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        紫貽貝加工下腳料抗菌肽的分離及其穩(wěn)定性研究

        2021-07-06 08:47:52時(shí)光宇潘淵博趙莘芷徐瓊怡楊玉霞莊黛娜

        時(shí)光宇,張 玥,潘淵博,趙莘芷,徐瓊怡,楊玉霞,莊黛娜

        (浙江海洋大學(xué)東??茖W(xué)技術(shù)學(xué)院,浙江舟山 316000)

        近年來,抗生素的過度使用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性、抗生素殘留等問題日益突出,嚴(yán)重制約著我國水產(chǎn)、畜牧養(yǎng)殖及食品工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]。因此,迫切需要尋找新型的抗生素替代物。抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是生物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一類抵御外源病原體入侵的低分子質(zhì)量肽類物質(zhì)[2],由于具有活性強(qiáng)、安全性高、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn),有望成為化學(xué)防腐劑、抗生素的理想替代品[3]。

        貽貝是一種濾食性底棲海洋生物,長期生活在微生物多樣性和復(fù)雜性的環(huán)境里(菌落總數(shù)為9 lgCFU·mL-1)[4],由于缺乏特異免疫系統(tǒng),抗菌肽成為其抵御外源病原微生物侵襲的重要屏障[5]。目前,從3 種貽貝屬(地中海貽貝Mytilus galloprovincialis、紫貽貝M.edulis 和厚殼貽貝M.coruscus)和1 種股貽貝屬(翡翠貽貝Perna viridis)的血細(xì)胞、鰓和消化腺中鑒定出100 多種抗菌肽,按其序列特征可分為7 個(gè)家族[6],即Myticin、Mytilin、Mytimycin、MGD、Myticusin、big defensins 和Mytimacin。不同生長環(huán)境與發(fā)育階段的貽貝會(huì)分泌不同抗菌肽抵御外源病原微生物的侵襲[7],而不同抗菌肽有著不同的結(jié)構(gòu)和序列,其抑菌活性、理化性質(zhì)及穩(wěn)定性等特征也相應(yīng)存在差異。

        目前,有關(guān)紫貽貝抗菌肽的研究相對較少,如CHARLET,et al[8]從紫貽貝血液中分離鑒定出5 個(gè)抗菌肽,即defensin A(4 314.3 Da)、defensin B(4 392.4 Da)、Mytilin A(3 773.7 Da)、Mytilin B(3 974.3 Da)和Mytimycin(6 233.5 Da);李哲等[9]從紫貽貝肉中提取分離出1 個(gè)抗菌肽(5 908 Da),而宋宏霞[10]從紫貽貝肉的酶解液中分離出1 個(gè)抗菌肽(2 490 Da)。張玥等[11]嘗試?yán)贸曒o助乙酸提取紫貽貝加工下腳料(受損/小規(guī)格紫貽貝)中抗菌肽,結(jié)果表明工藝可行。為了實(shí)際生產(chǎn)中能正確應(yīng)用抗菌肽,需對其抑菌活性、理化性質(zhì)及穩(wěn)定性等特征要有詳細(xì)了解,而抗菌肽的分離純化是抑菌活性、理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)鑒定的基礎(chǔ)。

        多肽分離方法主要有超濾、離子交換色譜、凝膠過濾色譜、超/高效液相色譜、親和色譜等方法。實(shí)際操作中,一般采用2 種或以上分離方法對抗菌肽進(jìn)行分離,從而精確分離目標(biāo)肽[12]。因此,本試驗(yàn)先對紫貽貝加工下腳料粗提抗菌肽的敏感菌進(jìn)行分析,在此基礎(chǔ)上利用固相萃取、凝膠過濾色譜和半制備高效液相色譜(semi-preparative high performance liquid chromatography,半制備RP-HPLC)對其抗菌肽進(jìn)行分離純化,并對純度高、活性強(qiáng)的抗菌肽的相對分子質(zhì)量和穩(wěn)定性進(jìn)行分析,從而為紫貽貝加工下腳料抗菌肽的制備與進(jìn)一步應(yīng)用提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        紫貽貝加工下腳料,舟山市某水產(chǎn)公司提供,受損的和小規(guī)格紫貽貝裝入碎冰泡沫箱。

        大腸桿菌(GIM1.708)、金黃色葡萄球菌(GIM1.178)、枯草芽孢桿菌(GIM1.222),廣東省微生物菌種保藏中心;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,杭州微生物試劑有限公司;Sep-pak C18 固相萃取柱,美國Waters 公司;乙腈,HPLC 級,美國天地公司;三氟乙酸,HPLC 級,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        Waring-8010S 組織搗碎機(jī),美國Waring 公司;SK5210HP 型超聲波清洗器(超聲頻率53 KHz,超聲功率200 W),上??茖?dǎo)超聲儀器有限公司;LGJ-10 型冷凍干燥機(jī),北京松原華興科技發(fā)展有限公司;SPX-150B-Z 型生化培養(yǎng)箱,上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司;AKTA Purifier 10 型蛋白純化儀(配有UV-900 型紫外-可見光檢測器和Unicorn 控制軟件),瑞典安瑪西亞公司;Waters 1525-2998 型半制備液相色譜儀(配有Empower 色譜工作站),美國Waters 公司。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        1.3.1 抗菌肽的制備及敏感菌篩選

        紫貽貝下腳料半解凍后取肉、清洗、瀝干。準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的紫貽貝肉,倒入螺口試劑瓶中,按張玥等[11]紫貽貝下腳料抗菌肽提取工藝進(jìn)行抗菌肽的粗提,上清液凍干后即為紫貽貝粗抗菌肽,按1.3.2 方法測定其多肽含量與得率。

        用20 mmol·L-1pH 4.0 乙酸-乙酸鈉緩沖液分別將紫貽貝粗抗菌肽和頭孢克肟配制成100 mg·mL-1多肽溶液和100 μg·mL-1頭孢克肟溶液,其中100 μg·mL-1孢克肟溶液和20 mmol·L-1pH 4.0 乙酸-乙酸鈉緩沖液分別作為陽性對照和陰性對照。以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌為受試菌,吸取100 μL 0.22 μm 水相微孔濾膜過濾的濾液,采用瓊脂打孔法[11]測定其抑菌活性。

        1.3.2 多肽含量與得率測定

        采用考馬斯亮藍(lán)法[14],以結(jié)晶牛血清蛋白作為標(biāo)樣,采用最小二乘法做結(jié)晶牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(μg·mL-1)與吸光值A(chǔ)595 的線性回歸方程:y=0.003 6x+0.286,相關(guān)系數(shù)R2=0.995 1。吸取1.0 mL 適當(dāng)濃度的多肽溶液,加入5.0 mL 考馬斯亮藍(lán)G-250 試劑,渦流混勻靜置5 min 后于595 nm 下測吸光值。多肽含量(%)=多肽溶液質(zhì)量濃度(μg·mL-1)×多肽溶液體積(mL)×體積稀釋倍數(shù)(n)/(1 000×樣品質(zhì)量(mg));多肽得率(%)=多肽含量(%)×多肽樣品總質(zhì)量(mg)/樣品質(zhì)量或進(jìn)樣多肽質(zhì)量(mg)×100%。

        1.3.3 抑菌活性及殘留率測定

        以敏感菌為指示菌,采用瓊脂打孔法[11]測定各分離組分的抑菌活性,抑菌活性以抑菌圈直徑大小(mm)表示。以20 mmol·L-1pH 4.0 乙酸-乙酸鈉緩沖液作為陰性對照,未經(jīng)處理的抗菌肽溶液作為陽性對照,計(jì)算抑菌活性殘留率,抑菌活性殘留率(%)=(樣品抑菌圈直徑-陰性對照抑菌圈直徑)/(陽性對照抑菌圈直徑-陰性對照抑菌圈直徑)×100%。

        1.3.4 抗菌肽的分離純化

        1.3.4.1 固相萃取

        稱取1.0 g 紫貽貝抗菌肽粗提物,溶解于10 mL 0.1%三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)溶液中,12 000×g離心10 min,上清液在平衡好的Sep-pak C18 固相萃取柱(6 mL、500 mg)進(jìn)行分步洗脫分離。分離條件:上樣體積2 mL,流速2 mL·min-1,階段洗脫順序?yàn)?%、10%、40%、80%乙腈的0.1%TFA 溶液,洗脫體積12 mL,收集各洗脫組分,分別命名為Sp0、Sp10、Sp40 和Sp80。多次重復(fù)上樣洗脫,合并各洗脫液,凍干后按1.3.2 方法測定多肽含量與得率。各洗脫組分用20 mmol·L-1pH 4.0 乙酸-乙酸鈉緩沖液配制成10 mmol·L-1多肽溶液,0.22 μm 水相微孔濾膜過濾備用,按1.3.3 方法測定抑菌活性。

        1.3.4.2 Sephadex G-25 層析

        上述抑菌活性最高組分用超純水配制成10 mg·mL-1多肽溶液,12 000 ×g 離心10 min,上清液在平衡好的Sephadex G-25 凝膠柱(?1.0 cm×60 cm)中進(jìn)行分離。柱層析條件:上樣體積1 mL、流速1.0 mL·min-1、檢測波長220 nm,洗脫液為超純水,收集各色譜峰。多次重復(fù)分離,合并各色譜峰,凍干后按1.3.2 方法測定多肽含量與得率。各色譜峰用20 mmol·L-1pH 4.0 乙酸-乙酸鈉緩沖液配制成10 mg·mL-1多肽溶液,0.22 μm 水相微孔濾膜過濾備用,按1.3.3 方法測定抑菌活性。

        1.3.4.3 半制備RP-HPLC 色譜

        上述抑菌活性最高組分用0.1%三氟乙酸溶液配制成1 mg·mL-1多肽溶液,12 000 ×g 離心10 min,上清液進(jìn)行RP-HPLC 色譜分離。色譜條件:SunfireTM C18 色譜柱(?19 mm×250 mm,5 μm),檢測波長220 nm,柱溫25 ℃,流動(dòng)相為乙腈(含0.1%TFA)和0.1%TFA,流速1.0 mL·min-1,上樣體積100 μL;線性梯度洗脫模式,60 min 內(nèi)乙腈體積分?jǐn)?shù)從10%升至40%。多次重復(fù)分離,合并收集各色譜峰,凍干后按1.3.2 方法測定多肽含量與得率,各色譜峰用20 mmol·L-1pH 4.0 乙酸-乙酸鈉緩沖液將多肽粉配制成1 mg·mL-1多肽溶液,0.22 μm 水相微孔濾膜過濾備用,按1.3.3 方法測定抑菌活性。

        1.3.5 穩(wěn)定性分析

        1.3.5.1 溫度

        用20 mmol·L-1pH 4.0 乙酸-乙酸鈉緩沖液將HPLC 分離獲得組分單一、活性強(qiáng)的抗菌肽配制成1 mg·mL-1多肽溶液,800 μL 多肽溶液分裝于離心管內(nèi),分別在40、60、80、100 ℃條件下處理10 min 和20 min,冰水冷卻,12 000 ×g 離心10 min,按1.3.3 方法測定其殘留活性,未經(jīng)熱處理多肽溶液作為陽性對照。

        1.3.5.2 反復(fù)凍融

        用20 mmol·L-1pH 4.0 乙酸-乙酸鈉緩沖液將HPLC 分離獲得組分單一、活性強(qiáng)的抗菌肽配制成1 mg·mL-1多肽溶液,800 μL 多肽溶液分裝于離心管內(nèi),置于-18 ℃冰箱中反復(fù)凍融2、4、8、12、16 次(冷凍30 min/次,25 ℃水浴30 min/次),12 000 ×g 離心10 min,按1.3.3 方法測定其殘留活性,未經(jīng)凍融處理的多肽溶液作為陽性對照。

        1.3.5.3 蛋白酶

        分別用20 mmol·L-1的pH 4.0 乙酸-乙酸鈉緩沖液、20 mmol·L-1的pH 7.5 和pH 8.0 PBS 緩沖液將HPLC 分離獲得組分單一、活性強(qiáng)的抗菌肽配制成1 mg·mL-1多肽溶液;胃蛋白酶、蛋白酶K 和胰蛋白酶也分別用20 mmol·L-1的pH 4.0 乙酸-乙酸鈉緩沖液、20 mmol·L-1的pH 7.5 和pH 8.0 PBS 緩沖液配制成2.5 mg·mL-1酶溶液。分別吸取200 μL 多肽溶液和40 μL 蛋白酶溶液于1.5 mL 離心管內(nèi),胰蛋白酶和胃蛋白酶水解溫度為37 ℃、蛋白酶K 酶解溫度為42 ℃,水解時(shí)間為90 min,待水解結(jié)束后于85 ℃水浴15 min[13],冰水冷卻,12 000 ×g 離心10 min,按1.3.3 方法測定其殘留活性,以未經(jīng)酶處理的多肽溶液作為陽性對照。

        1.3.6 相對分子質(zhì)量測定

        采用凝膠過濾色譜法(gel filtration chromatography,GPC)對HPLC 分離獲得組分單一、活性強(qiáng)的抗菌肽的相對分子質(zhì)量進(jìn)行測定。色譜條件:色譜柱Ultrahydrogel 250(7.8 mm×300 mm)串聯(lián)Ultrahydrogel 100(7.8 mm×300 mm),流動(dòng)相50 mmol·L-1PBS(含100 mmol·L-1NaCl,pH 6.8),洗脫速率1.0 mL·min-1,柱溫25 ℃,檢測波長220 nm,上樣質(zhì)量濃度1 mg·mL-1,上樣體積50 μL。采用細(xì)胞色素C(12.4 kDa)、抑肽酶(6.5 kDa)、維生素B12(1.35 kDa)、Tyr-Phe-Glu(457 Da)作為標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量物質(zhì),LgMr 與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)洗脫時(shí)間的線性回歸方程為:LgMr=6.956 9-0.207 2x,相關(guān)系數(shù)R2=0.998 9。

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        利用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及差異性分析,試驗(yàn)結(jié)果以xˉ±S 表示,P<0.05 差異顯著;采用OriginPro 9.1 軟件進(jìn)行繪圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 敏感菌的篩選

        經(jīng)超聲輔助乙酸提取與冷凍干燥后,紫貽貝加工下腳料抗菌肽粗提物凍干粉呈淡黃色粉末,經(jīng)計(jì)算其得率為(1.55±0.04)%。紫貽貝抗菌肽粗提物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有抑菌活性,其抑菌活性分別達(dá)到陽性對照的88.06%和33.21%(表1);而抗菌肽粗提物對枯草芽胞桿菌無抑菌效果(抑菌圈直徑<2 mm),這與CHANDRAN,et al[15]的研究結(jié)果相一致,表明抗菌肽的抑菌活性具有選擇性和特異性。因此,后續(xù)試驗(yàn)選用金黃色葡萄球菌作為敏感指示菌。

        表1 紫貽貝粗抗菌肽的抑菌活性Tab.1 Antimicrobial activity of crude antimicrobial peptides from M.edulis by-products

        2.2 分離純化

        2.2.1 固相萃取

        固相萃取因其簡單、方便而廣泛被應(yīng)用于多肽和蛋白的富集純化[16]。由圖1 可知,Sp40 和Sp80 洗脫組分具有抑菌活性,而Sp0 和Sp10 洗脫組分無抑菌活性,這與DEFER,et al[17]的研究結(jié)果相似。其中,Sp40洗脫組分的抑菌活性最高,抑菌圈直徑為(11.38±1.59)mm,且其得率相對較高(30.83%)。同時(shí),Sp40 洗脫組分具有兩親性和一定程度的疏水性,可能為蛋白或肽類[3]。為驗(yàn)證其是否為抗菌肽,利用凝膠過濾層析對Sp40 洗脫組分進(jìn)行進(jìn)一步分離。

        圖1 固相萃取洗脫組分的抑菌活性與得率Fig.1 Antimicrobial activity and yield of solid phase extraction fractions of crude peptides from M.edulis by-products

        2.2.2 Sephadex G-25 層析

        凝膠過濾層析是活性肽分離純化的簡單常用方法[18]。Sp40 洗脫組分經(jīng)Sephadex G-25 凝膠過濾層析分離,色譜結(jié)果和抑菌活性見圖2。色譜圖中出現(xiàn)4 個(gè)洗脫峰,其中峰2(命名為Sp40-2 組分)具有抑菌活性,其抑菌圈直徑為(23.19±3.82)mm,表明Sp40 洗脫組分中抑菌活性成分為多肽。另外,相同劑量下Sp40-2 組分比Sp40 洗脫組分的抑菌活性更強(qiáng)(P<0.05),說明SephadexG-25 對其抗菌肽純化是有效的。為進(jìn)一步獲得抑菌活性和純度相對較高的抗菌肽,采用半制備RP-HPLC 色譜對Sp40-2 組分進(jìn)行進(jìn)一步分離。

        圖2 Sp40 洗脫組分的Sephadex G-25 層析色譜圖及分離峰抑菌活性Fig.2 Sephadex G-25 chromatogram of fraction Sp40 and antimicrobial activity of its separate peaks

        2.2.3 半制備RP-HPLC 色譜

        圖3 顯示,Sp40-2 組分經(jīng)半制備RP-HPLC 色譜分離后僅有峰4 和峰段5(分別命名為Sp40-2-4 和Sp40-2-5)具有抑菌活性(抑菌圈直徑分別為(33.26±4.35)mm 和(32.83±5.04)mm),其抑菌活性顯著高于其抗菌肽粗提物(P<0.05)。Sp40-2-4 和Sp40-2-5 的抑菌活性無顯著性差異(P>0.05),表明其抑菌活性不僅與其疏水性有關(guān)[19],也與其肽鏈組成與結(jié)構(gòu)有關(guān)[20]。盡管Sp40-2-4 組分得率低于Sp40-2-5 組分,但Sp40-2-4 組分純度(圖4)和水溶解性均高于Sp40-2-5 組分。同時(shí),圖4 表明Sp40-2-4 組分為單一色譜峰,其相對分子質(zhì)量約為1 970.78 Da,與已報(bào)道紫貽貝抗菌肽相對分子質(zhì)量均不同[8-10]。鑒于此,后續(xù)試驗(yàn)著重研究Sp40-2-4 組分的穩(wěn)定性。

        圖3 Sp40-2 組分的半制備RP-HPLC 色譜圖及各分離峰/段的抑菌活性Fig.3 Semi-preparative RP-HPLC chromatogram of fraction Sp40-2 on C18 preparative column and antimicrobial activity of its separate peaks

        圖4 Sp40-2-4 組分的GPC 色譜圖Fig.4 Gel filtration chromatogram of fraction Sp40-2-4

        2.3 Sp40-2-4 組分穩(wěn)定性研究

        2.3.1 溫度

        圖5 顯示,隨著處理溫度升高和作用時(shí)間延長,Sp40-2-4 組分的抑菌活性殘留率逐漸降低。當(dāng)溫度≥100 ℃時(shí),隨著作用時(shí)間延長,Sp40-2-4 組分的抑菌活性殘留率顯著降低(P<0.05),這與HAUG,et al[4]研究的偏頂蛤乙腈提取物熱穩(wěn)定性結(jié)果相似,抑菌活性降低可能由于高溫破壞了Sp40-2-4 組分的多肽分子結(jié)構(gòu)[21]。李哲等[9]從紫貽貝中分離獲得的抗菌肽經(jīng)100 ℃加熱20 min 后其抑菌活性基本喪失,而Sp40-2-4 組分抑菌活性殘留率達(dá)72.42%,表明Sp40-2-4 組分具有一定的熱穩(wěn)定性,而且Sp40-2-4組分與其組成與結(jié)構(gòu)不同。

        圖5 溫度對Sp40-2-4 組分抑菌活性的影響Fig.5 Effect of temperature on the antimicrobial activity of fraction Sp40-2-4

        2.3.2 反復(fù)凍融

        從圖6 可看出,當(dāng)凍融次數(shù)≤10,Sp40-2-4 組分的抑菌活性殘留率無顯著降低(P>0.05),殘留率為91.42%以上;而凍融次數(shù)≥12 時(shí),其抑菌活性殘留率顯著降低(P<0.05),其中反復(fù)凍融16 次后其抑菌活性殘留率降至57.49%,這與亞洲飛蝗抗菌肽的反復(fù)凍融結(jié)果相一致[22]。反復(fù)凍融會(huì)影響Sp40-2-4 組分多肽的結(jié)構(gòu)和溶解性(離心管底部有沉淀),最終導(dǎo)致其抑菌活性降低。由此可知,當(dāng)凍融次數(shù)≤10 時(shí),Sp40-2-4 組分對反復(fù)凍融有一定的耐受性。

        圖6 反復(fù)凍融對Sp40-2-4 組分抑菌活性的影響Fig.6 Effect of freeze-thaw cycles on the antimicrobial activity of fraction Sp40-2-4

        2.3.3 蛋白酶

        圖7 反映了Sp40-2-4 組分經(jīng)3 種蛋白酶處理后其抑菌活性殘留率的變化情況。經(jīng)胃蛋白酶處理后,Sp40-2-4 組分抑菌活性殘留率降至75.59%,這表明Sp40-2-4 組分具有一定的抗胃蛋白酶水解能力;而分別經(jīng)胰蛋白酶、蛋白酶K 處理后,其抑菌活性殘留率分別降至9.91%和8.93%,其抑菌活性基本喪失,表明Sp40-2-4 組分具有胰蛋白酶和蛋白酶K 的酶切位點(diǎn),易被水解而失去抑菌活性。由此可知,Sp40-2-4組分對胃蛋白酶具有一定的耐受性,而對胰蛋白酶和蛋白酶K 的耐受性較差。

        圖7 蛋白酶對Sp40-2-4 組分抑菌活性的影響Fig.7 Effect of protease on the antimicrobial activity of fraction Sp40-2-4

        3 結(jié)論

        本試驗(yàn)首先分析了紫貽貝加工下腳料粗提抗菌肽的敏感菌,結(jié)果顯示,金黃色葡萄球菌為最敏感菌株。在此基礎(chǔ)上,采用固相萃取、Sephadex G-25 和半制備型RP-HPLC 對其抗菌肽進(jìn)行分離純化,獲得2 個(gè)具有較高抑菌活性的組分Sp40-2-4 和Sp40-2-5,其抑菌圈直徑分別為(33.26±4.35)mm 和(32.83±5.04)mm(P>0.05);GPC 顯示Sp40-2-4 組分為單一色譜峰,其相對分子質(zhì)量約為1 970.78 Da。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明Sp40-2-4 組分具有一定的熱穩(wěn)定性(100 ℃、20 min,抑菌活性殘留率72.42%),對反復(fù)凍融(凍融次數(shù)≤10,抑菌活性殘留率91.42%以上)和胃蛋白酶(抑菌活性殘留率75.59%)有一定的耐受性;而對胰蛋白酶和蛋白酶K耐受性差(抑菌活性殘留率10%以下)。

        綜上所述,Sp40-2-4 組分有被用于食品防腐的可能性,但其穩(wěn)定性還有待提高,可嘗試在分子水平上對其進(jìn)行改良提高其穩(wěn)定性。本研究說明在紫貽貝加工下腳料中存在具有抑菌活性的多肽,且經(jīng)過逐步分離可獲得高抑菌活性的多肽成分,從而為其抗菌肽的開發(fā)及相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

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