張飛雪，周 楊，周 瑤，郭 霜**

(1.湖北科技學院糖尿病心腦血管病變湖北省重點實驗室，湖北 咸寧 437100；2.咸寧市疾病預(yù)防控制中心)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是導致慢性腎衰竭的重要病因之一[1]。研究表明，每年在中國和美國的慢性腎衰竭患者中，約40%的發(fā)病率來源于DN[2-3]。DN的病理生理復(fù)雜且尚未完全闡明，但腎纖維化是終末期腎衰竭的主要病理基礎(chǔ)。姜黃素(curcumin，Cur)是姜科植物姜黃的主要成分，現(xiàn)有研究表明，其具有抗纖維化、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等廣泛的生物學作用，且毒副作用及不良反應(yīng)較小，目前已廣泛被應(yīng)用于多種疾病的基礎(chǔ)和臨床研究[4]。本研究通過高糖高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)復(fù)制Ⅱ型糖尿病小鼠動物模型，探討Cur是否通過改善腎纖維化保護糖尿病小鼠腎臟組織及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6小鼠，50只，雄性，體重(25±2)g，購于武漢大學實驗動物中心，許可證號為SCXK(鄂)2014-0004。分籠飼養(yǎng)，自由進食和飲水。

1.2 藥品與試劑

Cur(Sigma公司)；MASSON染色試劑盒(武漢塞維爾公司)；天狼猩紅染色試劑盒(武漢賽維爾公司)；TGF-β1抗體(abclonal公司)，α-SMA抗體(CST公司)，β-actin抗體(武漢賽維爾公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 糖尿病模型制備

SPF級8周齡C57BL/6小鼠50只，雄性。SPF級動物房環(huán)境下維持飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，將小鼠隨機分為兩組：正常組，20只；模型組，30只。其中模型組小鼠高糖高脂飼料持續(xù)喂養(yǎng)4周后，連續(xù)5d小鼠空腹腹腔注射STZ 50mg/kg，由pH4.5的檸檬酸鹽緩沖液配制，正常組小鼠持續(xù)喂養(yǎng)，給予等體積的檸檬酸鹽緩沖液。以隨機血糖≥16.7mmol/L作為糖尿病造模成功標準。血糖穩(wěn)定2周后，正常組隨機分為：Con組(n=10)，Cur組(200mg/kg/d，口服，n=10)；模型組隨機分為：DN組(n=12)，DN+Cur組(200mg/kg/d，口服，n=14)。Cur由1%的羧甲基纖維素鈉配制。實驗過程中這些小鼠自由飲水進食，期間不使用其他藥物或胰島素進行干預(yù)。給藥16周后，檢測相關(guān)指標。

1.3.2 HE染色

石蠟包埋的腎臟組織標本連續(xù)切片，厚度為3μm，65℃烤片1h，脫蠟至水。蘇木素染色7min，1%鹽酸乙醇分色10s，氨水返藍1min，伊紅染色60s。常規(guī)脫水、透明、中性樹脂封片，顯微鏡下觀察并照相。觀察各組小鼠腎臟組織基本病理改變和炎性反應(yīng)情況。

1.3.3 Masson染色

取腎臟組織切片，常規(guī)脫蠟至水后，用配制好的Weigert鐵蘇木精染色液(Weigert鐵蘇木素A/B液等比例混合液)染核7min，流水稍洗，1%鹽酸乙醇稍分化，流水沖洗數(shù)分鐘返藍。麗春紅酸性品紅染色液染色8min，蒸餾水快速沖洗。磷鉬酸溶液處理2min，不用水洗直接用苯胺藍染色液復(fù)染3min。1%冰醋酸處理1min，脫水透明，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察并照相，觀察各組小鼠腎纖維化程度。

1.3.4 Sirius Red染色

取腎臟組織切片，常規(guī)脫蠟至水后，天青石藍染液5min?？辔端?天狼猩紅染液染20min，95%乙醇分化1min。脫水、透明、中性樹脂封片，顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照，觀察各組小鼠腎纖維化程度。

1.3.5 Western blotting

實驗結(jié)束后，將小鼠異氟烷麻醉，迅速取出腎臟，取部分組織加裂解液冰上勻漿，剩余組織迅速轉(zhuǎn)移至-80℃凍存。勻漿液轉(zhuǎn)至4℃預(yù)冷EP管中，冰上放置30min繼續(xù)裂解。4℃，12 000r/min離心20min后，輕取上清液，按BCA法測定各組蛋白濃度。蛋白樣品與3×上樣緩沖液按2∶1(體積比)充分混勻后，于95℃煮沸5min。樣本冰上冷卻后，進行SDS-PAGE電泳，或者-20℃保存。加入用一抗稀釋液適當稀釋的TGF-β1、α-SMA和β-actin抗體，置于4℃孵育過夜。加入HRP標記的二抗，常溫孵育1h。TBST漂洗后，加入ECL顯影液顯影。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 腎臟組織形態(tài)學觀察

各染色結(jié)果顯示，Con組小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)基本正常，無病理學改變；HE染色結(jié)果表明，DN組小鼠腎小球基底膜增厚、系膜擴張、炎細胞浸潤；Masson染色(膠原纖維為藍色)和Sirius Red染色(膠原纖維為紅色)結(jié)果共同表明，DN組小鼠腎小球和組織間隙有大量膠原纖維增生，腎臟組織纖維化嚴重。Cur處理后，小鼠腎臟的組織形態(tài)學和纖維化均得到明顯改善。見圖1(封二)。

2.2 腎臟組織中TGF-β1蛋白表達量的變化

與Con組小鼠比較，DN組小鼠腎臟組織中TGF-β1明顯增多(P<0.05)，Cur處理后，TGF-β1表達下降，與DN組比較，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。見圖2。

與Con組比較，*P<0.05；與DN組比較，#P<0.05圖2 Cur對DN小鼠腎臟組織中TGF-β1蛋白表達的影響

2.3 腎臟組織中α-SMA蛋白表達量的變化

與Con組小鼠比較，DN組小鼠腎臟組織中α-SMA明顯增多(P<0.05)，Cur處理后，α-SMA表達下降，與DN組比較，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。見圖3。

與Con組比較，*P<0.05；與DN組比較，#P<0.05圖3 Cur對DN小鼠腎臟組織中α-SMA蛋白表達的影響

3 討 論

DN作為糖尿病患者最常見且嚴重的慢性微血管并發(fā)癥，也是終末期腎病最常見的病因，是導致其死亡的主要原因之一，近年來受到越來越多的關(guān)注。DN的典型病理特征是細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)蛋白在腎小球和腎小管間質(zhì)過度沉積，最終導致腎小球硬化和間質(zhì)纖維化。腎纖維化是慢性腎臟疾病進展為終末期腎病的病理生理學基礎(chǔ)，并且決定著腎功能的惡化程度[5]。及時阻斷腎纖維化，能夠有效防止DN進展為終末期腎病[6]。

Cur是中藥姜黃中發(fā)揮生物活性的主要成分。在2型DN患者中，給予Cur 500mg/d口服，治療15～30d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cur可明顯減少患者尿微量白蛋白，從而減緩DN的發(fā)展[7]。本課題組前期研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，Cur對糖尿病大鼠心肌纖維化有明顯的改善作用[8]。腎小管上皮細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是DN中肌成纖維細胞的主要來源[9]。已有研究表明，DN患者的腎功能與肌成纖維細胞的數(shù)量呈負相關(guān)[10-11]。在體外研究中發(fā)現(xiàn)[12]，Cur可抑制腎小管上皮細胞EMT。在本研究中，DN小鼠腎臟組織病理改變以及腎纖維化明顯，Cur處理后這些現(xiàn)象得到明顯的改善。

既往研究表明[13]，腎纖維化與TGF-β1和α-SMA密切相關(guān)。TGF-β1是目前公認的強促纖維化因子，TGF-β1信號通路在DN中被激活，抑制TGF-β1可減輕糖尿病動物模型的腎纖維化[14]。α-SMA作為EMT的重要標志，其在腎小管上皮細胞中幾乎不表達，而在肌成纖維細胞中呈特異性表達，是研究上皮細胞EMT及纖維化的重要標記物。有研究表明[15]，DN大鼠腎組織高表達α-SMA，可作為纖維化檢測指標。在本研究中，Western blotting結(jié)果顯示，Cur處理后，DN組小鼠腎臟組織中，TGF-β1和α-SMA蛋白的表達明顯減少。這些結(jié)果表明Cur可以明顯改善DN小鼠腎功能和腎纖維化。

綜上所述，Cur可以改善DN小鼠腎功能和腎纖維化程度，對DN小鼠腎臟具有保護作用，其作用機制可能與Cur降低TGF-β1的表達水平抑制α-SMA的蛋白表達有關(guān)。