，建立穩(wěn)定的基因敲除小鼠模型對于課題組下一步的實驗具有重要意義。在我們的實驗中，利用PCR擴增技術(shù)以及瓊脂糖凝膠電泳的方法對敲除endoglin基因的C57小鼠進行基因鑒別，在構(gòu)建了基因敲除小鼠后，隨機抽取心臟樣本，利用WB技術(shù)驗證小鼠心肌組織中CD105基因的蛋白表達水平。結(jié)果顯示，兩只WT小鼠的CD105蛋白的表達量都明顯高于兩只endoglin+/-敲除鼠(P<0.05)，說明endoglin+/-敲除鼠的CD105蛋白表達明顯下降，證明在CD105基因半敲除后，在目標(biāo)類型的表型上完全符合預(yù)期，成功構(gòu)建了敲除endoglin+/-基因雜合子小鼠模型，為深入研究endoglin基因在心肌中的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。同時也提供了良好的動物模型，可用于后續(xù)糖尿病心肌病的研究。

Endoglin是一種細(xì)胞膜糖蛋白，主要表達在構(gòu)成動脈、靜脈和毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞上，是TGF-β受體復(fù)合物的副成分。Endoglin參與血管的發(fā)育和重構(gòu)，在心血管疾病、血管生成過程和癌癥中發(fā)揮重要作用[3]，可以被基質(zhì)金屬蛋白酶裂解形成可溶性的endoglin(S-endoglin)，并釋放到血液循環(huán)中，被認(rèn)為是動脈粥樣硬化、二型糖尿病和肝臟疾病等心臟代謝紊亂的危險因素。循環(huán)中S-endoglin的增加發(fā)生在不同的病理生理過程中，如內(nèi)皮損傷、遷移、血管生成、炎癥、心血管疾病、子癇前期和腫瘤血管生成[4-6]。

有研究表明[7]，endoglin在平衡TGF信號通路中發(fā)揮重要作用，從而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。近年的研究表明[8-10]，S-endoglin和TGF-β信號通路在心肌纖維化的過程中似乎都有參與。有報道[2]研究了endoglin作為TGF-β1家族的協(xié)同受體，調(diào)節(jié)這些因子激活的細(xì)胞內(nèi)信號通路，抑制TGF-β1信號通路，影響腫瘤發(fā)生和造血功能。

Endoglin參與血管生成，其在心血管風(fēng)險中的作用已得到很好的證實，因為血漿可溶性endoglin水平的升高與冠狀動脈血管收縮有關(guān)，而冠狀動脈血管收縮可能導(dǎo)致心臟纖維化和圍生期心肌病[11]。TGF-β載體介導(dǎo)的信號通過與內(nèi)皮細(xì)胞中的TGF-β載體特異性膜受體復(fù)合物結(jié)合而啟動，包含3種受體，其中一種共受體或TGF載體Ⅲ型受體，稱為S-endoglin，這些受體通過磷酸化將信號傳播到下游的核受體-Smads，導(dǎo)致Ⅰ型膠原蛋白(collagen typeⅠ，CollⅠ)異常增多和比例失調(diào)，進而促進心肌纖維化[12-13]。所以S-endoglin可能將成為一種新型治療糖尿病心肌病的治療靶點，防止右心室纖維化，改善右心室壓力超負(fù)荷的功能，提高其生存率[14-15]。因此，endoglin基因敲除鼠將成為研究糖尿病心肌病的動物模型，為進一步研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。