鄭敏娜， 梁秀芝， 韓志順， 康佳惠， 陳燕妮

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)高寒區(qū)作物研究所， 山西 大同 037008)

大同盆地是我國(guó)北方農(nóng)牧交錯(cuò)帶的北界和雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)的下限區(qū)，是較典型的生態(tài)脆弱區(qū)，該區(qū)域蘇打型鹽堿地面積占比較大，蘇打含量高，但土地資源豐富，具有開發(fā)潛力，是農(nóng)牧業(yè)發(fā)展的優(yōu)先區(qū)域。據(jù)21年世紀(jì)初的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，隨著地下水位的整體下降，土壤鹽堿程度有所降低，但現(xiàn)存的蘇打型鹽堿地仍達(dá)到13.25 萬hm2，并且主要集中分布在山西省北部的大同盆地，這部分土壤養(yǎng)分含量低、保水保墑能力差、生產(chǎn)力低下，嚴(yán)重影響該區(qū)域農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和草牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1-2]。對(duì)于農(nóng)田或草地生態(tài)系統(tǒng)來說，土壤微生物群落至關(guān)重要，土壤高鹽度會(huì)影響到土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及活性，嚴(yán)重制約土壤中氮素、磷素、鉀素的形態(tài)轉(zhuǎn)化，降低肥料利用率[3]。實(shí)施合理的改良措施會(huì)改變土壤pH和含鹽量，影響土壤微生物活性和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化過程[4]，進(jìn)而提高農(nóng)作物或飼草產(chǎn)量和品質(zhì)。

長(zhǎng)期以來，添加外源改良物質(zhì)被用作提升鹽堿地土壤肥力和作物生產(chǎn)力的重要管理措施[5]。眾多研究結(jié)果[6-8]表明，生物質(zhì)炭、石膏在消減鹽堿障礙、提升土壤地力等方面有良好的效果。生物質(zhì)炭疏松多孔，陽離子交換量大，富含有機(jī)碳，施入土壤中能有效調(diào)節(jié)土壤結(jié)構(gòu)，促進(jìn)微生物的代謝[8]；石膏類物質(zhì)的主要成分為CaSO4·2H2O，其改良機(jī)制為增加土壤中Ca2+對(duì)土壤膠體上Na+的替換，提高土壤陽離子交換量和鹽基飽和度，減輕單鹽毒害，改善土壤鹽堿障礙[9]。在需要改良的鹽堿地投入外源改良劑并配施合理的肥料，不但可以刺激植物生長(zhǎng)，引起土壤生物學(xué)特性的差異，而且可為微生物提供底物[4]，豐富微生物群落，進(jìn)而影響土壤結(jié)構(gòu)和土壤肥力[10]。此外，種植毛葉苕子(ViciavillosaRoth)這類豆科綠肥，也能在生長(zhǎng)過程和還田過程中為土壤微生物提供能源與養(yǎng)分，引起土壤微生物的活性發(fā)生改變[11]等。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于改良劑和種植綠肥各自對(duì)于鹽堿地土壤理化性狀和微生物狀況的影響研究較多，但將二者同時(shí)運(yùn)用到鹽堿土土壤改良中的研究較少。生物質(zhì)碳、石膏類物質(zhì)等作為化學(xué)改良手段，操作簡(jiǎn)便、成本較低、改良效果最穩(wěn)定；綠肥作為生物改良方式，投入成本降低，并且對(duì)土壤中微生物的豐度具有更顯著的影響[12]。因此，本研究將化學(xué)改良和生物改良方式相結(jié)合，開展了不同改良措施對(duì)土壤養(yǎng)分和土壤微生物群落功能多樣性的影響研究。

本試驗(yàn)以山西省大同盆地山陰地區(qū)的中度鹽堿地為研究對(duì)象，在田間通過定位試驗(yàn)，采用三代PacBio測(cè)序平臺(tái)，探討不同綜合改良措施下農(nóng)田土壤細(xì)菌群落多樣性的差異狀況，并結(jié)合土壤養(yǎng)分狀況，優(yōu)選出最佳治理模式，為大同盆地中度鹽堿地的治理和合理利用提供參考意見。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)概況

試驗(yàn)地位于中國(guó)山西省朔州市山陰縣后所鄉(xiāng)后張堡村(39°25′28″ N，112°55′34″ E)，海拔920 m，該區(qū)域地處雁門關(guān)農(nóng)牧交錯(cuò)核心區(qū)，農(nóng)業(yè)區(qū)劃為中溫帶干旱區(qū)；年均降雨量為350～600 mm，降水季節(jié)性分布不均，多集中于夏、秋季；年蒸發(fā)量大于1 600 mm，強(qiáng)烈蒸發(fā)期亦在春季和秋季；年均氣溫7.0℃，無霜期130 d左右；土壤屬堿化潮土，質(zhì)地輕壤偏沙型，土壤中鈉吸附比值較高，鹽堿化程度較嚴(yán)重，經(jīng)測(cè)定，樣地0～60 cm耕層土壤中平均含鹽量為2.12 g·kg-1，土壤容重為1.48 g·cm-3，pH值為9.13，土壤有機(jī)質(zhì)含量為4.32 g·kg-1，堿化度為13.4%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)中青貯玉米(ZeamaysL.)品種為‘中玉88號(hào)’，綠肥選用毛葉苕子，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院提供。生物質(zhì)炭由江蘇溧陽生物質(zhì)炭制備有限公司提供(原材料為秸稈稻殼，炭化溫度600℃，炭化時(shí)間20 S)，經(jīng)測(cè)定其pH為9.48，有機(jī)質(zhì)含量為689.12 g·kg-1，全氮含量為6.32 g·kg-1，全磷含量為6.12 g·kg-1；石膏(CaSO4)由大同市第二發(fā)電廠提供。

試驗(yàn)于2018年—2020年進(jìn)行，為青貯玉米-綠肥輪作定位試驗(yàn)。試驗(yàn)以內(nèi)陸中度蘇打型鹽漬土(Z)為研究對(duì)象，設(shè)對(duì)照處理(CK，不施肥，單播青貯玉米)，并在此基礎(chǔ)上設(shè)置化肥+CaSO4+生物炭(L，單播青貯玉米),化肥+CaSO4+生物炭+綠肥(LC1，2行青貯玉米，2行綠肥),化肥+CaSO4+生物炭+綠肥(LC2，2行青貯玉米，3行綠肥),化肥+CaSO4+生物炭+綠肥(LC3，2行青貯玉米，4行綠肥)處理(表1)。其中：處理LC1，LC2，LC3為玉米和毛葉苕子間作，次年玉米種植帶和毛葉苕子種植帶進(jìn)行輪換。試驗(yàn)處理按照完全隨機(jī)的方式排列，小區(qū)面積為4.4 m×6 m，每個(gè)處理重復(fù)3次，共計(jì)15個(gè)小區(qū)。

表1 試驗(yàn)各處理的具體信息Table 1 Specific information processed by the experiment

試驗(yàn)期間，每年5月初進(jìn)行播種。各小區(qū)，化肥(尿素，N：46.4%)施用量為385 kg·hm-2，CaSO4的施用量為4 500 kg·hm-2，生物炭的施用量為10 000 kg·hm-2，在播種前將各改良劑和肥料混勻后施入0～30 cm土壤。玉米播種密度為45 kg·hm-2，毛葉苕子播種量60 kg·hm-2，條播。其中，玉米種植帶間的行距為50 cm，毛葉苕子種植帶間及玉米與毛葉苕子之間的行距為30 cm。其他管理措施與當(dāng)?shù)氐某Ｒ?guī)管理模式相同。

1.3 樣品采集與處理

于試驗(yàn)第3年(2020年)毛葉苕子盛花期采集土壤樣品和植株樣品。各小區(qū)按對(duì)角線采樣法，在各個(gè)樣地內(nèi)用土鉆采集0～30 cm土層土樣，每塊樣地內(nèi)每個(gè)采樣點(diǎn)均為10點(diǎn)混合樣，先混合，再采用四分法取1 kg，3次重復(fù)。取樣后，將新鮮土壤樣品分成兩部分，其中一部分快速撿出植物根系、殘?bào)w和碎石等雜物后，置于試管中在—80℃保存，用于細(xì)菌高通量測(cè)序分析，剩余部分自然陰干后測(cè)定常規(guī)土壤理化性質(zhì)。此外，每小區(qū)選取長(zhǎng)勢(shì)較為一致的3 m×3 m樣方，測(cè)定地上部所有生物量。

1.4 測(cè)定方法

1.4.2土壤微生物DNA提取和測(cè)序 使用MN NucleoSpin 96 Soil(MN，Germany)試劑盒進(jìn)行DNA的提取，按廠商說明從5組處理土壤樣品中提取土壤總DNA。將經(jīng)上機(jī)檢測(cè)后DNA質(zhì)量和濃度均合格的各樣品保存在-80℃條件下。在PacBio測(cè)序平臺(tái)上，以提取合格的土壤微生物DNA為模板，以細(xì)菌16S rRNA基因全長(zhǎng)序列為目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，16S rRNA基因序列引物為27F (5′-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3′)和反向1492R (5′-ASGGHTACCTTGTTASGACTT-3′)。擴(kuò)增體系為：KOD FX Neo Buf (2X) 25 μL，60 ng基因組DNA 3 μL，KOD FX Neo (TOYOBO)1 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各2.5 μL，2Mm dNTP 10 μL，加ddH2O補(bǔ)充至總體系50 μL。使用AxyPrep DNA Gel Extraction kit (Axygen，USA)提取擴(kuò)增產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。根據(jù)電泳結(jié)果，用Image J軟件進(jìn)行定量，定量后按照質(zhì)量比1∶1進(jìn)行混樣，并用0.8 X磁珠進(jìn)行回收純化。純化后用SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0試劑盒構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)并在PacBio RS II上進(jìn)行測(cè)序(北京百邁克生物公司測(cè)序)。

1.4.3測(cè)序數(shù)據(jù)處理 對(duì)原始下機(jī)subreads進(jìn)行校正得到CCS(Circular Consensus Sequencing)序列(SMRT Link，version 8.0),然后使用lima (v1.7.0)軟件，通過barcode序列識(shí)別不同樣品的CCS序列并去除嵌合體(UCHIME,version 8.1)，得到符合以下標(biāo)準(zhǔn)的高質(zhì)量的CCS序列：①最小通過率(minPasses)≥5；②最小預(yù)測(cè)精確度(minPredictedAccuracy)≥0.9；③序列長(zhǎng)度閾值為1 200 ～1 650 bp。在相似性97%的水平上對(duì)序列進(jìn)行聚類(USEARCH，version 10.0)，以測(cè)序所有序列數(shù)的0.005%作為閾值過濾OTU。

應(yīng)用QIIME(v1.7.0)平臺(tái)，對(duì)獲得的高質(zhì)量序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析?；贠TU分析結(jié)果，對(duì)各樣品在各個(gè)分類水平(門、綱、科、目、屬、種)上進(jìn)行分類學(xué)分析；利用Mothur v.1.30軟件和R語言工具進(jìn)行α多樣性分析(Ace、Chao1、Shannon、coverage)；利用軟件QIIME進(jìn)行β多樣性分析，包括主坐標(biāo)分析(Principal Coordinat Analysis，PCoA)、樣品層次聚類(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean，UPGMA)、熱圖(Heatmap)等。線性判別分析(Linear discriminant analysis effect size，LEfSe，http://huttenhower.sph.harvard.edu/lefse/)根據(jù)分類學(xué)組成對(duì)樣本按照不同的分組條件進(jìn)行線性判別分析(LDA)，找出對(duì)樣本劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的群落或物種。利用STAMP和R軟件進(jìn)行組間差異分析等。

1.4.4統(tǒng)計(jì)分析 利用Microsoft Excel 2009進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 22.0軟件用單因素方差分析不同處理之間的差異顯著性(P<0.05)；采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析，并使用R語言分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同改良措施對(duì)土壤養(yǎng)分的調(diào)控作用

表2 不同改良措施下土壤理化性質(zhì)和生物量情況Table 2 Physical and chemical properties of soil and biomass under different improvement measures

2.2 不同改良措施對(duì)土壤細(xì)菌序列及其多樣性指數(shù)的影響

本研究利用PacBio SMRT測(cè)序技術(shù)對(duì)所有土壤樣品的微生物菌群進(jìn)行了解析，測(cè)序結(jié)果顯示，在所有土壤樣品中，總共獲得206 906條序列讀數(shù)，平均每個(gè)樣本含有13 794條序列，序列平均長(zhǎng)度為1 454 bp，所有樣本中序列最少的9 739條，最多的含有14 989條，除去短的、重復(fù)、低質(zhì)量和嵌合體之外，保留了205 676個(gè)有效序列?；?7%的相似性，在所有樣品中獲得總共2 036個(gè)OTU，劃分為30個(gè)門，51個(gè)綱，103個(gè)目，151個(gè)科，284個(gè)屬。

本研究計(jì)算了5個(gè)不同處理下所有樣本的Chao1，Ace，Shannon指數(shù)(表3)，試驗(yàn)結(jié)果表明，所有處理的覆蓋指數(shù)均大于0.9900，這也說明測(cè)序能力能夠比較真實(shí)地反映土壤樣本的細(xì)菌群落特征。與CK處理相比，LC1處理中觀察到的OTU數(shù)量增加了11.70%(P<0.05)。LC1處理的Shannon多樣性指數(shù)最高(6.38)，與L處理間差異顯著(P<0.05)，與其他3個(gè)處理間差異不顯著。Ace指數(shù)亦以LC1處理的最高(1769.19)，與CK和L處理間差異顯著(P<0.05)。Chao1指數(shù)以LC1處理的最高(1735.32)，比CK和L處理高7.77%和9.66%。

表3 不同改良措施處理下土壤細(xì)菌測(cè)序及群落α多樣性指數(shù)Table 3 Bacterial sequencing and community α diversity index of soil treated with different improvement measures

2.3 不同改良措施對(duì)細(xì)菌群落組成的影響

在門水平上共得到30個(gè)類群，根據(jù)從所有樣品中獲得的序列，鑒定了前8個(gè)主要門，分別是變形菌門(Proteobacteria)，擬桿菌門(Bacteroidota)，芽單胞菌門(Gemmatimonadota)，放線菌門(Actinobacteriota)，酸桿菌門(Acidobacteriota)，浮霉菌門(Planctomycetota)，黏球菌門(Myxococcota)和疣微菌門(Verrucomicrobiota)，它們占細(xì)菌群落相對(duì)豐度的80.00%以上(圖1A)。在這些占優(yōu)勢(shì)的門中，變形菌門(Proteobacteria)的相對(duì)豐度占比最高，以LC2處理中相對(duì)豐度最高，為50.83%，CK處理中相對(duì)豐度最低，為41.25%；擬桿菌門(Bacteroidota)的相對(duì)豐富度占比次之，在LC1和LC3處理中相對(duì)豐度分別為10.92% 和10.64%，在LC2處理中相對(duì)豐度僅為6.94%；芽單胞菌門(Gemmatimonadota)在CK處理中相對(duì)豐度最高，為10.94%；放線菌門(Actinobacteriota)在L和LC1處理中相對(duì)豐度較高，分別為4.73%和4.63%，在CK處理中相對(duì)豐度占比最小，僅為3.41%。

為了更詳細(xì)地分析與不同改良措施下相關(guān)的細(xì)菌分類情況，本研究確定了屬級(jí)的細(xì)菌組成情況(圖1B)。在屬水平上共有284個(gè)類群被分類，其中，CK處理中，芽單胞菌屬(Gemmatimonas)和Longimicrobium是主要屬，相對(duì)豐度分別占處理序列的4.51%和4.17%；L處理中Longimicrobium和溶桿菌屬(Lysobacter)相對(duì)豐度較高，分別占序列的4.95%和3.62%；LC1處理中Longimicrobium和鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)相對(duì)豐度占比最大，分別為4.54%和3.88%；此外，溶桿菌屬(Lysobacter)在LC2和LC3處理中相對(duì)豐度均占比最大，分別為4.89%和4.16%。

在種的水平上共有344 個(gè)類群被分類，其中平均相對(duì)豐度大于1%的有5個(gè)類群(圖1C)，分別是Longimicrobium_terra，嗜酸溶桿菌(Lysobacter_rhizophius)，Vicinamibacter_silvestris，Gemmatimonas_sp和伯拉吉亞藤黃單胞菌(Luteimonas_pelagia)。種水平上未被分類的細(xì)菌種類占比較大，相對(duì)豐度平均為49.49%。

圖1 不同改良措施下細(xì)菌門(A),屬(B),種(C)的組成結(jié)構(gòu)Fig.1 Relative abundance of bacteria (A) at the phylum level and bacteria (B) at the genus level and species level (C) in the different treatment samples

2.4 不同改良措施下細(xì)菌群落差異分析

根據(jù)系統(tǒng)類型和系統(tǒng)發(fā)育狀況，比較了各處理所有土壤樣品中的細(xì)菌組成(圖2)?？紤]到系統(tǒng)型差異的UPGMA，并結(jié)合每個(gè)樣本的97%的序列同一性，發(fā)現(xiàn)L處理和LC1處理間支長(zhǎng)較近，說明這2個(gè)樣品中物種的組成最為相似；而CK與L，LC1處理間支長(zhǎng)較遠(yuǎn)，說明CK與L，LC1處理樣品中的物種組成上存在明顯差異(圖2A)。為了與UPGMA結(jié)果進(jìn)行比較，采用主坐標(biāo)分析(PCoA)測(cè)定了每組土壤樣品中細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育距離，得到了相似的微生物簇(圖2B)。其中，第一和第二主坐標(biāo)(PC)表明，物種累積百分比方差分別占22.39%和19.34%，累計(jì)41.73%物種差異可用這兩個(gè)軸來解釋。從PCoA分析結(jié)果可以看出，不同的改良措施下形成了不同的細(xì)菌群落，而且CK與L，LC1，LC3處理間存在明顯差異。

為了進(jìn)一步確定與不同改良措施相關(guān)的特定細(xì)菌分類群，根據(jù)分類學(xué)組成對(duì)各處理(CK，L，LC1，LC2，LC3處理中的細(xì)菌群落)樣本按照不同的分組條件進(jìn)行線性判別分析。進(jìn)化圖(圖3)中不同分類級(jí)別的每個(gè)圓圈表示該級(jí)別的分類，黃色表示豐度沒有顯著變化，圓形直徑的大小表示相對(duì)豐度。根據(jù)設(shè)定的篩選標(biāo)準(zhǔn)(LDA score > 4)，發(fā)現(xiàn)17個(gè)細(xì)菌進(jìn)化支在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異(P<0.05，圖3)。根據(jù)LEfSe的LDA的分析結(jié)果顯示(圖3)，與其他處理相比，L處理中LEfSe檢測(cè)到更多的細(xì)菌分類群(6個(gè)進(jìn)化支，1個(gè)門，2個(gè)目，1個(gè)科，1個(gè)屬和1個(gè)種)，即髕骨細(xì)菌門(Patescibacteria)、噬纖維菌目(Cytophagales)、黃色單胞菌目(Xanthomonadales)、黃色單胞菌科(Xanthomonadaceae)、藤黃單胞菌屬(Luteimonas)、伯拉吉亞藤黃單胞菌(Luteimonaspelagia)。在LC1處理中鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)、鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae)的相對(duì)豐度顯著高于其他處理；LC2處理中的根瘤菌目(Rhizobialea)相對(duì)豐度顯著高于其他處理；LC3處理中富集了目水平的幾丁質(zhì)噬菌體目(Chitinophaglaes)和伯克氏菌目(Burkholderiales)，科水平的叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)，屬水平的Flavisolibacter等；相比之下，在CK中則富集了較多數(shù)量的芽胞菌目(Gemmatimonadales)菌群(圖3)。

2.5 不同改良措施的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境因子的關(guān)系

在屬水平上，采用微生物相對(duì)豐度的熱圖進(jìn)一步直觀地來表達(dá)樣品中群落結(jié)構(gòu)狀況(圖4)。在熱圖中，紅色和藍(lán)色分別代表較高和較低的相對(duì)豐度，可將5個(gè)處理下的樣品劃分為3組，第一組包括L和LC1，第二組僅有LC2，第三組包括CK，LC3，這與圖2A分析結(jié)果較為一致。在不同改良措施下，對(duì)于L處理的樣品，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類包括Longimicrobium，藤黃單胞菌屬(Luteimonas)；LC1樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類為Flavisolibacter，鞘脂單胞菌屬(Sphingomomas)；LC2樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類為硝化螺旋菌屬(Nitrospira)，假單胞菌屬(Pseudomonas)，溶桿菌屬(Lysobacter)；LC3樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類為Tepidisphaera，溶桿菌屬(Lysobacter)，艾德昂菌屬(Ideonella)；CK樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類則為芽單胞菌屬(Gemmatimonas)。從以上不同處理的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類可以看出，不同的改良措施使得土壤微環(huán)境發(fā)生了不同程度的改變，這些環(huán)境因素的變化對(duì)群落中不同微生物群的貢獻(xiàn)各不相同。

圖2 不同改良措施下土壤細(xì)菌群落的UPGMA圖(A)和PLS-DA圖(B)Fig.2 Unweighted pair-group method with arithmetic means analysis and PLS-DA diagram of soil bacterial community with different treatment

圖3 不同改良措施下土壤細(xì)菌群落系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The cladogram of soil bacterial community under different treatments

圖4 各處理在屬水平上的細(xì)菌群落熱圖分析Fig.4 Bacterial community heatmap analysis at genus-level phylotype with different treatment

圖5 屬水平上不同改良措施處理的土壤細(xì)菌的相對(duì)豐度和土壤環(huán)境因子間的RDA分析Fig.5 Canonical correspondence analysis (RDA) based on the relative abundance of bacterial at genus level and environmental factors among different treatments注：TN，全氮；TP，全磷；Na+，鈉離子；Ca2+，鈣離子；Cl-，氯離子；碳酸氫根離子Note:TN indicate total nitrogen;TP indicate total indiacte salt-based ions

3 討論

在土壤中，微生物群落的生物多樣性和豐富性對(duì)于土壤生態(tài)系統(tǒng)的功能性和可持續(xù)性至關(guān)重要[4，16]。許多研究已經(jīng)證實(shí)，任何農(nóng)業(yè)改良措施都會(huì)不同程度地促使土壤微生物群落的多樣性和豐富度發(fā)生改變[22-23]。在本研究中發(fā)現(xiàn)實(shí)施不同改良措施后，與CK相比，各處理的豐富度指數(shù)(Ace)有明顯增加(表3)，而細(xì)菌群落多樣性(Shannon指數(shù))在不同處理之間沒有顯著變化，這與前人的研究結(jié)果類似[24-25]。這可能是由于施用改良劑或種植豆科植物后對(duì)土壤理化性質(zhì)和微生物群落產(chǎn)生了明顯的影響，試驗(yàn)中，所用生物質(zhì)炭主要是秸稈焚燒的產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)能增加土壤孔隙度，促進(jìn)鹽分淋洗；石膏的主要成分是CaSO4，通常呈酸性，施用于土壤后pH值趨于中性，并且石膏和生物質(zhì)炭含有的大量的Ca2+和Mg2+置換土壤膠體上的Na+，促進(jìn)土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)的形成[22]；而種植的毛葉苕子是優(yōu)良的豆科牧草，其根部會(huì)富集更多的具有固氮功能的細(xì)菌，例如在LC1和LC3處理中富集了Flavisolibacter，LC2處理中富集了根瘤菌目(Rhizobialea)等。因此，改良劑或種植豆科植物在土壤中的施用能顯著改變微生物種群，進(jìn)而影響微生物群落的一系列活動(dòng)。

不同措施的農(nóng)業(yè)擾動(dòng)，不但在一定程度上改變細(xì)菌豐富度及多樣性，而且還可能會(huì)促使土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和成分發(fā)生變化。對(duì)于鹽堿土來說，鹽度和堿度會(huì)是影響其土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)的顯著因素，在鹽堿土壤中可能會(huì)分布著大量的喜鹽堿細(xì)菌，變形菌門中的變形菌綱是鹽堿土壤的主要類群[26-27]，其余優(yōu)勢(shì)菌群會(huì)有擬桿菌門、芽單胞菌門、放線菌門、酸桿菌門、浮霉菌門、疣微菌門等這些嗜鹽菌[28-29]，這些類群在本研究中均有發(fā)現(xiàn)，且屬于前10位的優(yōu)勢(shì)菌門。在本研究中變形菌門(Proteobacteria)是細(xì)菌門中占比最大的一類門，其門中包括了固氮(例如根瘤菌目Rhizobialea)和各類代謝物(例如黃色單胞菌屬Luteimonas)的細(xì)菌，而擬桿菌門具有溶磷作用，與磷素的轉(zhuǎn)化利用密切相關(guān)[4]，有研究表明[4]變形菌門、擬桿菌門相對(duì)豐度在富營(yíng)養(yǎng)水平下表現(xiàn)為增加，本研究中除LC2處理中擬桿菌門的相對(duì)豐度低于對(duì)照(CK)外，其余各處理的相對(duì)豐度豐度均高于對(duì)照(CK)，與前人研究結(jié)論部分相似。芽單胞菌門(Gemmatimonadota)在實(shí)施改良措施的各處理中相對(duì)豐度均明顯下降，這與王丹[30]、王超[31]研究結(jié)果一致。而放線菌門(Actinobacteriota)則在有機(jī)物分解和抵抗病原微生物侵害的過程中起著關(guān)鍵作用[4]，各處理中的相對(duì)豐度均明顯高于對(duì)照。此外，本研究中酸桿菌門,(Acidobacteriota),浮霉菌門(Planctomycetota),黏球菌門(Myxococcota)和疣微菌門(Verrucomicrobiota)的相對(duì)豐度均占比在1%以上，它們?cè)诒狙芯康耐寥郎鷳B(tài)系統(tǒng)中也起著重要作用，但具體作用有待進(jìn)一步研究。

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與功能會(huì)在改良措施實(shí)施程度和持續(xù)時(shí)間的共同作用下表現(xiàn)出不同的響應(yīng)策略。土壤改良和恢復(fù)是一個(gè)比較緩慢的過程，為了使改良劑、肥料、植物與土壤的融合過程達(dá)到最大效果，本研究進(jìn)行了為期3年的定位試驗(yàn)。通過3年改良，每個(gè)處理的土壤環(huán)境均發(fā)生了一定程度的改變，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能也會(huì)隨之發(fā)生一定變化。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，PCoA分析清楚地區(qū)分了不同改良措施下土壤細(xì)菌微生物群落之間的差異(圖2B)。在試驗(yàn)中，LC1，LC3處理中觀察到較豐富的Flavisolibacter(圖3)，與其他土壤微生物相比更能在根部有效的定殖、對(duì)有害微生物具有拮抗作用；LC2樣品中較豐富的Rhizobialea(目)，是與植物共生固氮的主要類群，假單胞菌屬(Pseudomonadaceae)具有迅速分解土壤中腐殖質(zhì)能力[32-33]；而科水平的黃色單胞菌(Luteimonas)在L處理富集，LEfSe的分析還表明在L處理下檢測(cè)到更多的分類群，生物菌群最為豐富，但這些微生物進(jìn)化枝與病原微生物密切相關(guān)，不利于土壤培肥。此外，在研究中出現(xiàn)的鞘脂桿菌科(Sphingomonas)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、叢毛單胞菌屬(Comamonasdaaceae)等優(yōu)勢(shì)菌則為具有脫氮除磷功能的反硝化菌和異養(yǎng)硝化細(xì)菌[34-35]。從各處理的優(yōu)勢(shì)菌群分布中可以看出，LC1，LC2，LC3等3個(gè)處理優(yōu)化了鹽堿地微生物的群落結(jié)構(gòu)，顯著提高土壤微生物群落功能多樣，有利于鹽堿地土壤的正向演替。此外，改良措施對(duì)土壤影響引起的環(huán)境因素變化對(duì)群落中不同微生物群的貢獻(xiàn)不同(圖5)，在本試驗(yàn)中，RDA揭示出TN，TP，SOM，Na+，Cl-含量對(duì)處理土壤中的細(xì)菌群落組成有著更為顯著的影響。

4 結(jié)論

本研究通過不同改良措施下鹽堿地土壤化學(xué)性質(zhì)及細(xì)菌群落進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)常規(guī)施肥下添加生物質(zhì)炭和CaSO4且以2∶2間作種植毛葉苕子和青貯玉米的處理(LC1)不僅降低了土壤電導(dǎo)率，增加了銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的含量，而且明顯提高了土壤細(xì)菌群落的Ace指數(shù)、地上生物量和變形菌門的相對(duì)豐度。常規(guī)施肥下添加生物質(zhì)炭和CaSO4及種植2行綠肥對(duì)鹽堿地土壤的改良效果最好，其優(yōu)勢(shì)菌群更有利于土壤培肥，且地上生物產(chǎn)量最高。然而，不同改良措施對(duì)土壤菌群及微環(huán)境的具體影響機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。