時(shí)光宇，張 玥，潘淵博，趙莘芷，徐瓊怡，楊玉霞，莊黛娜

（浙江海洋大學(xué)東?？茖W(xué)技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316000）

近年來，抗生素的過度使用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性、抗生素殘留等問題日益突出，嚴(yán)重制約著我國水產(chǎn)、畜牧養(yǎng)殖及食品工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]。因此，迫切需要尋找新型的抗生素替代物。抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是生物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一類抵御外源病原體入侵的低分子質(zhì)量肽類物質(zhì)[2]，由于具有活性強(qiáng)、安全性高、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，有望成為化學(xué)防腐劑、抗生素的理想替代品[3]。

貽貝是一種濾食性底棲海洋生物，長期生活在微生物多樣性和復(fù)雜性的環(huán)境里（菌落總數(shù)為9 lgCFU·mL-1）[4]，由于缺乏特異免疫系統(tǒng)，抗菌肽成為其抵御外源病原微生物侵襲的重要屏障[5]。目前，從3 種貽貝屬（地中海貽貝Mytilus galloprovincialis、紫貽貝M.edulis 和厚殼貽貝M.coruscus）和1 種股貽貝屬（翡翠貽貝Perna viridis）的血細(xì)胞、鰓和消化腺中鑒定出100 多種抗菌肽，按其序列特征可分為7 個(gè)家族[6]，即Myticin、Mytilin、Mytimycin、MGD、Myticusin、big defensins 和Mytimacin。不同生長環(huán)境與發(fā)育階段的貽貝會(huì)分泌不同抗菌肽抵御外源病原微生物的侵襲[7]，而不同抗菌肽有著不同的結(jié)構(gòu)和序列，其抑菌活性、理化性質(zhì)及穩(wěn)定性等特征也相應(yīng)存在差異。

目前，有關(guān)紫貽貝抗菌肽的研究相對較少，如CHARLET,et al[8]從紫貽貝血液中分離鑒定出5 個(gè)抗菌肽，即defensin A（4 314.3 Da）、defensin B（4 392.4 Da）、Mytilin A（3 773.7 Da）、Mytilin B（3 974.3 Da）和Mytimycin（6 233.5 Da）；李哲等[9]從紫貽貝肉中提取分離出1 個(gè)抗菌肽（5 908 Da），而宋宏霞[10]從紫貽貝肉的酶解液中分離出1 個(gè)抗菌肽（2 490 Da）。張玥等[11]嘗試?yán)贸曒o助乙酸提取紫貽貝加工下腳料（受損/小規(guī)格紫貽貝）中抗菌肽，結(jié)果表明工藝可行。為了實(shí)際生產(chǎn)中能正確應(yīng)用抗菌肽，需對其抑菌活性、理化性質(zhì)及穩(wěn)定性等特征要有詳細(xì)了解，而抗菌肽的分離純化是抑菌活性、理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)鑒定的基礎(chǔ)。

多肽分離方法主要有超濾、離子交換色譜、凝膠過濾色譜、超/高效液相色譜、親和色譜等方法。實(shí)際操作中，一般采用2 種或以上分離方法對抗菌肽進(jìn)行分離，從而精確分離目標(biāo)肽[12]。因此，本試驗(yàn)先對紫貽貝加工下腳料粗提抗菌肽的敏感菌進(jìn)行分析，在此基礎(chǔ)上利用固相萃取、凝膠過濾色譜和半制備高效液相色譜（semi-preparative high performance liquid chromatography，半制備RP-HPLC）對其抗菌肽進(jìn)行分離純化，并對純度高、活性強(qiáng)的抗菌肽的相對分子質(zhì)量和穩(wěn)定性進(jìn)行分析，從而為紫貽貝加工下腳料抗菌肽的制備與進(jìn)一步應(yīng)用提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫貽貝加工下腳料，舟山市某水產(chǎn)公司提供，受損的和小規(guī)格紫貽貝裝入碎冰泡沫箱。

大腸桿菌（GIM1.708）、金黃色葡萄球菌（GIM1.178）、枯草芽孢桿菌（GIM1.222），廣東省微生物菌種保藏中心；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，杭州微生物試劑有限公司；Sep-pak C18 固相萃取柱，美國Waters 公司；乙腈，HPLC 級，美國天地公司；三氟乙酸，HPLC 級，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Waring-8010S 組織搗碎機(jī)，美國Waring 公司；SK5210HP 型超聲波清洗器（超聲頻率53 KHz，超聲功率200 W），上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；LGJ-10 型冷凍干燥機(jī)，北京松原華興科技發(fā)展有限公司；SPX-150B-Z 型生化培養(yǎng)箱，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；AKTA Purifier 10 型蛋白純化儀（配有UV-900 型紫外-可見光檢測器和Unicorn 控制軟件），瑞典安瑪西亞公司；Waters 1525-2998 型半制備液相色譜儀（配有Empower 色譜工作站），美國Waters 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 抗菌肽的制備及敏感菌篩選

紫貽貝下腳料半解凍后取肉、清洗、瀝干。準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的紫貽貝肉，倒入螺口試劑瓶中，按張玥等[11]紫貽貝下腳料抗菌肽提取工藝進(jìn)行抗菌肽的粗提，上清液凍干后即為紫貽貝粗抗菌肽，按1.3.2 方法測定其多肽含量與得率。

用20 mmol·L-1pH 4.0 乙酸-乙酸鈉緩沖液分別將紫貽貝粗抗菌肽和頭孢克肟配制成100 mg·mL-1多肽溶液和100 μg·mL-1頭孢克肟溶液，其中100 μg·mL-1孢克肟溶液和20 mmol·L-1pH 4.0 乙酸-乙酸鈉緩沖液分別作為陽性對照和陰性對照。以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌為受試菌，吸取100 μL 0.22 μm 水相微孔濾膜過濾的濾液，采用瓊脂打孔法[11]測定其抑菌活性。

1.3.2 多肽含量與得率測定

采用考馬斯亮藍(lán)法[14]，以結(jié)晶牛血清蛋白作為標(biāo)樣，采用最小二乘法做結(jié)晶牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（μg·mL-1）與吸光值A(chǔ)595 的線性回歸方程：y=0.003 6x+0.286，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 1。吸取1.0 mL 適當(dāng)濃度的多肽溶液，加入5.0 mL 考馬斯亮藍(lán)G-250 試劑，渦流混勻靜置5 min 后于595 nm 下測吸光值。多肽含量（%）=多肽溶液質(zhì)量濃度（μg·mL-1）×多肽溶液體積（mL）×體積稀釋倍數(shù)（n）/（1 000×樣品質(zhì)量（mg））；多肽得率（%）=多肽含量（%）×多肽樣品總質(zhì)量（mg）/樣品質(zhì)量或進(jìn)樣多肽質(zhì)量（mg）×100%。

1.3.3 抑菌活性及殘留率測定

以敏感菌為指示菌，采用瓊脂打孔法[11]測定各分離組分的抑菌活性，抑菌活性以抑菌圈直徑大小（mm）表示。以20 mmol·L-1pH 4.0 乙酸-乙酸鈉緩沖液作為陰性對照，未經(jīng)處理的抗菌肽溶液作為陽性對照，計(jì)算抑菌活性殘留率，抑菌活性殘留率（%）=（樣品抑菌圈直徑-陰性對照抑菌圈直徑）/（陽性對照抑菌圈直徑-陰性對照抑菌圈直徑）×100%。

1.3.4 抗菌肽的分離純化

1.3.4.1 固相萃取

稱取1.0 g 紫貽貝抗菌肽粗提物，溶解于10 mL 0.1%三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）溶液中，12 000×g離心10 min，上清液在平衡好的Sep-pak C18 固相萃取柱（6 mL、500 mg）進(jìn)行分步洗脫分離。分離條件：上樣體積2 mL，流速2 mL·min-1，階段洗脫順序?yàn)?%、10%、40%、80%乙腈的0.1%TFA 溶液，洗脫體積12 mL，收集各洗脫組分，分別命名為Sp0、Sp10、Sp40 和Sp80。多次重復(fù)上樣洗脫，合并各洗脫液，凍干后按1.3.2 方法測定多肽含量與得率。各洗脫組分用20 mmol·L-1pH 4.0 乙酸-乙酸鈉緩沖液配制成10 mmol·L-1多肽溶液，0.22 μm 水相微孔濾膜過濾備用，按1.3.3 方法測定抑菌活性。

1.3.4.2 Sephadex G-25 層析

上述抑菌活性最高組分用超純水配制成10 mg·mL-1多肽溶液，12 000 ×g 離心10 min，上清液在平衡好的Sephadex G-25 凝膠柱（?1.0 cm×60 cm）中進(jìn)行分離。柱層析條件：上樣體積1 mL、流速1.0 mL·min-1、檢測波長220 nm，洗脫液為超純水，收集各色譜峰。多次重復(fù)分離，合并各色譜峰，凍干后按1.3.2 方法測定多肽含量與得率。各色譜峰用20 mmol·L-1pH 4.0 乙酸-乙酸鈉緩沖液配制成10 mg·mL-1多肽溶液，0.22 μm 水相微孔濾膜過濾備用，按1.3.3 方法測定抑菌活性。

1.3.4.3 半制備RP-HPLC 色譜

上述抑菌活性最高組分用0.1%三氟乙酸溶液配制成1 mg·mL-1多肽溶液，12 000 ×g 離心10 min，上清液進(jìn)行RP-HPLC 色譜分離。色譜條件：SunfireTM C18 色譜柱（?19 mm×250 mm，5 μm），檢測波長220 nm，柱溫25 ℃，流動(dòng)相為乙腈（含0.1%TFA）和0.1%TFA，流速1.0 mL·min-1，上樣體積100 μL；線性梯度洗脫模式，60 min 內(nèi)乙腈體積分?jǐn)?shù)從10%升至40%。多次重復(fù)分離，合并收集各色譜峰，凍干后按1.3.2 方法測定多肽含量與得率，各色譜峰用20 mmol·L-1pH 4.0 乙酸-乙酸鈉緩沖液將多肽粉配制成1 mg·mL-1多肽溶液，0.22 μm 水相微孔濾膜過濾備用，按1.3.3 方法測定抑菌活性。

1.3.5 穩(wěn)定性分析

1.3.5.1 溫度

用20 mmol·L-1pH 4.0 乙酸-乙酸鈉緩沖液將HPLC 分離獲得組分單一、活性強(qiáng)的抗菌肽配制成1 mg·mL-1多肽溶液，800 μL 多肽溶液分裝于離心管內(nèi)，分別在40、60、80、100 ℃條件下處理10 min 和20 min，冰水冷卻，12 000 ×g 離心10 min，按1.3.3 方法測定其殘留活性，未經(jīng)熱處理多肽溶液作為陽性對照。

1.3.5.2 反復(fù)凍融

用20 mmol·L-1pH 4.0 乙酸-乙酸鈉緩沖液將HPLC 分離獲得組分單一、活性強(qiáng)的抗菌肽配制成1 mg·mL-1多肽溶液，800 μL 多肽溶液分裝于離心管內(nèi)，置于-18 ℃冰箱中反復(fù)凍融2、4、8、12、16 次（冷凍30 min/次，25 ℃水浴30 min/次），12 000 ×g 離心10 min，按1.3.3 方法測定其殘留活性，未經(jīng)凍融處理的多肽溶液作為陽性對照。

1.3.5.3 蛋白酶

分別用20 mmol·L-1的pH 4.0 乙酸-乙酸鈉緩沖液、20 mmol·L-1的pH 7.5 和pH 8.0 PBS 緩沖液將HPLC 分離獲得組分單一、活性強(qiáng)的抗菌肽配制成1 mg·mL-1多肽溶液；胃蛋白酶、蛋白酶K 和胰蛋白酶也分別用20 mmol·L-1的pH 4.0 乙酸-乙酸鈉緩沖液、20 mmol·L-1的pH 7.5 和pH 8.0 PBS 緩沖液配制成2.5 mg·mL-1酶溶液。分別吸取200 μL 多肽溶液和40 μL 蛋白酶溶液于1.5 mL 離心管內(nèi)，胰蛋白酶和胃蛋白酶水解溫度為37 ℃、蛋白酶K 酶解溫度為42 ℃，水解時(shí)間為90 min，待水解結(jié)束后于85 ℃水浴15 min[13]，冰水冷卻，12 000 ×g 離心10 min，按1.3.3 方法測定其殘留活性，以未經(jīng)酶處理的多肽溶液作為陽性對照。

1.3.6 相對分子質(zhì)量測定

采用凝膠過濾色譜法（gel filtration chromatography，GPC）對HPLC 分離獲得組分單一、活性強(qiáng)的抗菌肽的相對分子質(zhì)量進(jìn)行測定。色譜條件：色譜柱Ultrahydrogel 250（7.8 mm×300 mm）串聯(lián)Ultrahydrogel 100（7.8 mm×300 mm），流動(dòng)相50 mmol·L-1PBS（含100 mmol·L-1NaCl，pH 6.8），洗脫速率1.0 mL·min-1，柱溫25 ℃，檢測波長220 nm，上樣質(zhì)量濃度1 mg·mL-1，上樣體積50 μL。采用細(xì)胞色素C（12.4 kDa）、抑肽酶（6.5 kDa）、維生素B12（1.35 kDa）、Tyr-Phe-Glu（457 Da）作為標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量物質(zhì)，LgMr 與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)洗脫時(shí)間的線性回歸方程為：LgMr=6.956 9-0.207 2x，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 9。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及差異性分析，試驗(yàn)結(jié)果以xˉ±S 表示，P＜0.05 差異顯著；采用OriginPro 9.1 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 敏感菌的篩選

經(jīng)超聲輔助乙酸提取與冷凍干燥后，紫貽貝加工下腳料抗菌肽粗提物凍干粉呈淡黃色粉末，經(jīng)計(jì)算其得率為（1.55±0.04）%。紫貽貝抗菌肽粗提物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有抑菌活性，其抑菌活性分別達(dá)到陽性對照的88.06%和33.21%（表1）；而抗菌肽粗提物對枯草芽胞桿菌無抑菌效果（抑菌圈直徑＜2 mm），這與CHANDRAN,et al[15]的研究結(jié)果相一致，表明抗菌肽的抑菌活性具有選擇性和特異性。因此，后續(xù)試驗(yàn)選用金黃色葡萄球菌作為敏感指示菌。

表1 紫貽貝粗抗菌肽的抑菌活性Tab.1 Antimicrobial activity of crude antimicrobial peptides from M.edulis by-products

2.2 分離純化

2.2.1 固相萃取

固相萃取因其簡單、方便而廣泛被應(yīng)用于多肽和蛋白的富集純化[16]。由圖1 可知，Sp40 和Sp80 洗脫組分具有抑菌活性，而Sp0 和Sp10 洗脫組分無抑菌活性，這與DEFER,et al[17]的研究結(jié)果相似。其中，Sp40洗脫組分的抑菌活性最高，抑菌圈直徑為（11.38±1.59）mm，且其得率相對較高（30.83%）。同時(shí)，Sp40 洗脫組分具有兩親性和一定程度的疏水性，可能為蛋白或肽類[3]。為驗(yàn)證其是否為抗菌肽，利用凝膠過濾層析對Sp40 洗脫組分進(jìn)行進(jìn)一步分離。

圖1 固相萃取洗脫組分的抑菌活性與得率Fig.1 Antimicrobial activity and yield of solid phase extraction fractions of crude peptides from M.edulis by-products

2.2.2 Sephadex G-25 層析

凝膠過濾層析是活性肽分離純化的簡單常用方法[18]。Sp40 洗脫組分經(jīng)Sephadex G-25 凝膠過濾層析分離，色譜結(jié)果和抑菌活性見圖2。色譜圖中出現(xiàn)4 個(gè)洗脫峰，其中峰2（命名為Sp40-2 組分）具有抑菌活性，其抑菌圈直徑為（23.19±3.82）mm，表明Sp40 洗脫組分中抑菌活性成分為多肽。另外，相同劑量下Sp40-2 組分比Sp40 洗脫組分的抑菌活性更強(qiáng)（P＜0.05），說明SephadexG-25 對其抗菌肽純化是有效的。為進(jìn)一步獲得抑菌活性和純度相對較高的抗菌肽，采用半制備RP-HPLC 色譜對Sp40-2 組分進(jìn)行進(jìn)一步分離。

圖2 Sp40 洗脫組分的Sephadex G-25 層析色譜圖及分離峰抑菌活性Fig.2 Sephadex G-25 chromatogram of fraction Sp40 and antimicrobial activity of its separate peaks

2.2.3 半制備RP-HPLC 色譜

圖3 顯示，Sp40-2 組分經(jīng)半制備RP-HPLC 色譜分離后僅有峰4 和峰段5（分別命名為Sp40-2-4 和Sp40-2-5）具有抑菌活性（抑菌圈直徑分別為（33.26±4.35）mm 和（32.83±5.04）mm），其抑菌活性顯著高于其抗菌肽粗提物（P＜0.05）。Sp40-2-4 和Sp40-2-5 的抑菌活性無顯著性差異（P＞0.05），表明其抑菌活性不僅與其疏水性有關(guān)[19]，也與其肽鏈組成與結(jié)構(gòu)有關(guān)[20]。盡管Sp40-2-4 組分得率低于Sp40-2-5 組分，但Sp40-2-4 組分純度（圖4）和水溶解性均高于Sp40-2-5 組分。同時(shí)，圖4 表明Sp40-2-4 組分為單一色譜峰，其相對分子質(zhì)量約為1 970.78 Da，與已報(bào)道紫貽貝抗菌肽相對分子質(zhì)量均不同[8-10]。鑒于此，后續(xù)試驗(yàn)著重研究Sp40-2-4 組分的穩(wěn)定性。

圖3 Sp40-2 組分的半制備RP-HPLC 色譜圖及各分離峰/段的抑菌活性Fig.3 Semi-preparative RP-HPLC chromatogram of fraction Sp40-2 on C18 preparative column and antimicrobial activity of its separate peaks

圖4 Sp40-2-4 組分的GPC 色譜圖Fig.4 Gel filtration chromatogram of fraction Sp40-2-4

2.3 Sp40-2-4 組分穩(wěn)定性研究

2.3.1 溫度

圖5 顯示，隨著處理溫度升高和作用時(shí)間延長，Sp40-2-4 組分的抑菌活性殘留率逐漸降低。當(dāng)溫度≥100 ℃時(shí)，隨著作用時(shí)間延長，Sp40-2-4 組分的抑菌活性殘留率顯著降低（P＜0.05），這與HAUG,et al[4]研究的偏頂蛤乙腈提取物熱穩(wěn)定性結(jié)果相似，抑菌活性降低可能由于高溫破壞了Sp40-2-4 組分的多肽分子結(jié)構(gòu)[21]。李哲等[9]從紫貽貝中分離獲得的抗菌肽經(jīng)100 ℃加熱20 min 后其抑菌活性基本喪失，而Sp40-2-4 組分抑菌活性殘留率達(dá)72.42%，表明Sp40-2-4 組分具有一定的熱穩(wěn)定性，而且Sp40-2-4組分與其組成與結(jié)構(gòu)不同。

圖5 溫度對Sp40-2-4 組分抑菌活性的影響Fig.5 Effect of temperature on the antimicrobial activity of fraction Sp40-2-4

2.3.2 反復(fù)凍融

從圖6 可看出，當(dāng)凍融次數(shù)≤10，Sp40-2-4 組分的抑菌活性殘留率無顯著降低（P＞0.05），殘留率為91.42%以上；而凍融次數(shù)≥12 時(shí)，其抑菌活性殘留率顯著降低（P＜0.05），其中反復(fù)凍融16 次后其抑菌活性殘留率降至57.49%，這與亞洲飛蝗抗菌肽的反復(fù)凍融結(jié)果相一致[22]。反復(fù)凍融會(huì)影響Sp40-2-4 組分多肽的結(jié)構(gòu)和溶解性（離心管底部有沉淀），最終導(dǎo)致其抑菌活性降低。由此可知，當(dāng)凍融次數(shù)≤10 時(shí)，Sp40-2-4 組分對反復(fù)凍融有一定的耐受性。

圖6 反復(fù)凍融對Sp40-2-4 組分抑菌活性的影響Fig.6 Effect of freeze-thaw cycles on the antimicrobial activity of fraction Sp40-2-4

2.3.3 蛋白酶

圖7 反映了Sp40-2-4 組分經(jīng)3 種蛋白酶處理后其抑菌活性殘留率的變化情況。經(jīng)胃蛋白酶處理后，Sp40-2-4 組分抑菌活性殘留率降至75.59%，這表明Sp40-2-4 組分具有一定的抗胃蛋白酶水解能力；而分別經(jīng)胰蛋白酶、蛋白酶K 處理后，其抑菌活性殘留率分別降至9.91%和8.93%，其抑菌活性基本喪失，表明Sp40-2-4 組分具有胰蛋白酶和蛋白酶K 的酶切位點(diǎn)，易被水解而失去抑菌活性。由此可知，Sp40-2-4組分對胃蛋白酶具有一定的耐受性，而對胰蛋白酶和蛋白酶K 的耐受性較差。

圖7 蛋白酶對Sp40-2-4 組分抑菌活性的影響Fig.7 Effect of protease on the antimicrobial activity of fraction Sp40-2-4

3 結(jié)論

本試驗(yàn)首先分析了紫貽貝加工下腳料粗提抗菌肽的敏感菌，結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌為最敏感菌株。在此基礎(chǔ)上，采用固相萃取、Sephadex G-25 和半制備型RP-HPLC 對其抗菌肽進(jìn)行分離純化，獲得2 個(gè)具有較高抑菌活性的組分Sp40-2-4 和Sp40-2-5，其抑菌圈直徑分別為（33.26±4.35）mm 和（32.83±5.04）mm（P＞0.05）；GPC 顯示Sp40-2-4 組分為單一色譜峰，其相對分子質(zhì)量約為1 970.78 Da。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明Sp40-2-4 組分具有一定的熱穩(wěn)定性（100 ℃、20 min，抑菌活性殘留率72.42%），對反復(fù)凍融（凍融次數(shù)≤10，抑菌活性殘留率91.42%以上）和胃蛋白酶（抑菌活性殘留率75.59%）有一定的耐受性；而對胰蛋白酶和蛋白酶K耐受性差（抑菌活性殘留率10%以下）。

綜上所述，Sp40-2-4 組分有被用于食品防腐的可能性，但其穩(wěn)定性還有待提高，可嘗試在分子水平上對其進(jìn)行改良提高其穩(wěn)定性。本研究說明在紫貽貝加工下腳料中存在具有抑菌活性的多肽，且經(jīng)過逐步分離可獲得高抑菌活性的多肽成分，從而為其抗菌肽的開發(fā)及相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。